Ολοκληρωμένη ανάλυση των σκευασμάτων εκκρίματος από εμβρυϊκά και περιγεννητικά ανθρώπινα βλαστοκύτταρα αμνιακού υγρού Μέρος 1

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Αναφέραμε προηγουμένως ότι τα βλαστοκύτταρα που προέρχονται από το c-KIT και το αμνιακό υγρό htaman που λαμβάνονται από υπολείμματα δειγμάτων προγεννητικής διάγνωσης ρουτίνας Ⅱ τριμήνου (εμβρυϊκό hAFS) είναι προικισμένα με αναγεννητικό παρακρινικό δυναμικό που οδηγεί σε επιβίωση, αντι-ινωτικές και πολλαπλασιαστικές επιδράσεις. μπορεί επίσης να απομονωθεί από δείγματα κλινικών αποβλήτων ΙΙΙ τριμήνου κατά τη διάρκεια προγραμματισμένων καισαρικών τομών (περιγεννητική hAFS), προσφέροντας έτσι μια πιο εύκολα προσβάσιμη εναλλακτική λύση σε σύγκριση με την εμβρυϊκή hAFS. Παρόλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για το παρακρινικό προφίλ του περιγεννητικού hAFS. Εδώ παρέχουμε έναν λεπτομερή χαρακτηρισμό του ολικού εκκριτικού hAFS (δηλαδή, του συνόλου των διαλυτών παρακρινών παραγόντων που απελευθερώνονται από τα κύτταρα στο ρυθμισμένο μέσο, ​​hAFS-CM) και των εξωκυτταρικών κυστιδίων ( hAFS-EVs) εντός αυτού, από εμβρυϊκά κύτταρα Ⅱ τριμήνου έναντι περιγεννητικών κυττάρων ΙΙΙ τριμήνου. Τα εμβρυϊκά και περιγεννητικά hAFS χαρακτηρίστηκαν και υποβλήθηκαν σε υποξική προετοιμασία για την ενίσχυση του παρακρινικού τους δυναμικού. Τα σκευάσματα hAFS-CM και hAFS-EV αναλύθηκαν για περιεκτικότητα πρωτεΐνης και χημειοκίνης/κυτοκίνης και το φορτίο EV διερευνήθηκε περαιτέρω με προσδιορισμό αλληλουχίας RNA. Ο φαινότυπος του εμβρυϊκού και του περιγεννητικού hAFS, μαζί με τις αντίστοιχες συνθέσεις του εκκριτικού τους, επικαλύπτονταν. Ωστόσο, το εμβρυϊκό hAFS παρουσίασε ανώριμη οξειδωτική δράση φωσφορυλίωσης σε σύγκριση με τα περιγεννητικά. Το προφίλ του παρακρινούς φορτίου τους αποκάλυψε κάποιες διαφορές ανάλογα με το στάδιο της κύησης και την υποξική προετοιμασία. Και οι δύο κυτταρικές πηγές παρείχαν σκευάσματα εμπλουτισμένα με νευροτροφικούς, ανοσοτροποποιητικούς, αντι-ινωτικούς και ενδοθηλιακούς διεγερτικούς παράγοντες και το ανώριμο εμβρυϊκό έκκριμα hAFS ορίστηκε από ένα πιο έντονο προφίλ προ-αγγειογένεσης, αναγέννησης, προ-ανάλυσης και αντιγήρανσης. Το προφίλ μικρού RNA έδειξε εμπλουτισμό microRNA τόσο σε εμβρυϊκό όσο και σε περιγεννητικό φορτίο hAFS-EV, με έναν σταθερά εκφρασμένο πυρήνα προ-ανάλυσης ως μοριακή υπογραφή αναφοράς. Εδώ επιβεβαιώνουμε ότι το hAFS αντιπροσωπεύει μια ελκυστική πηγή αναγεννητικών παρακρινών παραγόντων. η επιλογή είτε εμβρυϊκών είτε περιγεννητικών σκευασμάτων εκκρίματος hAFS για μελλοντική παρακρινή θεραπεία θα πρέπει να αξιολογηθεί λαμβάνοντας υπόψη το συγκεκριμένο κλινικό σενάριο.

