Διαφορά των γλυκοζιτών φαινυλαιθανόλης σε επιτραπέζια κιστάνα Herba από 2 κεντρικούς υπολογιστές BaDifference of phenylethanol glycosides in Table Cistanches Herba από 2 οικοδεσπότες που βασίζονται σε UPLC-QQQ-MS και PLS-DA που αναλύθηκαν σε ανάλυση UPLC-QQQ-MS και PLS-DA

Cistanche deserticolaείναι πολυετές ολοπαρασιτικό φυτό που ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae. Είναι το αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος που καλύπτεται με φύλλα που μοιάζουν με λέπιαCistanche deserticola YC Ma[1-2]. Αυτό το φυτό διανέμεται κυρίως στην Εσωτερική Μογγολία, το Xinjiang και το Gansu, όπου παρασιτείHaloxylon ammodendron (CA Mey.) Bunge, ένα ξηρόφυτο φυτό της ερήμου Chenopodiaceae [3-4]. Τα κύρια ενεργά συστατικά τουCistanche deserticolaπεριλαμβάνουν φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, ιριδοειδή και πολυσακχαρίτες [5-7], οι οποίοι παρουσιάζουν ιδιότητες όπως προστασία της αναπαραγωγικής λειτουργίας, αντιοξείδωση και προστασία του ήπατος [8-10]. Με περισσότερα από 2.000 χρόνια χρήσης στην Κίνα, κατέχει την πρώτη θέση στις συνταγές παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής που στοχεύουν στην ενίσχυση της ζωτικότητας και τη δεύτερη στις συνθέσεις κατά της γήρανσης [11]. Ωστόσο, λόγω της υπερσυλλογής και της καταστροφής του περιβάλλοντος, οι άγριοι πόροι τουCistanche deserticolaβρίσκονται στο χείλος της εξαφάνισης, οδηγώντας στην κατάταξή του ως εθνικά προστατευόμενο φυτό (Κατηγορία II) και στην ένταξή του στοΔιεθνής Κατάλογος Προστασίας Άγριων Φυτών[12]. Για την αντιμετώπιση της ανισορροπίας προσφοράς-ζήτησης στην αγορά φαρμάκων, η τεχνητή καλλιέργεια έχει καταστεί απαραίτητη για τη βιώσιμη ανάπτυξη τουCistanche deserticolaβιομηχανία.

 

 

 

Εκχύλισμα Cistanche deserticola προς πώληση

Επικοινωνήστε τώρα

 

 

 

Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν επιτυχή εμβολιασμό τουCistanche deserticolaεπίAtriplex canescens[13], αειθαλής θάμνος της οικογένειας Chenopodiaceae. Συνήθως αναφέρεται ως "βιολογικός αφαλατωτής",Atriplex canescensείναι ένα είδος δέντρου υψηλής ποιότητας για τη βελτίωση του αλατούχου-αλκαλικού εδάφους [14]. ΚαλλιεργώνταςCistanche deserticolaεπίAtriplex canescensπροσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως υψηλή απόδοση και ανώτερη ποιότητα. Ως αποτέλεσμα, η αξιολόγηση της ποιότητας τουAtriplex canescens-Cistanche deserticolaέχει γίνει ερευνητικό hotspot [15-16]. Προηγούμενες έρευνες είχαν επικεντρωθεί κυρίως στις φαρμακευτικές ιδιότητες των αποξηραμένωνCistanche deserticola, ενώ οι μελέτες για τα δραστικά συστατικά στη φρέσκια τους μορφή παραμένουν ελάχιστες. Ειδικότερα, μετά την συμπερίληψη τουCistanche deserticolaως τρόφιμο και φαρμακευτική ουσία στο πλαίσιο του συστήματος διαχείρισης δοκιμών (Ειδοποίηση αρ.. 9 της Εθνικής Επιτροπής Υγείας, 2023), η ανάπτυξη και η χρήση του ως φαρμακευτικό βότανο διπλής χρήσης έχουν κερδίσει σημαντική προσοχή στον τομέα της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής [17]. ΦρέσκοCistanche deserticolaευνοείται για την εξαιρετική γεύση και την ευκολία του, καθιστώντας το πολλά υποσχόμενο για ανάπτυξη. Τα νωπά φαρμακευτικά υλικά αναφέρονται σε μη επεξεργασμένες φρέσκες φυτικές, ζωικές ή μυκητιακές ουσίες με θεραπευτικές ή ευεργετικές ιδιότητες. Μεταξύ των 2.000 κοινώς χρησιμοποιούμενων κινεζικών φαρμακευτικών βοτάνων, οι 486 είναι φρέσκες ποικιλίες [18].

