Το Danegaptide Αποτρέπει την Προκαλούμενη Βλάβη του TGF 1-σε επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου εγγύς σωληναρίου του νεφρού

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένη:ΧρόνιοςΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ) είναι ένα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας που σχετίζεται με μια σειρά από συννοσηρότητες. Πρόσφατα στοιχεία εμπλέκουν την αυξημένη απελευθέρωση τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) με τη μεσολάβηση ημιδιαύλου στην εξέλιξη της σωληναριδικής διάμεσης ίνωσης, της κύριας υποκείμενης παθολογίας της ΧΝΝ. Εδώ, αξιολογούμε την επίδραση του δανεγαπτιδίου στην παρεμπόδιση αλλαγών που προκαλούνται από ημικάναλο στην έκφραση και τη λειτουργία των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου στο σωληναριακό επιθηλιακόνεφρόκύτταρα. Πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα εγγύς σωληναρίου (hPTECs) υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ισόμορφη βήτα του προ-ινωτικού αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού κυτοκίνης (TGF 1) ± δανεγαπτίδιο. Η qRT-PCR και η ανοσοστύπωση επιβεβαίωσαν την έκφραση mRNA και πρωτεΐνης, ενώ μια συστοιχία αντισωμάτων κυτοκίνης αξιολόγησε την έκφραση/έκκριση προφλεγμονωδών και προφλεγμονωδών κυτοκινών. Η πρόσληψη χρωστικής καρβοξυφλλουορεσκεΐνης και η βιοαισθητήρα ATP μέτρησαν τη δραστηριότητα ημικαναλιού και την απελευθέρωση ATP, ενώ η ηλεκτρική αντίσταση του διεπιθηλίου χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της παρακυτταρικής διαπερατότητας. Το Danegaptide απέρριψε την πρόσληψη της χρωστικής καρβοξυφθοροσκεΐνης και την απελευθέρωση ATP και προστατεύει από τις πρωτεϊνικές αλλαγές που σχετίζονται με τραυματισμό των σωληνώσεων. Η παρεμπόδιση της απελευθέρωσης ATP με τη μεσολάβηση Cx43-παραλληλίστηκε με μερική αποκατάσταση της έκφρασης των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου, των προσφυτικών και των πρωτεϊνών σφιχτής σύνδεσης και μειωμένη παρακυτταρική διαπερατότητα. Επιπλέον, το δανεγαπτίδιο ανέστειλε τον TGF 1-προκάλεσε αλλαγές στην έκφραση και την έκκριση βασικών αδιποκινών, κυτοκινών, χημειοκινών, αυξητικών παραγόντων και ιντερλευκινών. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ως διαμορφωτής διασταύρωσης κενού και αποκλειστής ημικαναλιών, το δανεγαπτίδιο έχει δυνατότητες στη μελλοντική θεραπεία της ΧΝΝ.

Λέξεις-κλειδιά:δανεγαπτίδιο; κοννεξίνη; ημικανάλι? ATP; χρόνια νεφρική νόσος; φλεγμονή; ίνωση; hPTECs; TGF 1; νεφρός, νεφρός

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

Εισαγωγή

ΧρόνιοςΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ) είναι μια αυξανόμενη ανησυχία για την υγεία που σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρδιαγγειακών παθήσεων και νοσηρότητας [1]. Εκτιμάται ότι επηρεάζουν το 10 τοις εκατό του παγκόσμιου πληθυσμού [2], οι παράγοντες κινδύνου περιλαμβάνουν την ηλικία, τον διαβήτη, την υπέρταση, τη δυσλιπιδαιμία και την παχυσαρκία [3]. Η νόσος χαρακτηρίζεται από μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR), εκτός από πρωτεϊνουρία, με σπειραματοσκλήρωση, σωληναριακή ατροφία και σωληναρισιακή διάμεση ίνωση (TIF), που είναι κοινές ιστοπαθολογικές αλλαγές [4]. Με αποκορύφωμα την απώλεια σταθερότητας του επιθηλίου, την επίμονη φλεγμονή και την αυξημένη εναπόθεση της εξωκυτταρικής μήτρας [5,6], η θεραπεία της TIF και της προχωρημένης ΧΝΝ αντιπροσωπεύει μια ανικανοποίητη κλινική ανάγκη [3]. Κατά συνέπεια, απαιτούνται επείγουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η αλλαγμένη έκφραση και λειτουργία της κοννεξίνης (Cx) έχουν εμπλακεί στην παθολογία διαφόρων μορφών της νόσου (όπως εξετάζεται στο [7]), συμπεριλαμβανομένης της ΧΝΝ (όπως ανασκοπείται στο [8,9]). Οι κοννεξίνες είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών που συνδέονται με τη μεμβράνη που ολιγομερίζονται σε εξαμερικά συγκροτήματα που ονομάζονται συνδετικά [10]. Όταν τα γειτονικά κύτταρα ευθυγραμμίζονται, τα συνδετικά εξαρτήματα προσαρμόζονται για να σχηματίσουν κενούς συνδέσμους, συνεχείς πόρους μέσω των οποίων τα μόρια αγγελιαφόρων μπορούν να αντικατασταθούν, επιτρέποντας μια άμεση οδό επικοινωνίας [10]. Όταν δεν είναι δεσμευμένα, τα συνδετικά σχηματίζουν ημικανάλια μέσω των οποίων μόρια, π.χ. τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP), μπορούν να απελευθερωθούν στον τοπικό εξωκυτταρικό χώρο για να επηρεάσουν τα γειτονικά κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης των πουρινοϋποδοχέων [11]. Η έκφραση του πουρινεργικού υποδοχέα P2X7 (P2X7R) ρυθμίζεται προς τα πάνω στονεφρώνσωληνάρια ατόμων με διαβήτηΝεφρική Νόσος[12] και έχει εμπλακεί σε μεγάλο βαθμό στην εξέλιξη της ίνωσης τόσο στονεφρό[13-17] και σε άλλους τύπους ιστών [18-21]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η στόχευση πουρινεργικής σηματοδότησης έχει λάβει μεγάλη προσοχή. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, οι κλινικές δοκιμές έχουν αποτύχει να καταδείξουν τα ευεργετικά αποτελέσματα του ανταγωνισμού P2X7R σε πολυάριθμες φλεγμονώδεις καταστάσεις, μια επίδραση που ίσως σχετίζεται με γενετική παραλλαγή εντός του υποδοχέα [22]. Η στόχευση ανάντη της απελευθέρωσης ATP θα παρακάμπτει αυτά τα προβλήματα.

Τα στοιχεία συνδέουν την ανώμαλη έκφραση και/ή τη δραστηριότητα των δεσμών με διάφορες μορφές ΧΝΝ [12,23-26]. Αρχικές μελέτες από τους Abed et al. ανέφεραν ότι ετερογενή (Cx43 συν /-) ποντίκια, με μονόπλευρη απόφραξη ουρητήρα (UUO), εμφάνισαν μειωμένη εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) και μειωμένη φλεγμονή [27], ενώ το Cx43-ειδικό μιμητικό, GAP{{6} }, ήταν σε θέση να αναστείλει την προσκόλληση των μονοκυττάρων και αμβλύνει την έκφραση του κολλαγόνου Ι στο μοντέλο ποντικού διαγονιδίου ρενίνης (RenTG) της εξαρτώμενης από τη ρενίνη ΧΝΝ [25]. Πιο πρόσφατα, εντοπίσαμε ότι η κυρίαρχη ισόμορφη σύνδεσης που εκφράζεται στο εγγύς σωληνάριο, Cx43, είναι αυξημένη σε υλικό βιοψίας που απομονώθηκε από άτομα με διαβητική νεφροπάθεια, μια παρατήρηση που παραλληλίζεται με αυξημένη απελευθέρωση ATP με τη μεσολάβηση ημικαναλιού στην πρωτογενή θεραπεία με TGFp{11} εγγύς σωληναριακά κύτταρα [12]. Κατά την αξιολόγηση του αντίκτυπου των τοπικών αυξήσεων στις εξωκυτταρικές συγκεντρώσεις ATP, προσδιορίσαμε ότι η ανώμαλη επικοινωνία με τη μεσολάβηση Cx43- ξεκινά την αποσυναρμολόγηση των συμπλοκών σύνδεσης προσκολλημένων (π.χ. E-cadherin) και σφιχτών (π.χ. Zona Occludens) μέσω ενεργοποίησης του P2X7R. Αυτά τα αποτελέσματα, τα οποία αναιρήθηκαν σε ένα ετερογενές μοντέλο ποντικού Cx43 plus /- UUO [12], υποδηλώνουν μια σαφή σύνδεση μεταξύ Cx43 και σωληναριακής βλάβης. Ενώ η μερική κατάλυση του Cx43 επιβεβαιώνει το ρόλο των κοννεξινών στην έναρξη φαινοτυπικών αλλαγών της σωληναριακής βλάβης, η φαρμακολογική παρέμβαση με το πεπτίδιο αποκλεισμού ημικαναλιού Cx435 έδειξε ότι η προστατευτική φύση αυτής της μειωμένης δραστηριότητας Cx43 προέρχεται από την αναστολή της διαμεσολαβούμενης από ημικανάλι ΑΤΡ απελευθέρωσης. Η χρήση μιμητικών πεπτιδίων για να υπογραμμιστεί η προστατευτική φύση πίσω από τη δραστηριότητα αποκλεισμού του ημιδιαύλου έχει αναφερθεί με επιτυχία σε άλλα μοντέλα νόσου, όπως η αμφιβληστροειδοπάθεια [28], η νευροφλεγμονή [29], το γλοίωμα [30,31] και η ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας [32, 33]. Τελικά, οι μελέτες συνδέουν την αλλαγμένη δραστηριότητα της κοννεξίνης με αυξημένη φλεγμονή [34-36] και ίνωση [37-40] και προτείνουν ότι η σταθεροποίηση της επικοινωνίας με τη μεσολάβηση ημικαναλικών και/ή διασταυρώσεων κενού (GJIC) μπορεί να καθυστερήσει την εμφάνιση της βλάβης παρατηρείται σε διάφορα μοντέλα τραυματισμού. Κατά συνέπεια, η αναστολή των ημικαναλιών σύνδεσης παρέχει ένα ελκυστικό μέσο για τη μείωση της φλεγμονής και έχει σημαντικό θεραπευτικό ενδιαφέρον.