Λέξεις-κλειδιά:αμνιακό υγρό; βλαστοκύτταρα; παρακρινικές επιδράσεις? εξωκυτταρικά κυστίδια? κυτταρικό μέσο; χημειοκίνη; κυτοκίνες; πρωτεομική; Αλληλουχία RNA; microRNA

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

1. Εισαγωγή

Η αναγεννητική ιατρική αναπτύχθηκε πρόσφατα ως ένα αναδυόμενο πεδίο για την παροχή λειτουργικής αποκατάστασης τραυματισμένου ιστού μέσω πολλών στρατηγικών. Καθώς οι προσεγγίσεις της μηχανικής ιστών έχουν προχωρήσει σημαντικά τα τελευταία χρόνια, η διερεύνηση των παρακρινικών επιδράσεων των βλαστοκυττάρων έχει ενταθεί ολοένα και περισσότερο. Το θεραπευτικό δυναμικό των μεταμοσχευμένων βλαστοκυττάρων έχει αποδειχθεί ευρέως ότι μεσολαβείται κυρίως από τους εκκρινόμενους διαλυτούς παράγοντες τους, οι οποίοι μπορούν να ενορχηστρώσουν ένα προ-αναγεννητικό μικροπεριβάλλον στον ιστό ξενιστή ενώ ενεργοποιούν ενδογενείς μηχανισμούς λειτουργικής αποκατάστασης [1,2]. Ως εκ τούτου, τα βλαστοκύτταρα εκκρίνουν το σύνολο των παρακρινών τροφικών μορίων που απελευθερώνονται από κύτταρα, καθώς και εξωκυτταρικά κυστίδια που συνδέονται με τη μεμβράνη, έχουν προταθεί όλο και περισσότερο ως ένα καινοτόμο φαρμακευτικό προϊόν θεραπείας από πολλαπλές ανεξάρτητες προκλινικές μελέτες που στοχεύουν καρδιαγγειακά, νευρολογικά ή/και φλεγμονώδη νόσος. Αντίστοιχα, τα βλαστοκύτταρα μπορούν να οραματιστούν ως βιολογικά εργοστάσια για την εκμετάλλευση του θεραπευτικού εκκριτικού τους, προσφέροντας έτοιμες για χρήση και έτοιμα για χρήση αναγεννητικές θεραπείες. Με την εφαρμογή μιας τέτοιας στρατηγικής βασισμένης σε κύτταρα, αλλά χωρίς κύτταρα, πολλές περιοριστικές πτυχές που σχετίζονται με την κανονική κυτταρική θεραπεία μπορούν να ξεπεραστούν, ενώ εξακολουθούν να διασφαλίζονται ευεργετικά αποτελέσματα.τι είναι ένα cistancheΣε αυτή την προοπτική, τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSC) έχουν δοκιμαστεί εκτενώς ως υποτιθέμενα υποψήφια κύτταρα; Πράγματι, τα MSC και τα βλαστοκύτταρα/προγονικά κύτταρα έχουν κατασκευαστεί και/ή διεγερθεί από διαφορετικές στρατηγικές προετοιμασίας για να ενισχύσουν την αναγεννητική τους ικανότητα και το εκκριτικό δυναμικό [3,4]με ρητό ενδιαφέρον για τη βιολογική συνάφεια των εκκρινόμενων εξωκυτταρικών κυστιδίων (EVs).