Η μέθοδος υπερ-απόδοσης υγρής χρωματογραφίας-τριπλή τετραπολική διαδοχική φασματομετρία μάζας (UPLC-QQQ-MS) είναι εξαιρετικά ευαίσθητη, καθιστώντας την κατάλληλη για την ανίχνευση χαμηλής συγκέντρωσης και πολύπλοκων συστατικών [19]. Για την αντιμετώπιση του ζητήματος της υψηλής περιεκτικότητας σε νερόCistanche deserticola, όπου οι γλυκοσίδες των φαινυλαιθανοειδών είναι επιρρεπείς σε ενζυματική υδρόλυση με αποτέλεσμα μειωμένη περιεκτικότητα, μια μέθοδος ξήρανσης με αδρανοποίηση ενζύμου διατηρεί αποτελεσματικά την περιεκτικότητα σε φαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδη [20]. Αυτή η μελέτη χρησιμοποιεί το UPLC-QQQ-MS για την αξιολόγηση 8 φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων, συμπεριλαμβανομένης της εχινακοσίδης και της ακτεοσίδης, ως βασικά ενεργά συστατικά στα φρέσκαCistanche deserticolaαπό δύο φυτά ξενιστές [21-22]. Η μελέτη εξετάζει τις διαφορές στο περιεχόμενο των συστατικών του χυμού και των υπολειμμάτων από φρέσκοCistanche deserticolaκαλλιεργείται σε δύο ξενιστές. Επιπλέον, το υπόλειμμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία αδρανοποίησης ενζύμου στους 80 βαθμούς για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από ξήρανση, για να συγκριθεί περαιτέρω η κατακράτηση των δραστικών συστατικών σεCistanche deserticola. Τα ευρήματα στοχεύουν στην παροχή επιστημονικών στοιχείων και τεχνικής υποστήριξης για την αξία του φρέσκου διπλού σκοπούCistanche deserticolaκαι τη βελτιστοποίηση των τεχνικών επεξεργασίας του.

1 Όργανα και υλικά

1.1 Όργανα

1290-6460 υπερ-απόδοσης υγρή χρωματογραφία-φασματόμετρο μάζας τριπλού τετραπολικού διπλού (Agilent Technologies, ΗΠΑ).

AL104 ηλεκτρονικός αναλυτικός ισοζύγιος (Mettler-Toledo, Ελβετία).

H-2050R φυγόκεντρος (Changsha Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd.).

Καθαριστικό υπερήχων SB25-12DTD (Ningbo Xinzhi Biological Technology Co., Ltd.).

1.2 Υλικά

ΟAtriplex canescens-Cistanche deserticolaκαιHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaδείγματα συλλέχθηκαν τον Μάρτιο, τον Απρίλιο και τον Μάιο του 2024 από τοCistanche deserticolaβάση καλλιέργειας στην πόλη Xiquan, κομητεία Jingtai, επαρχία Gansu. Τα δείγματα αναγνωρίστηκαν από τον καθηγητή Sun Xuegang από το Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Gansu ως τα σαρκώδη στελέχηCistanche deserticola YC Maμε λέπια φύλλα.

Πρότυπα αναφοράς:

Εχινακοσίδη (αριθμός παρτίδας: 23031605, καθαρότητα: 99,74%).

Ακτεοσίδη (αριθμός παρτίδας: 21102103, καθαρότητα: 98,83%).