Το δανεγαπτίδιο ((2S, 4R)-1-(2-αμινοακυλ)-4-βενζαμιδοπυρρολιδίνη2-καρβοξυλικό οξύ), επίσης γνωστό ως ZP1609 ή GAP-134, είναι ένα μικρό διπεπτίδιο που προέρχεται από ροτιγαπτίδιο (ΑΑΡ10, ΖΡ123). Αρχικά αναπτύχθηκε ως αντιαρρυθμικός παράγοντας [41], αλληλεπιδρά με το Cx43 [42] και δρα ως ισχυρός τροποποιητής διασταύρωσης διακένου [43]. Η ένωση έχει επιδείξει προστατευτικές και αντιαρρυθμικές ιδιότητες και προηγουμένως έχει δείξει σημαντικές επιδράσεις σε καθιερωμένα προκλινικά μοντέλα τραυματισμών καρδιακής ισχαιμικής επαναιμάτωσης [44,45]. Ενώ οι κλινικές δοκιμές φάσης 2 σε ανθρώπους, δυστυχώς, απέτυχαν να επιτύχουν το τελικό τους σημείο [46], μελέτες από άλλες ομάδες έχουν διερευνήσει τη θεραπευτική δυνατότητα του δανεγαπτιδίου σε άλλους τύπους ιστών και μοντέλα ασθένειας [41,47-49]. Επιπλέον, ενώ λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του στη ρύθμιση της δραστηριότητας του ημικαναλιού, έχει αποδειχθεί ότι το δανεγαπτίδιο μειώνει την πρόσληψη χρωστικής που προκαλείται από ημικανάλι σε κύτταρα γλοιώματος C6 [43]. Παρόλα αυτά, ο ρόλος αυτής της ένωσης στην παρεμπόδιση της διαμεσολαβούμενης από ημικαναλική απελευθέρωση ATP σε άλλους τύπους ιστών παραμένει προς επιβεβαίωση.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Η τρέχουσα μελέτη διερεύνησε την αποτελεσματικότητα του δανεγαπτιδίου στην άρνηση της απελευθέρωσης ημικάναλου ATP με τη μεσολάβηση της κοννεξίνης σε πρωτεύοντα επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινων εγγύς σωληναρίων (hPTECs) που έλαβαν θεραπεία με TGF, πριν από την οριοθέτηση του προστατευτικού του ρόλου έναντι της έκφρασης και των λειτουργικών αλλαγών που συνήθως σχετίζονται με την εξέλιξη της σωληναριδικής ίνωσης. Χρησιμοποιώντας τεχνικές για τον προσδιορισμό των αλλαγών στην έκφραση (qRT-PCR, ανοσοκυτταροχημεία, ανοσοκηλίδωση, συστοιχίες αντισωμάτων) και στη λειτουργία (βιοαισθητήρα ATP, πρόσληψη χρωστικής, διεπιθηλιακή ηλεκτρική αντίσταση, συστοιχίες αντισωμάτων), τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι οι νανομοριακές συγκεντρώσεις του δανεγαπτιδίου μπλοκάρουν την Cx μεσολαβούμενη από ημικάναλο ATP απελευθερώνουν και μειώνουν εν μέρει τις αλλαγές που προκαλούνται από τον TGF 1- στην έκφραση των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου (π.χ. p16, p21, κυκλίνη D1) και των ρενοπροστατευτικών παραγόντων (π.χ. Klotho). Επιπλέον, το δανεγαπτίδιο μειώνει τις αλλαγές που παρατηρούνται συχνά στον σωληναριακό τραυματισμό, συμπεριλαμβανομένης της αποσυναρμολόγησης των συνδέσμων προσκολλήσεων (συμπεριλαμβανομένης της απώλειας E-cadherin) και των σφιχτών συνδέσεων (συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της αποφρακτικής ζώνης 1 (ZO-1) και του claudin 2). Είναι σημαντικό ότι η συστοιχία προφίλτρου πρωτεώματος έδειξε την ικανότητα του δανεγαπτιδίου να αποκαθιστά τις αλλαγές στην έκφραση και την έκκριση βασικών πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας, αδιποκινών, χημειοκινών και αυξητικών παραγόντων που προκαλούνται από τον TGF 1. Συνεπώς, τα in vitro δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το δανεγαπτίδιο (50-100 nM ) μπορεί να εμποδίσει επιτυχώς την διαμεσολαβούμενη από ημικαναλική απελευθέρωση ATP στα πρωτογενή hPTEC και να προστατεύσει εν μέρει από αλλαγές που σχετίζονται με φλεγμονή και ίνωση, όπως παρατηρείται στο τελευταίο στάδιο ΧΝΝ.

2. Αποτελέσματα

2.1. Το Danegaptide δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρωνΟ άνθρωποςνεφρό2 (HK2) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη (5 mM) για 48 ώρες, πριν από την λιμοκτονία ορού όλη τη νύχτα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη βέλτιστη συγκέντρωση TGF 1 (10 ng/mL) [12,24] ± δανεγαπτίδιο (50 nM–1 μΜ) για 48 ώρες (Εικόνα 1Α, n=3). Μια δοκιμασία 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT) επιβεβαίωσε ότι ούτε ο TGF 1 (101,9 ± 11,7 τοις εκατό ) ούτε το δανεγαπτίδιο μόνο άλλαξε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (95,2 ± 7 τοις εκατό (50 ηΜ), 103 ± 5,7 τοις εκατό (100 ηΜ) και 96,6 ± 5,3 τοις εκατό (1 μΜ)) σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Δεν παρατηρήθηκε αποτέλεσμα όταν τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TGF 1- επωάστηκαν ταυτόχρονα με δανεγαπτίδιο (104,1 ± 2,2 τοις εκατό (50 ηΜ), 93,4 ± 1,6 τοις εκατό (100 ηΜ) και 89,3 ± 3,7 τοις εκατό (1 μΜ)). Για να επιβεβαιωθούν αυτά τα δεδομένα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κρυσταλλικού ιώδους (CV) και γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH). Η απελευθέρωση LDH σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TGF 1- ήταν συγκρίσιμη με τους μάρτυρες (109,3 ± 11,3 τοις εκατό) και η συνεπώαση με δανεγαπτίδιο δεν είχε επιπλέον αποτέλεσμα (106,4 ± 11,6 τοις εκατό (50 nM), 113,9 ± 15,6 τοις εκατό (100 nM) και 113,2 ± 4,3 τοις εκατό (1 μΜ)). Όπως αναμενόταν, το δανεγαπτίδιο μόνο δεν άλλαξε σημαντικά την απελευθέρωση LDH σε σύγκριση με τους ελέγχους (104,4 ± 4,3 τοις εκατό (50 ηΜ), 95,3 ± 4,7 τοις εκατό (100 ηΜ) και 92,6 ± 3,3 τοις εκατό (1 μΜ)). Η χρώση κυττάρων με χρήση κρυσταλλικού ιώδους ανακεφαλαίωσε αυτά τα ευρήματα, με δεδομένα για TGF 1 (10 ng/mL, 96,9 ± 7,3 τοις εκατό ) και TGF 1 συν δανεγαπτίδιο (50 nM-1 μM) να είναι συγκρίσιμα με τους ελέγχους (98,2 ± 0,9 τοις εκατό) (5) , 97,5 ± 1,8 τοις εκατό (100 nM) και 85,8 ± 5,3 τοις εκατό (1 μΜ) Τέλος, το δανεγαπτίδιο μόνο δεν άλλαξε τη χρώση κρυσταλλικού βιολετί (98,3 ± 2,5 τοις εκατό (50 nM), 99,6 ± 2,7 τοις εκατό (10 nM) και ± 8,7 τοις εκατό (10 2,2 τοις εκατό (1 μΜ) των μαρτύρων) Υπό το φως αυτών των δεδομένων, επιλέχθηκε συγκέντρωση 50–100 nM για επόμενες μελέτες.