Τα EVs είναι σωματίδια νανο-μεγέθους που οριοθετούνται από μια διπλή στιβάδα λιπιδίων και εκκρίνονται ενεργά από όλους τους τύπους κυττάρων. Τα EV περιλαμβάνουν πολύ μικρά (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); λειτουργούν ως κρίσιμοι βιολογικοί μεταφορείς της διακυτταρικής σηματοδότησης με την παράδοση του μοριακού τους φορτίου από ένα γονικό κύτταρο σε ένα ανταποκρινόμενο/στόχο [5,6]. Δεδομένου ότι το περίεργο παρακρινικό δυναμικό τους στην άσκηση ευεργετικών επιδράσεων είναι συγκρίσιμο με τα κύτταρα προέλευσής τους, τα EVs βλαστοκυττάρων έχουν προκύψει ως ελκυστικές θεραπευτικές επιλογές σε προκλινικά μοντέλα ασθενειών, όπως η ισχαιμία, η φλεγμονή ή ο τραυματισμός, όπως ανασκοπείται εκτενώς στο [{{3 }}]. Από μεταφραστική προοπτική, πέρα ​​από το δυναμικό ρυθμίσεων των κυττάρων, η σκοπιμότητα της απομόνωσης και η αυξημένη αυτοανανέωση είναι βασικές πτυχές της ιδανικής πηγής θεραπευτικών EV και διαλυτών παραγόντων. Σε ένα τέτοιο σενάριο, τα εμβρυϊκά και περιγεννητικά MSC μπορεί να προσφέρουν μια ενδιαφέρουσα επιλογή δεδομένου του πολλαπλασιαστικού τους δυναμικού και του αναπτυξιακά ανώριμου προφίλ τους με ενδιάμεσα χαρακτηριστικά μεταξύ εμβρυϊκών και ενήλικων σωματικών προγόνων [10,11]. Το εμβρυϊκό MSC μπορεί να απομονωθεί από εξωεμβρυϊκά παραρτήματα κατά τη διάρκεια της κύησης ως υπολειπόμενη δειγματοληψία που λαμβάνεται κατά τον προγεννητικό έλεγχο (δηλαδή, χοριακές λάχνες [12-14] και αμνιακό υγρό [15,16]) ή να ληφθούν ως περιγεννητικά προγονικά κύτταρα κατά τη γέννηση, από κλινικά απόβλητα (δηλαδή, αμνιακές μεμβράνες και μεμβράνες πλακούντα [17-21], στοιχεία ομφάλιου λώρου [22-24] και όρος αμνιακό υγρό [25,26]).

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Συγκεκριμένα, τα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα αμνιακού υγρού (hAFS) έχουν επισημανθεί ως πολλά υποσχόμενες θεραπευτικές στρατηγικές στην αναγεννητική ιατρική. και έχει αποδειχθεί ότι είναι ευρέως πολυδύναμο in vitro και in vivo [16,27,28], συμβάλλει στην αιμοποιητική σειρά μετά από μεταμόσχευση in utero [29] και εμφύτευση σε τραυματισμένα όργανα ενώ ασκεί ανοσοτροποποιητικά αποτελέσματα [26,30] και ενεργοποιεί ενδογενείς επανορθωτικές αποκρίσεις, όπως περιγράφεται αναλυτικά στο [31]. Η ομάδα μας και άλλοι έχουν αποδείξει περαιτέρω ότι το hAFS απελευθερώνει ένα εκκριτικό σώμα πολύ εμπλουτισμένο με βιοενεργά τροφικά μόρια ικανά να στοχεύουν διαφορετικούς επανορθωτικούς μηχανισμούς. Οι παρακρινικοί παράγοντες hAFS έχουν αναφερθεί ότι παρέχουν ερεθίσματα υπέρ της επιβίωσης με την απόσβεση της φλεγμονής [32], παρέχουν καρδιοπροστασία έναντι παρατεταμένης ισχαιμίας [33,34] και καρδιοτοξικότητας [35] και διεγείρουν την τοπική αγγειογένεση με επανεισαγωγή στον κυτταρικό κύκλο των καρδιομυοκυττάρων. 34,36]. Δεδομένου ότι οι περισσότερες από αυτές τις επιδράσεις έχει αποδειχθεί ότι ανακεφαλαιώνονται μόνο με τη χορήγηση hAFS-EV, ανεξάρτητες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ανατομή του αναγεννητικού τους προφίλ σε διαφορετικά παθολογικά υπόβαθρα, όπως τραυματισμό σκελετικών και καρδιακών μυών, νεφρική νόσο, οστεοαρθρίτιδα, οστεοπόρωση, νεκρωτική εντεροκολίτιδα και νευροεκφυλιστικές μοντέλα [34,37-44].