Κιστανοζίτη Α (αριθμός παρτίδας: 23041703, καθαρότητα: 98,30%).

Ισοακτεοσίδη (αριθμός παρτίδας: 23052508, καθαρότητα: 99,90%).

2'-ακετυλακτεοζίτης (αριθμός παρτίδας: 210053102, καθαρότητα: 97,12%).

Salidroside (αριθμός παρτίδας: 22051208, καθαρότητα: 98,43%).

Cistanoside B (αριθμός παρτίδας: 20120903, καθαρότητα: 98,57%).

Tubuloside A (αριθμός παρτίδας: 21060302, καθαρότητα: 93,24%).

Όλα αγοράστηκαν από την Chengdu Pfeide Biotechnology Co., Ltd.

Αντιδραστήρια:

Μεθανόλη (αριθμός παρτίδας: O1140576, χρωματογραφικά καθαρή).

Ακετονιτρίλιο (αριθμός παρτίδας: S3641440, χρωματογραφικά καθαρό). Και τα δύο αγοράστηκαν από την Shanghai Anpu Experimental Technology Co., Ltd.

Το μυρμηκικό οξύ (αριθμός παρτίδας: 20230710, χρωματογραφικά καθαρό) αγοράστηκε από την Tianjin Kermio Chemical Reagent Co., Ltd.

Καθαρισμένο νερό (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.).

2 Μέθοδοι και Αποτελέσματα

2.1 Μέθοδοι

2.1.1 Προετοιμασία δείγματος

Τρεις παρτίδες απόAtriplex canescens-Cistanche deserticola(αριθμοί παρτίδας: 20240330-1, 20240420-1, 20240510-1) και τρεις παρτίδεςHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticola(αριθμοί παρτίδας: 20240330-2, 20240420-2, 20240510-2), συλλέχθηκαν συνολικά έξι παρτίδες, με πέντε φυτά ανά παρτίδα. Τα φυτά πλύθηκαν με νερό.

Επεξεργασία:

Τα δείγματα συνθλίβονται και χυμοί, με αποτέλεσμα χυμό και υπόλειμμα από τα δύο που προέρχονται από τον ξενιστήCistanche deserticola.

Τα υπολείμματα ξηράνθηκαν υπό δύο συνθήκες:

Χωρίς αδρανοποίηση ενζύμων.

Με αδρανοποίηση ενζύμου (5 λεπτά στους 80 βαθμούς σε φούρνο).

Τα αποξηραμένα υπολείμματα αποθηκεύτηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Κάθε παρτίδα φαρμακευτικού υλικού χωρίστηκε σε τέσσερις ομάδες, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.

 

Καρτέλα. 1 Δείγματα πληροφοριών ομαδοποίησης

Ομάδα	Τύπος	Atriplex canescens-Cistanche deserticola	Haloxylon ammodendron-Cistanche deserticola
①	Υπόλειμμα	C1	S1
②	Χυμός	C2	S2
③	Υπόλειμμα αδρανοποιημένο από ένζυμα (5 λεπτά στέγνωμα, θρυμματισμένο)	C3	S3
④	Μη αδρανοποιημένο από ένζυμα υπόλειμμα (αποξηραμένο και θρυμματισμένο)	C4	S4

 

2.1.2 Χρωματογραφικές συνθήκες

Στήλη: Στήλη Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 mm × 150 mm, 1,8 μm).

Ρυθμός ροής: 0,3 mL/min.

Όγκος ένεσης: 1 μL.

Θερμοκρασία στήλης: 35 μοίρες.

Κινητή φάση: 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό (Α) και ακετονιτρίλιο (Β).

Χρόνος ανάλυσης: 12 λεπτά.

Βαθμίδα έκλουσης:

0–1,5 λεπτά: 10% → 20% Β.

1,5–3 λεπτά: 20% → 30% Β.

3–5 λεπτά: 30% → 32% Β.

5–8 λεπτά: 32% → 38% Β.

8–9,6 λεπτά: 38% → 10% Β.