Σχήμα 1. Το δανεγαπτίδιο αποτρέπει τις αυξήσεις που προκαλούν 1-το TGF στην πρόσληψη βαφής με τη μεσολάβηση ημιδιαύλου. Στο πλαίσιο (Α), ο άνθρωποςνεφρό2 (HK2) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (50, 100 και 1000 nM) για 48 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν αξιολογηθεί. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM (n=3). Η επώαση με TGF 1 (10 ng/mL ± δανεγαπτίδιο (50-1000 nM)) δεν άλλαξε το 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,{{ 19}}πρόσληψη βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT), απελευθέρωση γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) ή χρώση κρυσταλλικού ιώδους (CV). Στα πλαίσια (Β) και (C), η πρόσληψη χρωστικής καρβοξυφθοροσκεΐνης χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της δραστηριότητας ημιδιαύλου σε κύτταρα HK2 και επιθηλιακά κύτταρα εγγύς ανθρώπινου σωληναρίου (hPTECs), με τον βαθμό φόρτισης της βαφής να είναι ευθέως ανάλογος με το άνοιγμα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (50 ή 100 ηΜ) για 48 ώρες. Το δανεγαπτίδιο εμπόδισε το TGF 1-προκάλεσε αυξήσεις στην πρόσληψη χρωστικής καρβοξυφλθορεσκεΐνης σε κύτταρα HK2 (πίνακας (Β)) και hPTECs (πλαίσιο (C)). Ελάχιστη φόρτωση βαφής σημειώθηκε στα κύτταρα ελέγχου, ενώ η φόρτωση βαφής αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGF 1. Η προσθήκη δανεγαπτιδίου (50 ή 100 ηΜ) μείωσε την πρόσληψη της χρωστικής, επιστρέφοντας την ένταση φθορισμού FL στα επίπεδα ελέγχου. Η ένταση εκφράζεται ως ποσοστό σε σύγκριση με μάρτυρες χαμηλής γλυκόζης και είναι αντιπροσωπευτική 3 ξεχωριστών πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM (n=3), με υποδεικνυόμενη βασική σημασία (** p < 0,01,="" ***="" p="">< 0,001,="" μονόδρομη="" anova="" και="" tukey's="">

2.2. Το δανεγαπτίδιο μπλοκάρει τον TGF 1-Προκάλεσε αλλαγές στην πρόσληψη χρωστικής που προκαλείται από ημικάναλο σε σωληναριακά επιθηλιακά κύτταραΈχουμε δείξει προηγουμένως ότι ο TGF 1 αυξάνει την προκαλούμενη από Cx43-ημικαναλική δραστηριότητα και την απελευθέρωση ATP από τα εγγύς επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων [24]. Μια δοκιμασία πρόσληψης χρωστικής καρβοξυφλθορεσκεΐνης χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν το δανεγαπτίδιο μπορεί να αναιρέσει την επαγόμενη από τον TGF 1- πρόσληψη χρωστικής μέσω ημικαναλιών σε κύτταρα HK2 και πρωτογενή hPTEC. Όπως αναμενόταν, ο TGF 1 (10 ng/mL) αύξησε την πρόσληψη χρωστικής στο 354,9 ± 32,6 τοις εκατό των μαρτύρων στα κύτταρα HK2, ενώ η συνεπώαση με δανεγαπτίδιο (50 nM και 100 nM) αμβλύνθηκε σημαντικά την απόκριση σε 165,5 ± 17,9 τοις εκατό και 147,6 ± 18,1 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β, p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, n=4). Το Danegaptide από μόνο του δεν άλλαξε την πρόσληψη της χρωστικής. Η πρόσληψη της χρωστικής καρβοξυφλθορεσκεΐνης αυξήθηκε κατά TGF 1 (10 ng/mL) σε πρωτογενή hPTEC (310,8 ± 38,6 τοις εκατό των μαρτύρων), μια απόκριση που εν μέρει αναιρείται από τη συνεπώαση του δανεγαπτιδίου (100 nM, 145 ± 19,7 τοις εκατό σε σύγκριση με μάρτυρες) (Εικόνα 1C, p Μικρότερο ή ίσο με 0,01, n=4).

2.3. Το Danegaptide Regates TGF 1-Προκαλούμενη από το ημικανάλι μεσολαβούμενη απελευθέρωση ATP σε κύτταρα HK2Για να προσδιοριστεί εάν το δανεγαπτίδιο (5{{10}}-100 nM) θα μπορούσε να αποτρέψει την επαγόμενη από τον TGF 1 (10 ng/mL) απελευθέρωση του ATP από ημικανάλια σε κύτταρα HK2, χρησιμοποιήσαμε βιοαισθητήρα ATP [24,50]. Το TGF 1 (10 ng/mL) αύξησε την απελευθέρωση ATP από 0.33 ± 0.11 μM σε 3,60 ± {{40} }.29 μΜ (Εικόνα 2Α, Β, Ε; p Μικρότερο ή ίσο με 0.001), ένα αποτέλεσμα που αναιρείται μερικώς από το δανεγαπτίδιο και στα δύο 50 nM (1,90 ± 0,26 μΜ· p Μικρότερο ή ίσο με 0,01 ) και 100 ηΜ (0,79 ± 0,19 μΜ· ρ Λιγότερο ή ίσο με 0,001) (Εικόνα 2D, Ε, η=3, έξι επαναλήψεις/αριθμός δείγματος). Το δανεγαπτίδιο μόνο δεν επηρέασε την απελευθέρωση ΑΤΡ (Εικόνα 2C, Ε), με επίπεδα ΑΤΡ να καταγράφονται στα 0,35 ± 0,10 μΜ (50 ηΜ) και 0,31 ± 0,09 μΜ (100 ηΜ) σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 2Ε).

2.4. Το Danegaptide αναστρέφει τον TGF 1-Προκαλούμενες αλλαγές στις πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου και έναν δείκτη προστασίας από Reno στα hPTECΓια να προσδιοριστεί εάν το δανεγαπτίδιο μπορεί να αναιρέσει τη ρύθμιση με τη μεσολάβηση ημιδιαύλων του κοινού κυτταρικού κύκλου και τους δείκτες προστασίας από νεφρικούς δείκτες, τα hPTEC επωάστηκαν με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (100 nM) για 12 ώρες και η έκφραση του υποψήφιου γονιδίου mRNA αξιολογήθηκε μέσω ανάλυσης qPCR. Η προσθήκη δανεγαπτιδίου σε hPTECs που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TGF 1-επέστρεψε την έκφραση της ρ16 από 358,8 ± 21,1 τοις εκατό σε 193 ± 18,5 τοις εκατό των μαρτύρων, την έκφραση του p21 από 221,8 ± 12,9 τοις εκατό σε 142,2 ± 2 ± 21,7 τοις εκατό σε 142,2 ± 21,7 τοις εκατό σε D. τοις εκατό σε 132,9 ± 15,0 τοις εκατό (Εικόνα 3, p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, n=3). Επιπλέον, το δανεγαπτίδιο ανέστρεψε εν μέρει την πτώση στο Klotho από 43,3 ± 3,8 τοις εκατό σε 59,9 ± 11,7 τοις εκατό των μαρτύρων (Εικόνα 3, n=3).