Ενώ τα στοιχεία μπορεί να υποστηρίζουν την κλινική μετάφραση των hAFS-EVs για μελλοντική παρακρινική θεραπεία, είναι σημαντικό να ληφθεί υπόψη ότι οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες έχουν ερευνήσει κυρίως το ρυθμιστικό δυναμικό του εμβρυϊκού hAFS που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια του προγεννητικού ελέγχου Ⅱ τριμήνου Πράγματι, ένα πλήρες προφίλ του εκκρίματος από το περιγεννητικό έχει αντίστοιχο (δηλαδή από καισαρικές τομές ΙΙΙ τριμήνου) δεν έχει ακόμη διερευνηθεί λεπτομερώς. Τα περιγεννητικά hAFS του τρίτου τριμήνου έχουν δείξει χαρακτηριστικές ρυθμιστικές ιδιότητες του ανοσοποιητικού σε σύγκριση με εκείνα του πρώτου και του ΙΙ τριμήνου [26], ενώ διατηρούν το σχετικό ενδοθηλιακό αναγεννητικό δυναμικό [25].πόση στάμπα να πάρειςΑξίζει να σημειωθεί ότι η πρόσφατη έκθεση σχετικά με την ετερογενή μορφολογία του εμβρυϊκού hAFS[45] έδωσε νέες γνώσεις σχετικά με το στέλεχος και το προφίλ γονιδιακής τους έκφρασης.βιοφλαβονοειδήΑυτό έχει ρίξει εντελώς νέο φως στην αναγεννητική αξία των διαφορετικών κυτταρικών κλασμάτων του hAFS[46]. Ως εκ τούτου, ο ολοκληρωμένος χαρακτηρισμός των διαφορετικών υποπληθυσμών του hAFS προσελκύει αυξανόμενη προσοχή. Αναφέραμε προηγουμένως ότι μια 24ωρη υποξική διέγερση και χωρίς ορό αντιπροσωπεύει μια αποτελεσματική στρατηγική για την ενίσχυση του παρακρινικού δυναμικού του εμβρυϊκού hAFS Ⅱ τριμήνου [34,35,37]. Δεδομένου ότι λίγα είναι γνωστά για τη σύνθεση του εκκριτικού από hAFS III τριμήνου, εδώ αναφέρουμε τη συνολική σύγκριση του hAFS Ⅱ έναντι Ⅲ τριμήνου και των κλασμάτων έκκρισής τους (συμπεριλαμβανομένων των καπέλων-EVs), προκειμένου να αντιμετωπιστεί η επίδραση του σταδίου κύησης και των υποξικών κυττάρων προετοιμασία των χαρακτηριστικών κυττάρων και εκκριμάτων.

2. Αποτελέσματα

2.1. Περιγεννητικό hAFS Παρουσιάζει μια στενή φαινοτυπική αντιστοίχιση με το εμβρυϊκό