9,6–12 λεπτά: 10% Β.

Τα χρωματογραφήματα των μικτών προτύπων αναφοράς και των δειγμάτων δοκιμής φαίνονται στο σχήμα 1.(Επιβεβαιώστε εάν η κινητή φάση είναι 0,01% μυρμηκικό οξύ σε νερό (Α) και ακετονιτρίλιο (Β).)

Εικ. 1 Χρωματογραφήματα ουσιών αναφοράς(Α) και δείγμα(Β) 1−σαλιδροζίτη. 2−εχινακοσίδη; 3−cistanosideA; 4−tubulosideA; 5−ακτεοσίδη; 6-ισοακτεοζίτης; 7−2'-ακετυλολακτεοζίτης; 8-tubuloside B.

 

 

2.1.3 Συνθήκες Φασματομετρίας Μάζας

Τύπος πηγής ιόντων: Ιοντισμός ηλεκτροψεκασμού (ESI).

Τρόπος: Παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων (MRM) σε λειτουργία αρνητικών ιόντων.

Θερμοκρασία πηγής ιόντων: 350 μοίρες.

Πίεση νεφελοποιητή: 35 psi.

Αέριο σύγκρουσης: Άζωτο, ρυθμισμένο σε μεσαίο επίπεδο.

Οι παράμετροι φασματομετρίας μάζας για τα προς ανάλυση συστατικά φαίνονται στον Πίνακα 2.

---

2.1.4 Παρασκευή Μικτού Πρότυπου Διαλύματος

Ζυγίστε με ακρίβεια τις κατάλληλες ποσότητες των προτύπων αναφοράςεχινακοσίδη, ακτεοσίδη, σιστανοζίτη Α, ισοακτεοσίτης, 2'-ακετυλολακτεοζίτης, σαλιδροσίδη, κιστανοσίδη Β, καιτουμπουλοσίδη Ακαι τοποθετήστε τα σε κεχριμπαρένιες φιάλες αντιδραστηρίου των 10 mL. Προσθέστε 50% μεθανόλη για να παρασκευαστεί ένα μικτό πρότυπο διάλυμα με συγκέντρωση 0,2 mg·mL-1 και αποθηκεύστε το για μελλοντική χρήση.

---

2.1.5 Παρασκευή διαλυμάτων δοκιμής

Ζυγίστε με ακρίβεια 0,2 g φρέσκουAtriplex canescens-Cistanche deserticolaυπόλειμμα (C1), φρέσκοHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaυπόλειμμα (S1), αποξηραμένοAtriplex canescens-Cistanche deserticolaυπολείμματα (C3, C4) και ξηράνθηκανHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaυπολείμματα (S3, S4). Τοποθετήστε τα δείγματα σε κεχριμπαρένιες ογκομετρικές φιάλες των 10 mL, προσθέστε μεθανόλη 50%, φέρτε σε όγκο και καταγράψτε τη μάζα. Μουλιάστε για 0,5 ώρα, υποβάλετε σε υπερήχους για 40 λεπτά (250 W, 35 kHz), ψύξτε σε θερμοκρασία δωματίου και καταγράψτε ξανά τη μάζα. Χρησιμοποιήστε 50% μεθανόλη για να αντισταθμίσετε τυχόν απώλεια βάρους, ανακατέψτε καλά, φυγοκεντρήστε και αφήστε το διάλυμα να κατακαθίσει. Διηθείται το υπερκείμενο μέσω μικροπορώδους μεμβράνης 0,22 μm για να ληφθεί το διήθημα.

Για φρέσκοAtriplex canescens-Cistanche deserticolaχυμό (C2) και φρέσκοHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaχυμό (S2), πάρτε 10 mL από το καθένα, ζυγίστε με ακρίβεια, ανακατέψτε καλά, φυγοκεντρήστε και αφήστε το διάλυμα να κατακαθίσει. Διηθείται το υπερκείμενο μέσω μικροπορώδους μεμβράνης 0,22 μm για να ληφθεί το διήθημα.