2.5. Το Danegaptide Επαναφέρει τον TGF 1-Μεσολαβημένες αλλαγές στις πρωτεΐνες συγκολλήσεως και σφιχτής σύνδεσης και την παρακυτταρική διαπερατότητα σε hPTECΣτονεφρόΗ μειωμένη κυτταρική προσκόλληση που προκαλείται από την Ε-καντερίνη (ECAD) ξεκινά μια σειρά συμβάντων που καταλήγουν σε έναν διαλείποντα φαινότυπο που σχετίζεται με μερικό μετασχηματισμό επιθηλίου σε μεσεγχυματικό. Η εκκίνηση διευκολύνει την αποσυναρμολόγηση τόσο των προσκολλημένων όσο και των συμπλεγμάτων σφιχτών συνδέσμων, με αποκορύφωμα την απώλεια πρόσφυσης, τη μειωμένη διακυτταρική επικοινωνία της διασταύρωσης κενού και το διαρρέον επιθήλιο [12,24,51]. Για να προσδιοριστεί εάν το δανεγαπτίδιο μπορεί να αναιρέσει τις αλλαγές που προκαλούνται από τον TGF 1-στην προσκόλληση και τις πρωτεΐνες σφιχτής σύνδεσης, τα hPTEC επωάστηκαν με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (10{{41 }} ηΜ) για 48 ώρες και αξιολογήθηκε η έκφραση των υποψήφιων πρωτεϊνών. Το Danegaptide αποκατέστησε μερικώς την έκφραση της Ε-καντερίνης από 33,3 ± 3,3 τοις εκατό σε 89 ± 7,6 τοις εκατό των μαρτύρων, την έκφραση της Ν-καντερίνης (NCAD) από 224,4 ± 29,6 σε 161,9 ± 27,4 τοις εκατό και την έκφραση της βιμεντίνης από 212,3 τοις εκατό (7,8 ± 1,9 τοις εκατό) Σχήμα 4Α, p μικρότερο ή ίσο με 0.001, p μικρότερο ή ίσο με 0,01 και p μικρότερο ή ίσο με 0,001, αντίστοιχα, n {{43} }). Η έκφραση της κατενίνης παρέμεινε αναλλοίωτη από τον αποκλειστή ημιδιαύλων από 149,2 ± 11,2 τοις εκατό (μόνο TGF 1) σε 151,6 ± 16,8 τοις εκατό (TGF 1 συν δανεγαπτίδιο, Εικόνα 4Β, p=NS, n=3). Η αξιολόγηση των επιδράσεων του δανεγαπτιδίου σε πρωτεΐνες σφιχτής σύνδεσης επιβεβαίωσε ότι ο διαμορφωτής διακλάδωσης αποκατέστησε εν μέρει την έκφραση της claudin-2 από 44,5 ± 5 τοις εκατό σε 74,6 ± 5 τοις εκατό των μαρτύρων και ZO{-1 από 27,8 ± 113. τοις εκατό σε 52,8 ± 5,4 τοις εκατό σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 4Β, p Μικρότερο ή ίσο με 0,05, n=3). Μελέτες που εξέτασαν τη διεπιθηλιακή ηλεκτρική αντίσταση επιβεβαίωσαν ότι η μειωμένη έκφραση των πρωτεϊνών σφιχτής σύνδεσης που παρατηρείται με το TGF 1 (10 ng/mL) παραλληλίζεται με απώλεια διαεπιθηλιακής αντίστασης από 57,33 ± 1.{83}} Ω·cm2 έως 10 ± 1,53 Ω· cm2 (p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, n=3). Αυτή η αυξημένη διαρροή διορθώθηκε μερικώς με ταυτόχρονη επώαση με δανεγαπτίδιο (36 ± 2,08 Ω·cm2) (Εικόνα 4C, p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, n=3).

2.6. Το Danegaptide Αποτρέπει τον TGF 1-Προκαλεί ανοδική ρύθμιση πρωτεϊνών εξωκυτταρικής ουσίας σε hPTECπου προκαλείται από μια ανισορροπία μεταξύ σχηματισμού και υποβάθμισης, η συσσώρευση της ECM είναι ένα κύριο χαρακτηριστικό της ΧΝΝ. Ο ρόλος του TGF 1 σε αυτή τη διαδικασία είναι καλά εδραιωμένος [52] και η κατανόηση του τρόπου άρνησης αυτών των αλλαγών έχει σαφείς επιπτώσεις στην εξέλιξη της νόσου. Για να εξεταστεί η επίδραση του δανεγαπτιδίου στις αλλαγές που προκάλεσε ο TGF 1- στην έκφραση των πρωτεϊνών ECM, τα hPTEC καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη (5 mM) για 48 ώρες, λιμοκτονούσαν στον ορό όλη τη νύχτα και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TGF 1 (1{{{{ 28}} ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (100 nM) για 48 ώρες. Σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ο TGF 1 αύξησε την έκφραση των πρωτεϊνών ECM κολλαγόνο Ι (334,6 ± 30,14 τοις εκατό), κολλαγόνο IV (354,5 ± 16,9 τοις εκατό), φιμπρονεκτίνη (301,7 ± 50,4 τοις εκατό) και λαμινίνη (324,4 ± 6,8 τοις εκατό) B, p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, n=3). Η ταυτόχρονη επώαση με το δανεγαπτίδιο εξασθένησε σημαντικά αυτές τις αλλαγές, αποκαθιστώντας την έκφραση σε 180,7 ± 27,3 τοις εκατό (κολλαγόνο Ι), 164 ± 6,9 τοις εκατό (κολλαγόνο IV), 161,3 ± 4 τοις εκατό (ινωδονεκτίνη) και 149 ± 20,4 ίντσες (lamins) από ή ίσο με 0,001, n=3 σε κάθε περίπτωση). Το δανεγαπτίδιο (100 nM) μείωσε επίσης τις αλλαγές που προκαλούνται από το TGF 1 (10 ng/mL) στη συνδεδεμένη με ιντεγκρίνη κινάση 1 (ILK1) από 378,9 ± 16,8 τοις εκατό σε 251,8 ± 33 τοις εκατό (p Λιγότερο ή ίσο με 0,001) αλλά είχε ελάχιστη επίδραση στη μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας 3 (MMP3), μειώνοντας την έκφραση από 185,3 ± 19,6 τοις εκατό με την κυτοκίνη μόνο σε 147,1 ± 12,2 τοις εκατό όταν επωάζεται ταυτόχρονα με δανεγαπτίδιο (Εικόνα 5Β)

2.7. Το Danegaptide Μειώνει τον TGF 1-Προκαλούμενες αλλαγές στην έκφραση των αδιποκινών, χημειοκινών, αυξητικών παραγόντων και ιντερλευκινών από hPTECs

Η φλεγμονώδης απόκριση μέσα και γύρω από τα εγγύς σωληνάρια περιλαμβάνει τόσο την ενεργοποίηση πολλαπλών τύπων κυττάρων όσο και την έκκριση πολυάριθμων φλεγμονωδών δεικτών. Συγκεκριμένα, οι διαλυτές χημειοκίνες, οι κυτοκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες προσλαμβάνουν και ενεργοποιούν διεισδυτικά ανοσοκύτταρα και διεγείρουν τους μόνιμους ινοβλάστες. Η παρατεταμένη ενεργοποίηση αυτών των κυττάρων προκαλεί σωληναρισιακή διάμεση ίνωση. Χρησιμοποιήσαμε τη συστοιχία προφίλτρου πρωτεώματος για να προσδιορίσουμε εάν το δανεγαπτίδιο αναιρεί τις αλλαγές που επάγονται από τον TGF 1- στην έκφραση και την έκκριση βασικών προφλεγμονωδών μεσολαβητών. Τα κύρια ξενοδοχεία καλλιεργήθηκαν, όπως περιγράφεται παραπάνω, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (100 ηΜ) για 48 ώρες. Ένας κατάλογος αλλαγών στο προϊόν λύσης (Εικόνα 6) και στο υπερκείμενο (Εικόνα 7) παρέχεται για 31 υποψήφιες πρωτεΐνες ομαδοποιημένες κατά κύρια λειτουργία.

3. Συζήτηση

Το 2017, η παγκόσμια επίπτωση της ΧΝΝ ήταν 697,5 εκατομμύρια περιπτώσεις, με την πάθηση να αναγνωρίζεται ως η 12η κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως [53]. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν θεραπευτικές επιλογές για το τελικό στάδιονεφρική νόσο(ESRD). Επιπλέον, με χαμηλά ποσοστά επιβίωσης από αιμοκάθαρση και παγκόσμια έλλειψηνεφρόδότες, υπάρχει επιτακτική ανάγκη να αναπτυχθούν θεραπείες που θα μπορούσαν να αποτρέψουν την εξέλιξη της ΧΝΝ και να βελτιώσουν την ποιότητα ζωής του ασθενούς. Στη ΧΝΝ, η σοβαρότητα της φλεγμονής στο εγγύς σωληνάριο υπαγορεύει πόσο γρήγορα ανεφρόθα αποτύχει. Συνεισφέροντας στην ενεργοποίηση πολλαπλών τύπων κυττάρων, φαίνεται, εν μέρει, να περιλαμβάνει επικοινωνία κυττάρου σε κύτταρο με τη μεσολάβηση συνδεσίνης [9]. Οι κοννεξίνες διευκολύνουν την άμεση και τοπική κυτταρική επικοινωνία μέσω παρακρινικής διαμεσολάβησης μέσω της ικανότητάς τους να ολιγομερίζονται σε εξαμερή συνδετικά. Όταν τα γειτονικά κελιά ευθυγραμμίζονται, τα συνδετικά εξαρτήματα προσαρμόζονται για να σχηματίσουν συνδέσεις κενού [10]. Αυτά τα συνεχή κανάλια παρέχουν μια άμεση διαδρομή για τη μεταφορά πληροφοριών, επιτρέποντας στα κύτταρα να κλειδώνουν σε μια συγκεκριμένη συχνότητα και να συγχρονίζουν τη δραστηριότητα. Σε αντίθεση με τις διασταυρώσεις κενού, οι οποίες συνήθως ανοίγουν υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα αποσυνδεδεμένα συνδετήρια, που ονομάζονται επίσης ημικανάλια, έχουν χαμηλή πιθανότητα ανοίγματος και ανοίγουν ως απόκριση σε τραυματισμό [10]. Η αλλοιωμένη δραστηριότητα του ημικαναλιού σχετίζεται με την παθοφυσιολογία καταστάσεων πολλαπλών ασθενειών, με στοιχεία που συνδέουν την αλλοιωμένη επικοινωνία κυττάρου με κύτταρο με αυξημένη γήρανση [54], φλεγμονή [34,55,56] και ίνωση [18-21]. Δεδομένα από το δικό μας εργαστήριο καταδεικνύουν ότι η κυρίαρχη ισόμορφη σύνδεσης στο εγγύς σωληνάριο (Cx43) ρυθμίζεται προς τα πάνω στην προχωρημένη ΧΝΝ και συσχετίζεται με αυξημένα επίπεδα TGF 1 και τη σοβαρότητα της ίνωσης και της φλεγμονής [24]. Επιπλέον, αυτή η αλλοιωμένη έκφραση μεταφράζεται σε απώλεια της διακυτταρικής επικοινωνίας της διασταύρωσης κενού, η οποία συνοδεύεται από αυξημένη απελευθέρωση ATP με τη μεσολάβηση ημικαναλιού και αλλαγές ενδεικτικές πρώιμης σωληναριακής βλάβης. Κατά συνέπεια, η παρεμπόδιση της απελευθέρωσης ημικαναλικού ATP με τη μεσολάβηση Cx μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν βιώσιμο στόχο για τη θεραπεία της βλάβης του τελευταίου σταδίου που αναπτύσσεται σε άτομα με ΧΝΝ.

Το Danegaptide είναι ένα μικρό θεραπευτικό πεπτίδιο που μέχρι πρόσφατα χρησιμοποιήθηκε ως προς την ιδιότητά του να αποκαθιστά τη σύζευξη διακλάδωσης σε πολλαπλά μοντέλα τραυματισμού, συμπεριλαμβανομένης της ισχαιμίας [43,44] και της αμφιβληστροειδοπάθειας [49]. Το Danegaptide έχει αποδειχθεί ότι εμποδίζει τη δραστηριότητα του ημιδιαύλου και την πρόσληψη της χρωστικής σε κύτταρα γλοιώματος C6 [43]. Ωστόσο, ο ρόλος της ένωσης στην παρεμπόδιση της διαμεσολαβούμενης από ημικαναλική απελευθέρωση ATP παραμένει να επιβεβαιωθεί και καμία μελέτη δεν έχει ακόμη αξιολογήσει τις επιδράσεις του δανεγαπτιδίου σε τραυματίεςνεφρόσωληνάρια. Στην τρέχουσα μελέτη, παρουσιάσαμε ακαταμάχητα στοιχεία ότι το δανεγαπτίδιο μπλοκάρει την επαγόμενη από τον TGF 1-διαμεσολαβούμενη από ημικάναλο απελευθέρωση ATP σε πρωτεύοντα επιθηλιακά κύτταρα εγγύς ανθρώπινου σωληναρίου. Επιπλέον, η ένωση αποκατέστησε τον TGF 1-προκάλεσε αλλαγές στην έκφραση και την έκκριση πρωτεϊνών που συνδέονται με φλεγμονή και ίνωση. Στη ΧΝΝ, η σωληναριακή διάμεση ίνωση αναπτύσσεται ως απόκριση σε διάφορες μορφολογικές και φαινοτυπικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της μετάβασης από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό (EMT), διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, ενεργοποίηση ινοβλαστών και αναδιαμόρφωση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) [57]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η κυτταρική γήρανση μπορεί να διαδραματίσει βασικό ρόλο στην εξέλιξη της χρόνιαςΝεφρική Νόσος[58], με τη γήρανση να συνδέεται με το EMT, ένα προφλεγμονώδες εκκρίτωμα και την εναπόθεση εξωκυτταρικής μήτρας [59-62]. Η γήρανση υποδηλώνει μη αναστρέψιμη διακοπή πολλαπλασιαστικής ανάπτυξης με σχετιζόμενες αλλαγές στην οργάνωση της χρωματίνης, τη γονιδιακή μεταγραφή και την έκκριση πρωτεΐνης [63,64]. Κατά συνέπεια, τα γηρασμένα κύτταρα είναι γνωστό ότι εμφανίζουν αυξημένη έκφραση αναστολέων κινάσης που εξαρτώνται από κυκλίνη (CDK), συμπεριλαμβανομένων των p21Cip1 (p21) και p16Ink4a (ρ16), και αλλοιωμένη έκφραση του reno-protective Klotho [65-68]. Στην τρέχουσα μελέτη, η έκφραση mRNA των αναστολέων CDK p16, p21 και κυκλίνης D1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα που είχαν υποστεί αγωγή με TGF, ενώ η νεροπροστατευτική πρωτεΐνη αντιγήρανσης Klotho έδειξε μειωμένη έκφραση σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση των ρ16, ρ21 και κυκλίνης D1 βελτιώθηκε όταν τα κύτταρα συνεπωάστηκαν με δανεγαπτίδιο. Η σημασία αυτής της παρατήρησης υποστηρίζεται από πολυάριθμες in vivo μελέτες [69,70], συμπεριλαμβανομένης της πρόσφατης εργασίας στο μοντέλο ποντικιού p16 INK4a double-knockout. Όταν προκλήθηκαν με UUO για να παρουσιάσουν προχωρημένη διάμεση φλεγμονή και ίνωση, αυτά τα ποντίκια εμφάνισαν μειωμένη απόπτωση, γήρανση, μειωμένα επίπεδα σηματοδότησης TGF 1/Smad και μείωση της διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων σε σύγκριση με ζώα άγριου τύπου [70]. Επιπλέον, τα εγγύς σωληνάρια που απομονώθηκαν από το μοντέλο UUO εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα p21, η καταστολή της οποίας παραλληλίζεται με μια μείωση των δεικτών που συνήθως σχετίζονται με το EMT [71,72]. Έχει ήδη καθιερωθεί μια άμεση σύνδεση με τη γήρανση των κυττάρων και την επαγωγή του EMT [73].