---

2.1.6 Μελέτη Γραμμικότητας

Κατάλληλες ποσότητες του μικτού προτύπου διαλύματος που παρασκευάστηκε στην ενότητα 2.1.4 αραιώθηκαν για να δημιουργηθεί μια βαθμίδα συγκέντρωσης51,2, 128,0, 320,0, 800,0, 4,000,0 και 20,000,0 ug·L-1. Τα δείγματα εγχύθηκαν διαδοχικά από χαμηλές σε υψηλές συγκεντρώσεις ακολουθώντας τις συνθήκες που περιγράφονται στις ενότητες 2.1.2 και 2.1.3. Πραγματοποιήθηκε γραμμική παλινδρόμηση, χρησιμοποιώντας τη συγκέντρωση έγχυσης ως άξονα Χ και την περιοχή κορυφής ως άξονα Υ. Οι γραμμικές σχέσεις των οκτώ συνιστωσών φαίνονται στον Πίνακα 3.

 

Καρτέλα. 3 Αποτελέσματα εξέτασης γραμμικών σχέσεων 8 συστατικών στον πίνακα Cistanches Herba

 

Συστατικό	Εξίσωση παλινδρόμησης	r	Γραμμικό εύρος (ug·L-1)
Εχινακοσίδη	Y = 16.410 × X − 0.804	0.9996	51.2–20,000.0
Ακτεοσίδη	Y = 102.794 × X − 55.793	0.9998	51.2–20,000.0
Ισοακτεοσίδη	Y = 31.007 × X − 45.169	0.9999	51.2–20,000.0
2'-Ακετυλολακτεοζίτης	Y = 110.235 × X − 8.953	0.9992	51.2–20,000.0
Salidroside	Y = 19.678 × X − 0.557	0.9993	51.2–20,000.0
Tubuloside A	Y = 26.785 × X − 13.630	0.9997	51.2–20,000.0
Tubuloside B	Y = 71.810 × X − 0.993	0.9998	51.2–20,000.0
Κιστανοσίδη Α	Y = 0.578 × X + 1.531	0.9994	51.2–20,000.0

 

2.1.7 Δοκιμή ακριβείας

Το μεικτό πρότυπο διάλυμα που παρασκευάστηκε υπό τις συνθήκες του τμήματος 2.1.4 αραιώθηκε με 50% μεθανόλη και εγχύθηκε έξι διαδοχικές φορές υπό τις συνθήκες των παραγράφων 2.1.2 και 2.1.3. Οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις (RSD) των περιοχών αιχμής γιαεχινακοσίδη, ακτεοσίδη, ισοακτεοσίτης, 2'-ακετυλολακτεοζίτης, σαλιδροσίδη, κιστανοσίδη Β, τουμπουλοσίδη Α, καισιστανοζίτη Αήταν 0,95%, 1,47%, 0,56%, 1,05%, 0,93%, 1,08%, 1,19% και 0,91%, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια.

 

2.1.8 Δοκιμή σταθερότητας

Ένα μόνο δείγμα απόCistanche deserticolaΤο (S4) παρασκευάστηκε υπό τις συνθήκες που περιγράφονται στην ενότητα 2.1.5. Το διάλυμα δοκιμής εγχύθηκε και αναλύθηκε στις 0, 2, 4, 8, 12 και 24 ώρες υπό τις συνθήκες που περιγράφονται στις ενότητες 2.1.2 και 2.1.3. Τα RSD των περιοχών αιχμής γιαεχινακοσίδη, ακτεοσίδη, ισοακτεοσίτης, 2'-ακετυλολακτεοζίτης, σαλιδροσίδη, κιστανοσίδη Β, τουμπουλοσίδη Α, καισιστανοζίτη Αήταν 1,46%, 0,79%, 0,95%, 1,29%, 1,22%, 0,56%, 0,49% και 1,18%, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι το διάλυμα του δείγματος ήταν σταθερό εντός 24 ωρών.