Η απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης που προκαλείται από την Ε-καντερίνη είναι ένας εκκινητής της EMT, με ταυτόχρονη αύξηση της N-cadherin (ο διακόπτης καντερίνης), που συνοδεύεται από αποσυναρμολόγηση της ένωσης προσκολλημένων και απόκτηση πρωτεϊνών που συνήθως σχετίζονται με έναν φαινότυπο ινοβλαστών, π.χ. , βιμεντίνη και ειδική για ινοβλάστες πρωτεΐνη [74]. Στονεφρό, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η σωληναριακή βλάβη προκαλεί έναν αριθμό μορφολογικών και φαινοτυπικών αλλαγών χαρακτηριστικών της μερικής, αν όχι πλήρους, EMT. Οι πρόσφατες μελέτες μας έδειξαν ότι η γλυκόζη προκάλεσε αλλαγές στον TGF 1 μεσολαβεί στην αποσυναρμολόγηση των προσφυτικών και του συμπλέγματος σφιχτής σύνδεσης ρυθμίζοντας τις αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης προσκόλλησης (ECAD, NCAD, -κατενίνη) και σφιχτής σύνδεσης (ZO-1). Επιπλέον, η in vitro χορήγηση μη υδρολυόμενης ATP μείωσε την έκφραση της Ε-καντερίνης σε εγγύςνεφρόκύτταρα, η απώλεια των οποίων ήταν παράλληλη με μείωση των δυνάμεων μεσοκυττάριας απολίνωσης, μειωμένα συμβάντα ρήξης πρόσδεσης και κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση [51]. Με τη μεσολάβηση του P2X7R, τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν στο ετερογενές μοντέλο Cx43 plus /- UUO [12]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, η αποτελεσματικότητα του δανεγαπτιδίου υπογραμμίζει έναν προστατευτικό ρόλο για την παρεμπόδιση της διαμεσολαβούμενης από ημικάναλο απελευθέρωσης ATP στην πρόληψη της αλλοιωμένης έκφρασης του βασικού επιθηλίου (ECAD, -κατενίνη, ZO-1, claudin 2) και του μεσεγχυματικού (NCAD, vimentin) πρωτεΐνες, οι επιπτώσεις των οποίων έχουν θεραπευτικό ενδιαφέρον.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Η ένωση προσκολλημένων συναρμολογείται όταν η κυτταροπλασματική ουρά της Ε-καντερίνης συνδέεται με την -κατενίνη, μεσολαβώντας την προσκόλληση στο κυτταροσκελετικό δίκτυο και διασφαλίζοντας ότι η πολικότητα και η αρχιτεκτονική των κυττάρων διατηρούνται [75]. Παρά τον ρόλο της στη διατήρηση της πολικότητας των κυττάρων, η αποσυναρμολόγηση αυτών των συνδέσεων επιτρέπει την απελευθέρωση -κατενίνης στο κυτταρόπλασμα, η οποία όταν ενεργοποιηθεί είτε από πρωτεΐνες Wnt είτε από άλλους ρυθμιστές ανάντη, π.χ. κινάση συνδεδεμένη με ιντεγκρίνη (ILK), μπορεί να μετατοπιστεί στον πυρήνα και ρυθμίζουν τα ειδικά για τα κύτταρα επιδράσεις. Η κινάση που συνδέεται με την ιντεγκρίνη είναι μια ενδοκυτταρική κινάση σερίνης/θρεονίνης-πρωτεΐνης που παίζει θεμελιώδη ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης, της επιβίωσης, του πολλαπλασιασμού και της εναπόθεσης εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) [76]. Είναι σημαντικό ότι η αναστολή της ILK εξασθενείνεφρώνίνωση σε πολλαπλά μοντέλα ΧΝΝ [77]. Στην τρέχουσα μελέτη, οι αυξήσεις που προκλήθηκαν από τον TGF 1- στην έκφραση της ILK1 αποκαταστάθηκαν, εν μέρει, όταν τα κύτταρα επωάστηκαν ταυτόχρονα με δανεγαπτίδιο, ένα αποτέλεσμα που παρομοιάζει με μείωση της έκφρασης -κατενίνης και πρωτεϊνών που σχετίζονται με ECM. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ το δανεγαπτίδιο απέτυχε να αλλάξει σημαντικά την 1-επαγόμενη από τον TGF αύξηση στην έκφραση της -κατενίνης, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η απουσία αλλαγής στην έκφραση δεν αντανακλά την απουσία της λειτουργίας του εντός του κυττάρου. Η κανονική οδός Wnt περιλαμβάνει την πυρηνική μετατόπιση της -κατενίνης και την ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων μέσω μιας ομάδας μεταγραφικών παραγόντων που ονομάζονται παράγοντες Τ-λεμφοκυττάρου/ενισχυτές λεμφοειδών (TCF/LEF) [78]. Κανονικά, η σηματοδότηση Wnt/ -κατενίνης είναι αθόρυβη, αλλά επανενεργοποιείται μετά από τραυματισμό σε διάφορα μοντέλα χρόνιαςΝεφρική Νόσος[79,80]. Επιπλέον, η ανώμαλη σηματοδότηση Wnt/-κατενίνης συνδέεται σε μεγάλο βαθμό με την έναρξη της γήρανσης, μια επίδραση που είναι παράλληλη με την απώλεια έκφρασης της Klotho, μιας πρωτεΐνης κατά της γήρανσης που δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της κανονικής οδού Wnt [81], και σε η τρέχουσα μελέτη ρυθμίστηκε προς τα κάτω σε κύτταρα που έλαβαν 1-TGF (Εικόνα 3). Συνεπώς, η παρατεταμένη ενεργοποίηση της σηματοδότησης Wnt/-κατενίνης συνδέεται με την εξέλιξη της ίνωσης και στις δύονεφρόκαι άλλους τύπους ιστών [79,82,83]. Μόλις μεταφερθεί στον πυρήνα, η -κατενίνη σχετίζεται με αυξημένη έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα SNAIL και της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας MMP7. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτά τα συμβάντα σχετίζονται με μεταγραφική καταστολή και αποβολή της μεμβράνης της εξωκυτταρικής περιοχής της Ε-καντερίνης, η τελευταία από τις οποίες παρατηρεί μια αύξηση στην κυτταροπλασματική δεξαμενή ελεύθερης -κατενίνης [84]. Κατά συνέπεια, η σηματοδότηση Wnt είναι ένας βασικός ενεργοποιητής του EMT σε συνθήκες τραυματισμού [85]. Επιπλέον, με στοιχεία ότι η σηματοδότηση Wnt/-κατενίνης προάγει την έκφραση πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων της ινονεκτίνης, του FSP1, του Snail1, του MMP7 και της κυκλίνης D1, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι η εξασθένηση αυτού του καταρράκτη σηματοδότησης σχετίζεται με βελτιωμένηνεφρική λειτουργία, μειωμένη EMT [86] και μειωμένη φλεγμονή [87] και ίνωση [80,88]. Συνεπώς, θα μπορούσε, εν μέρει, να εξηγεί την αυξημένη έκφραση και έκκριση πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας που προκαλείται από τον TGF 1- (Εικόνα 5), προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και χημειοκίνες που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Εικόνες 6 και 7). Η αυξημένη εναπόθεση ECM και η έκκριση προφλεγμονωδών μορίων είναι χαρακτηριστικά της σωληναριδικής διάμεσης ίνωσης, με διαφορετικούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένωννεφρώνσωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα που είναι γνωστό ότι εκκρίνουν μεγάλο αριθμό παραγόντων που συλλογικά ορίζονται ως ο εκκριτικός φαινότυπος που σχετίζεται με τη ΧΝΝ (CASP). Χαρακτηρίζεται από πολυάριθμα μόρια, συμπεριλαμβανομένων των ιντερλευκινών, των πρωτεϊνών της εξωκυτταρικής μήτρας και των χημειοκινών, αυτό το CASP έχει εντυπωσιακές ομοιότητες με τον εκκριτικό φαινότυπο που σχετίζεται με τη γήρανση (SASP), με συστατικά του CASP να έχουν συσχετιστεί ισχυρά με την παθολογία της σωληναριακής διάμεσης ίνωσης [89]. Όταν απελευθερώνονται, αυτοί οι προφλεγμονώδεις παράγοντες δρουν στα γειτονικά υγιή κύτταρα με παρακρινικό τρόπο, οδηγώντας έτσι την εξέλιξη της ίνωσης στη ΧΝΝ. Καθώς πολλοί παράγοντες που σχετίζονται με το CASP είναι γνωστό ότι προκαλούν ίνωση στονεφρό(π.χ., TGF , ιντερλευκίνη (IL)-1 και ιντερλευκίνη (IL)-6), η στόχευση προς τα πάνω αυτών των ενδιάμεσων σηματοδοτικών φλεγμονωδών προϊόντων μπορεί να αποδειχθεί μια αποτελεσματική εναλλακτική στρατηγική για τη θεραπεία της ΚΥΠ. Χρησιμοποιώντας μια διάταξη προφίλ πρωτεώματος, το υπερκείμενο κυτταρικό από κύτταρα που υπέστησαν επεξεργασία με TGF 1±δανεγαπτίδιο επωάστηκε σε μια κυτταρική μεμβράνη προαπορροφημένη με αντισώματα που αναπτύχθηκαν ενάντια σε βασικές φλεγμονώδεις πρωτεΐνες. Όπως τονίζεται στα Σχήματα 6 και 7, η συνεπώαση κυττάρων με TGF 1 και δανεγαπτίδιο αποκατέστησε την έκφραση και την έκκριση ενός αριθμού υποψήφιων πρωτεϊνών των οποίων ο ρόλος στηνΝεφρική Νόσοςείναι καλά τεκμηριωμένο είτε ως επιβλαβής (παράγοντας νέκρωσης όγκου-άλφα, ιντερλευκίνη 1-άλφα, ιντερφερόνη-γάμα) είτε ως προστατευτικός (αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων). Επιπλέον, στη ΧΝΝ, οι διαλυτές χημειοκίνες, τα μόρια προσκόλλησης και οι αυξητικοί παράγοντες προσλαμβάνουν και ενεργοποιούν διεισδυτικά ανοσοκύτταρα και μόνιμους ινοβλάστες για να μεσολαβήσουν στη φλεγμονή και την ίνωση στους τραυματίεςνεφρό. Τα δεδομένα συστοιχίας μας επιβεβαιώνουν ότι η ρύθμιση της Cx43 και η παρεμπόδιση της διαμεσολαβούμενης από ημικάναλο απελευθέρωσης ATP στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα αναιρεί, εν μέρει ή πλήρως, την έκκριση πολλών φλεγμονωδών μεσολαβητών, συμπεριλαμβανομένων των χημειοκινών, της χημειοελκυστικής πρωτεΐνης μονοκυττάρων (MCP1) και της Ρυθμιζόμενης κατά την Ενεργοποίηση, Φυσιολογική Τ. Εκφρασμένο και Εκκριτικό Κυττάρου (RANTES), που εμπλέκονται και τα δύο στη στρατολόγηση μονοκυττάρων. Αυξημένο τόσο σε ανθρώπινο όσο και σε πειραματικό επίπεδονεφρικές παθήσεις, η έκκριση MCP1 πυροδοτείται από την ιντερλευκίνη-1, τον παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα [90] και την ιντερφερόνη-γάμα [91], τα οποία προκλήθηκαν στο μοντέλο μας από το TGF 1, αλλά μπλοκαρίστηκαν όταν συνεφαρμόστηκαν με δανεγαπτίδιο. Επιπλέον, το δανεγαπτίδιο παρατηρήθηκε επίσης ότι εμποδίζει την επαγόμενη από τον TGF 1-έκκριση του μορίου διακυτταρικής προσκόλλησης των κυττάρων (ICAM1) [92], του παράγοντα διέγερσης αποικίας κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF) [93] και του πεπτιδίου που ενεργοποιεί τα επιθηλιακά ουδετερόφιλα (ENA78) [94]. Συλλογικά, αυτά έχουν συνδεθεί με την εξέλιξη της ΧΝΝ και με άλλες βασικές παθογόνες πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της διπεπτιδυλικής πεπτιδάσης 4 (DPPIV) [95] και του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [96], και έχουν αναγνωριστεί ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι. Παρά αυτές τις παρατηρήσεις, η ανάλυση συστοιχίας εντόπισε έναν αριθμό πρωτεϊνών στις 48 ώρες, όπου η ρύθμιση που προκάλεσε το TGF 1- φάνηκε να είναι ανεξάρτητη από την απελευθέρωση ATP με τη μεσολάβηση ημικαναλιού. Όπως αποδεικνύεται από την έκφραση του συνδέτη FLT3 στο κυτταρόλυμα, το δανεγαπτίδιο απέτυχε να μεταβάλει σημαντικά τις αλλαγές που προκαλούνται από τον TGF 1- στην έκφραση ολόκληρου του κυττάρου. Ο συνδέτης FLT3 αρχικά συντίθεται ως πρωτεΐνη δεσμευμένη στη μεμβράνη, η οποία πρέπει να διασπαστεί για να γίνει διαλυτός αυξητικός παράγοντας. Σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TGF 1-, παρατηρήθηκε αύξηση του δεσμευμένου στη μεμβράνη FLT3L σε σύγκριση με τους ελέγχους στο κυτταρόλυμα, μια απόκριση που δεν επηρεάστηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν ταυτόχρονα με δανεγαπτίδιο. Αν και λίγα είναι γνωστά για το ένζυμο που εμπλέκεται στην πρωτεολυτική διάσπαση και απελευθέρωση του FLT3L, μια μελέτη από τους Horiuchi et al. έδειξε ότι η αποβολή του FLT3L και η απελευθέρωση από τη μεμβράνη εξαρτώνται από τη μεταλλοπρωτεάση και ότι αυτή η επίδραση στους ινοβλάστες εξαρτάται από το ένζυμο μετατροπής TNF (TACE) [97]. Ενώ μπορούμε μόνο να υποθέσουμε, είναι πιθανό ότι η παρεμπόδιση της απελευθέρωσης ATP με τη μεσολάβηση Cx μπορεί να αμβλύνει τη δραστηριότητα μιας πρωτεΐνης(ών) που απαιτείται για την αποβολή της μεμβράνης FLT3 και, επομένως, απουσία απελευθέρωσης FLT3L, τα επίπεδα FLT3L στο υπερκείμενο είναι σημαντικά λιγότερα στα κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με TGF 1 συν δανεγαπτίδιο σε σύγκριση με τους ελέγχους που έχουν υποστεί αγωγή με TGF 1-. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ το δανεγαπτίδιο δεν φάνηκε να αναστρέφει την επαγόμενη από τον TGF 1-αύξηση στο κυτταρόλυμα FLT3L, είχε επίδραση στην εκκρινόμενη μορφή της πρωτεΐνης.

Ο διαλυτός υποδοχέας για τα τελικά προϊόντα προηγμένης γλυκαίωσης (RAGE) είναι ένας πιθανός βιοδείκτης φλεγμονής και οξειδωτικού στρες [98]. Λειτουργεί ως υποδοχέας δόλωμα που εμποδίζει τα τελικά προϊόντα προηγμένης γλυκοζυλίωσης να δεσμευτούν στο RAGE που συνδέεται με τη μεμβράνη και τις επιβλαβείς επιδράσεις που σχετίζονται με το RAGE. Στην τρέχουσα μελέτη, παρατηρήσαμε μια αύξηση 70 τοις εκατό στην έκκριση του sRAGE με τον TGF 1, ένα αποτέλεσμα που αποκαταστάθηκε στον έλεγχο από το δανεγαπτίδιο. Το sRAGE είναι λειτουργικό και ικανό να προκαλέσει αποτέλεσμα όταν εκκρίνεται. Η δυνατότητα του δανεγαπτιδίου να αναιρεί σημαντικά αυτή την έκκριση έχει σαφές θεραπευτικό ενδιαφέρον. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ότι δεν παρατηρήσαμε αύξηση στο προϊόν λύσης RAGE στις 48 ώρες με TGF 1 ± δανεγαπτίδιο. Ενώ αυτά τα πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί σε ανθρώπινα πρωτεύοντα εγγύς σωληνάρια κύτταρα, οι περιορισμοί του μοντέλου μας μπορεί να έχουν αποτελέσματα εξαρτώμενα από τα κύτταρα, το χρόνο και τη συγκέντρωση. Συνεπώς, ενώ απαιτείται καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης του δανεγαπτιδίου, τα ευρήματα αυτής της μελέτης παρέχουν σημαντικές αρχικές αποδείξεις για τα οφέλη από τη χρήση του δανεγαπτιδίου για την άρνηση των αλλαγών που προκαλούνται από τον TGF 1- στους δείκτες φλεγμονής και σωληναριακής βλάβης μέσω αποκλεισμού του απελευθέρωση ATP με τη μεσολάβηση ημικαναλιού. Παραδεχόμαστε ότι τα in vitro δεδομένα μας παρέχουν ένα μινιμαλιστικό μοντέλο των πολυπαραγοντικών γεγονότων που προκαλούν σωληνοειδή διάμεση ίνωση και συνιστούμε προσοχή στη μετάφραση αυτών των νέων ευρημάτων στην κατάσταση in vivo, ειδικά όπου μελέτες σε άλλα είδη και μοντέλα τραυματισμού έχουν δείξει μεταβλητές επιδράσεις [41,44,46-49]. Απαιτούνται τώρα περαιτέρω μελέτες για τον προσδιορισμό της επιλεκτικότητας αυτών των ημικαναλιών και της ικανότητας του φαρμάκου σε προκλινικά μοντέλα χρόνιας βλάβης, πριν από τη δοκιμή αποτελεσματικότητας σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Υλικά

Κλωνικός άνθρωποςνεφρό2 (HK2) επιθηλιακά κύτταρα και πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα εγγύς σωληνάριο (hPTECs) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Standards). Προμήθειες ιστοκαλλιέργειας αγοράστηκαν από την Invitrogen (Paisley, UK). Η μεμβράνη Immobilon-FL PVDF ήταν από την Millipore (Watford, UK) και το ρυθμιστικό αποκλεισμού Odyssey και τα δευτερεύοντα φθορίζοντα αντισώματα FL αγοράστηκαν από την LI-COR (Cambridge, UK). Τα αντισώματα για Ε-καντερίνη, Ν-καντερίνη, ILK1, MMP-3, -κατενίνη, βιμεντίνη και ΖΟ-1 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, UK), ενώ η claudin-2, Τα αντισώματα λαμινίνης, κολλαγόνου Ι και κολλαγόνου IV ελήφθησαν από την ABCAM (Cambridge, UK). Το αντίσωμα φιμπρονεκτίνης αγοράστηκε από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Ο ανασυνδυασμένος hTGF 1 ελήφθη από τη Sigma (Poole, UK), όπως και όλες οι άλλες γενικές χημικές ουσίες. Το Danegaptide παρασχέθηκε από τη Zealand Pharmaceuticals. Οι βιοαισθητήρες ATP ήταν από τη Sarissa Biomedical Ltd. (Coventry, UK) και τα πιάτα με αλεύρι από την WPI (Hertfordshire, UK). Τα φίλτρα Transwell αγοράστηκαν από την Corning (Nottinghamshire, UK). Το κιτ συστοιχίας ανθρώπινων κυτοκινών Proteome Profiler ήταν από την R&D Systems (Oxfordshire, UK).

4.2. Καλλιέργεια Ιστών

Πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα εγγύς σωληναρίου (hPTECs) διατηρήθηκαν σε ανεφρώνβασικό μέσο επιθηλιακών κυττάρων από το ATCC, συμπληρωμένο με 0.5 τοις εκατό ορό εμβρύου μόσχου (FCS wt/vol, τριιωδοθυρονίνη (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), ημιηλεκτρική υδροκορτιζόνη (100 ng/mL), rhΙνσουλίνη (5 μg/mL), επινεφρίνη (1 μΜ), τρανσφερρίνη (5 μg/mL) και L-αλανυλ-γλουταμίνη (2,4 mM), σε υγρή ατμόσφαιρα στους 37 ◦C με 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε όλη τη νύχτα λιμοκτονία ορού πριν από τη θεραπείανεφρό2 κύτταρα (HK2) (περίοδοι 18-30) αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Hams F12, συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FCS wt/vol, γλουταμίνη (2 mmol/L) και επιθηλιακό αυξητικό παράγοντα (EGF) 5 ng/mL), σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ◦C με 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα HK2 απαθανατίστηκαν με τη μεταγωγή των γονιδίων Ε6/Ε7 του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων 16 (HPV-16) και ήταν απαλλαγμένα από μυκόπλασμα. Σε όλα τα πειράματα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mmol/L) για 48 ώρες και στη συνέχεια λιμοκτονούσαν στον ορό όλη τη νύχτα πριν από τη θεραπεία.

4.3. Δοκιμασία MTT Η δοκιμασία 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT) πραγματοποιήθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, για την αξιολόγηση τις κυτταροτοξικές επιδράσεις του δανεγαπτιδίου στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [99]. Τα κύτταρα HK2 σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mM) για 48 ώρες, πριν από την ολονύκτια ασιτία στον ορό, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 48 ώρες με TGF 1 (10 ng/mL ) ± δανεγαπτίδιο (50-1000 nM). Η χρωματομετρική μέτρηση της παραγωγής φορμαζάνης αντιστοιχούσε στον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων.