 

2.1.9 Δοκιμή επαναληψιμότητας

Μια ενιαία παρτίδαCistanche deserticola(S4) δείγμα (αριθμός παρτίδας: 20240420-2) παρασκευάστηκε σε έξι παράλληλα διαλύματα δοκιμής υπό τις συνθήκες που περιγράφονται στην ενότητα 2.1.5. Τα δείγματα εγχύθηκαν και αναλύθηκαν υπό τις συνθήκες που περιγράφονται στις ενότητες 2.1.2 και 2.1.3. Τα RSD του περιεχομένου γιαεχινακοσίδη, ακτεοσίδη, ισοακτεοσίτης, 2'-ακετυλολακτεοζίτης, σαλιδροσίδη, κιστανοσίδη Β, τουμπουλοσίδη Α, καισιστανοζίτη Αήταν 1,26%, 0,98%, 1,55%, 1,06%, 1,33%, 0,99%, 1,65% και 0,95%, αντίστοιχα, επιδεικνύοντας καλή επαναληψιμότητα.

 

2.1.10 Δοκιμή ανάκτησης

Εννέα δείγματα από την ίδια παρτίδαCistanche deserticola(S4, αριθμός παρτίδας: 20240420-2) παρασκευάστηκαν, με 0,1 g ανά δείγμα. Τα δείγματα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες, με τρεις επαναλήψεις ανά ομάδα. Κάθε ομάδα είχε 80%, 100% και 120% του τυπικού περιεχομένου αναφοράς στοCistanche deserticolaδείγμα. Τα διαλύματα δοκιμής παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην ενότητα 2.1.5 και αναλύθηκαν υπό τις συνθήκες των ενοτήτων 2.1.2 και 2.1.3. Οι ανακτήσεις των οκτώ φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών υπολογίστηκαν και τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 4.

 

Καρτέλα. 4 Ποσοστά ανάκτησης 8 δοκιμασμένων εξαρτημάτων στο Cistanches Herba

 

Συστατικό	Περιεχόμενο δείγματος (mg)	Αιχμηρά (mg)	Μετρήθηκε (mg)	Μέση ανάκτηση (%)	RSD (%)
Εχινακοσίδη	0.513 8	0.410 1	0.911 2	99.85	1.37
Εχινακοσίδη	0.513 8	0.513 8	1.015 2	99.88	0.95
Εχινακοσίδη	0.513 8	0.616 5	1.129 4	99.85	1.06
Ακτεοσίδη	0.421 5	0.337 2	0.759 6	99.90	1.02
Ακτεοσίδη	0.421 5	0.421 5	0.843 5	99.87	1.18
Ακτεοσίδη	0.421 5	0.505 8	0.926 7	99.84	1.24
Ισοακτεοσίδη	0.327 1	0.261 7	0.588 6	99.85	0.86
Ισοακτεοσίδη	0.327 1	0.327 1	0.654 2	99.86	1.05
Ισοακτεοσίδη	0.327 1	0.392 5	0.719 1	99.84	1.13
2'-Ακετυλολακτεοζίτης	0.110 2	0.088 2	0.198 3	99.87	1.15
2'-Ακετυλολακτεοζίτης	0.110 2	0.110 2	0.220 1	99.86	1.09
2'-Ακετυλολακτεοζίτης	0.110 2	0.132 2	0.242 4	99.85	1.21
Salidroside	0.081 6	0.065 3	0.146 7	99.84	1.18
Salidroside	0.081 6	0.081 6	0.163 1	99.85	1.02
Salidroside	0.081 6	0.097 9	0.179 7	99.84	1.17
Tubuloside B	0.072 3	0.057 9	0.130 0	99.86	1.09
Tubuloside B	0.072 3	0.072 3	0.144 1	99.86	1.05
Tubuloside B	0.072 3	0.086 8	0.159 2	99.84	1.24
Tubuloside A	0.043 8	0.035 0	0.078 5	99.86	1.16
Tubuloside A	0.043 8	0.043 8	0.087 5	99.86	1.02
Tubuloside A	0.043 8	0.052 5	0.096 2	99.84	1.15