4.4. Δοκιμασία γαλακτικής αφυδρογονάσηςΗ απελευθέρωση γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) στα μέσα ως αποτέλεσμα βλάβης της πλασματικής μεμβράνης χρησιμοποιείται συνήθως για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου ή της κυτταροτοξικότητας. Κύτταρα ΗΚ2 σπάρθηκαν σε τρυβλία 96- φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mM) για 48 ώρες πριν από την ολονύκτια ασιτία ορού. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν για 48 ώρες με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (50-1000 nM). Το κιτ ανάλυσης κυτταροτοξικότητας LDH II (Abcam) χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της LDH σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

4.5. Προσδιορισμός Crystal VioletΑυτή η απλή δοκιμασία χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της σχετικής πυκνότητας των προσκολλημένων κυττάρων σε δίσκους πολλαπλών φρεατίων. Το Crystal violet χρωματίζει το DNA και μπορεί να ποσοτικοποιηθεί χρωματομετρικά μετά τη διαλυτοποίηση. Τα κύτταρα HK2 σπάρθηκαν σε 12-πλάκες φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mM) για 48 ώρες, πριν από την ολονύκτια ασιτία ορού, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 48 ώρες με TGF 1 (1{{16 }} ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (50-1000 nM). Η ανάλυση έχει περιγραφεί προηγουμένως [99]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους 0,1 τοις εκατό. Μετά από αρκετές ακόμη πλύσεις, η χρώση διαλυτοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 1 τοις εκατό SDS και η απορρόφηση μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης πλακών.

4.6. Western BlottingΗ παρασκευή κυτοσολικής πρωτεΐνης από κύτταρα HK2 και hPTECs, ο διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόρηση γέλης SDS και η μεταφορά τους σε μεμβράνες Immobilon-FL PVDF έχουν περιγραφεί προηγουμένως [12]. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού Odyssey (LI-COR) και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας με αντισώματα έναντι της Ε-καντερίνης (1:1000), της Ν-καντερίνης (1:1000), της κλαουδίνης-2 (1:500), της ΖΟ -1 (1:1000), κολλαγόνο Ι (1:1000), κολλαγόνο IV (1:2000), φιμπρονεκτίνη (1:2000), λαμινίνη (1:500), ILK1 (1:500), -κατενίνη (1:2000), vimentin (1:500) και MMP3 (1:500). Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας OdysseyFC και ημι-ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, ΗΠΑ).

4.7. Διαεπιθηλιακή ΑντίστασηΤα κύτταρα HK2 σπάρθηκαν (6 × 104 κύτταρα/mL) σε φίλτρα Transwell (διάμετρος 12 mm, μέγεθος πόρων 0,4 μΜ· Corning, NY, ΗΠΑ) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mM) για 48 ώρες, ασιτία ορού όλη τη νύχτα και στη συνέχεια διεγέρθηκε με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (100 nM) για 48 ώρες. Η διεπιθηλιακή ηλεκτρική αντίσταση (TER) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευή EVOM (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Από κάθε ένδειξη αντίστασης αφαιρέθηκε μια τυφλή αντίσταση που μετρήθηκε από ένα φρεάτιο με μόνο μέσο.

4.8. Μελέτες Πρόσληψης ΒαφήςΚύτταρα ΗΚ2 και hPTEC σπάρθηκαν σε φθοριούχους δίσκους (διάμετρος 22 mm) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mmol/L) για 48 ώρες. Μετά από ολονύκτια ασιτία ορού, τα κύτταρα επωάστηκαν με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (50–100 nM) για 48 ώρες. Για τα επόμενα βήματα, ένα ισορροπημένο διάλυμα άλατος (BSS, pH 7,0) που περιλαμβάνει NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHC03 (4,2 mM). Χρησιμοποιήθηκαν HEPES (10 mM) και γλυκόζη (5 mM). Για να προκληθεί πρόσληψη χρωστικής, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε BSS χωρίς Ca2 συν (μηδέν CaCl2 συν EGTA (1 mM)) συν καρβοξυφλθορεσκεΐνη (200 μΜ) για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από περίοδο 5 λεπτών σε BSS που περιέχει Ca2 συν (1,3 mM) συν καρβοξυφλθορεσκεΐνη (200 μΜ). Τα πιάτα στη συνέχεια πλύθηκαν με BSS που περιέχει Ca2 plus (12 mL). Οι εικόνες αποκτήθηκαν με μια κάμερα Cool Snap HQ CCD (Roper Scientific, Gottingen, Γερμανία) και το λογισμικό Metamorph (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, UK). Το ImageJ χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρόσληψης βαφής, όπου σχεδιάστηκε μια περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) γύρω από κάθε κελί (περίπου 10–15 κελιά/πιάτο) και μετρήθηκε η μέση ένταση εικονοστοιχείων. Μια τιμή φθορισμού υποβάθρου αφαιρέθηκε από κάθε ROI.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΡΥΣΗ

4.9. ATP BiosesensingΟι βιοαισθητήρες ATP (Sarissa Biomedical, Coventry, UK) χρησιμοποιήθηκαν σε μια ταυτόχρονη αμπερομετρική ρύθμιση διπλής καταγραφής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Ένας μηδενικός βιοαισθητήρας χρησιμοποιήθηκε για να ληφθούν υπόψη μη ειδικά ηλεκτρενεργά τεχνουργήματα και αφαιρέθηκε από το ίχνος ATP. Γλυκερόλη (2 mM) συμπεριλήφθηκε σε όλα τα διαλύματα εγγραφής για να καταστεί δυνατή η ανίχνευση ATP. Τα κύτταρα ΗΚ2 σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες (διάμετρος 10 mm) σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mmol/L) για 48 ώρες πριν από την ολονύκτια λιμοκτονία ορού. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (100 ηΜ) για 48 ώρες. Οι καλυπτρίδες μεταφέρθηκαν σε θάλαμο που περιείχε Ca2 plus που περιέχει BSS διαποτισμένο στα 6 mL/min (37◦C) και αφέθηκαν για 10 λεπτά για να εγκλιματιστούν. ΑΤΡ και μηδενικοί βιοαισθητήρες κάμψαν και χαμήλωσαν έτσι ώστε το ηλεκτρόδιο να βρίσκεται παράλληλα με την κυτταρική μονοστιβάδα. Μόλις εμφανιστεί μια σταθερή γραμμή βάσης, η αιμάτωση του χωρίς Ca2 συν BSS διέγειρε το άνοιγμα ημικαναλιού. Μετά την απελευθέρωση ΑΤΡ, χρησιμοποιήθηκε BSS που περιέχει Ca2 plus για το κλείσιμο των ημικαναλιών, ακολουθούμενο από ένα διάλυμα βαθμονόμησης ΑΤΡ (10 mM). Οι εγγραφές αποκτήθηκαν στα 4 Hz με διεπαφή Micro CED (Mark2) χρησιμοποιώντας λογισμικό Spike (v8.03).

4.10. Συστοιχία αντισωμάτων φλεγμονής,Μια συστοιχία αντισωμάτων φλεγμονής (RnD Systems) αξιολόγησε την επαγόμενη από τον TGF ρύθμιση 31 φλεγμονωδών δεικτών 1-. Η συστοιχία πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα hPTEC καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 χαμηλής γλυκόζης (5 mM) για 48 ώρες, πριν από την ολονύκτια λιμοκτονία στον ορό, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 48 ώρες με TGF 1 (10 ng/mL) ± δανεγαπτίδιο (100 nM). Τα κυτταρολύματα και το υπερκείμενο συλλέχθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα με προ-φραγμένες μεμβράνες που κηλιδώθηκαν εις διπλούν με αντισώματα σύλληψης. Ένα μίγμα φθορίζοντος στρεπταβιδίνης/βιοτινυλιωμένου κοκτέιλ 800 CW FL χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση συμπλεγμάτων πρωτεΐνης/αντισώματος έκφρασης χρησιμοποιώντας Odyssey FC και ημι-ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ImageStudio (v5.2, LI-COR).

4.11. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνοΤο RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μίνι κιτ RNeasy (QIAGEN) και μεταγράφηκε αντίστροφα (Invitrogen). Πραγματοποιήθηκε PCR πραγματικού χρόνου (SYBR GreenER, Invitrogen) χρησιμοποιώντας ένα όργανο StepOne Plus (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). Η έκφραση cDNA ελήφθη με σύγκριση με μια τυπική καμπύλη σειριακά αραιωμένου cDNA. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) και GAPDH (προς τα εμπρός: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, αντίστροφα: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). Η ανάλυση καμπύλης τήγματος επιβεβαίωσε την ειδικότητα του εκκινητή και ελέγχθηκε για πιθανή μόλυνση.

4.12. ΑνάλυσηΓια όλα τα πειράματα, ο έλεγχος χαμηλής γλυκόζης (5 mM) κανονικοποιήθηκε στο 100 τοις εκατό και όλες οι άλλες συνθήκες συγκρίθηκαν με τους αντίστοιχους ελέγχους. Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ANOVA μονής κατεύθυνσης με τη μετα-δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM, με το n να δηλώνει τον αριθμό του δείγματος. Μια τιμή p μικρότερη ή ίση με 0,05 σημαίνει στατιστική σημασία.