Δεν εκτιμήθηκε στατιστικά σχετική διαφορά στην ηλικία του δότη μεταξύ των δειγμάτων αμνιακού υγρού εμβρυϊκού Il τριμήνου και περιγεννητικού III τριμήνου. Εμβρυϊκό c-KIT* hAFS (f-hAFS από δείγματα αμνιακού υγρού ΙΙ τριμήνου) και περιγεννητικό c-KIT* hAFS (p-hAFS από κλινικά απόβλητα αμνιακού υγρού τριμήνου ΙΙΙ) επιβεβαίωσαν παρόμοια χαρακτηριστικά με μορφολογία ινοβλαστών και ωοειδούς στρογγυλής μορφής (Εικόνα 1Α) και μεσεγχυματικό στρωματικό φαινότυπο (δεδομένα δεν φαίνονται), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [16,25]. Τόσο το f-hAFS όσο και το p-hAFS που καλλιεργήθηκαν in vitro μέχρι το πέρασμα 5 έδειξαν αμελητέα επίπεδα γήρανσης από ενεργοποίηση γαλακτοσιδάσης (SA{14}}Gal) που σχετίζεται με τη γήρανση σε περίπου 4 τοις εκατό των κυττάρων (Εικόνα 1Β) . Τόσο το f-hAFS όσο και το p-hAFS παρουσίασαν υψηλό επίπεδο συνέκφρασης των μεσεγχυματικών δεικτών CD107a και CD146, οι οποίοι έχουν πρόσφατα αναφερθεί ότι ορίζουν έναν εξαιρετικά εκκριτικό φαινότυπο[47]. Τα κύτταρα CD107at CD146* αντιπροσώπευαν την πλειοψηφία του πληθυσμού f-hAFS (περίπου 64 τοις εκατό,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Εικόνα 1. Η εμβρυϊκή και η περιγεννητική έχουν φαινοτυπική αξιολόγηση. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες εμβρυϊκού hAFS (f-hAFS, αριστερό πλαίσιο) και περιγεννητικού hAFS (p-hAFS, δεξιός πίνακας) που καλλιεργήθηκαν in vitro σε τυπικές συνθήκες. γραμμή κλίμακας: 200 μμ. (Β) Ανάλυση του γηρασμένου δείκτη βήτα-γαλακτοσιδάσης (SA- -Gal, με μπλε χρώμα) μέσω χρώσης κυτταροχημείας σε f-hAFS και p-hAFS μετά από 5 ανακαλλιέργειες σε καλλιέργεια. αντιπροσωπευτικές εικόνες αναφέρονται στο αριστερό πλαίσιο, γραμμή κλίμακας: 200 um. Το αντίστοιχο ποσοστό των -Gal-θετικών κυττάρων/πεδίου αναφέρεται στο γράφημα στο δεξιό πλαίσιο (f-hAFS:4,12±0,58 τοις εκατό και p-hAFS:3,88±2,10 τοις εκατό ;p=0.1424,n{ {24}} πειράματα). (C) Ανοσοφαινότυπος hAFS που εκφράζει μεσεγχυματικούς δείκτες CD146 και CD107a. Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα κυτταρομετρίας ροής των f-hAFS και p-hAFS (αριστερό πλαίσιο) και οι αντίστοιχες τιμές αναφέρονται σε διπλά θετικά CD107a συν CD146 plus κύτταρα. CD107a συν CD146* f-hAFS:63,68±5,82 τοις εκατό ,*p=0.016 σε σύγκριση με το υπόλοιπο g36,32±5,82 τοις εκατό f-hAFS (Άλλο); CD107 σε CD146 συν p-hAFS: 52,07±6,74 τοις εκατό με υπόλοιπο. 93±56,76 τοις εκατό p-hAFS (Άλλο); CD107a συν CD146 συν f-hAFS vs CD107a συν CD146 συν p-hAFS p=0.2403, n{=4 πειράματα. Άλλο: συνολική ποσότητα των υπολειπόμενων CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS και CD107at CD146-hAFS. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± sem ανεξάρτητων πειραμάτων. SA- -Gal: Γαλακτοσιδάση που σχετίζεται με τη γήρανση- -.

2.2. Εμβρυϊκό hAFS Δείξτε διαφορετικό μεταβολισμό από το περιγεννητικό hAFS

Για να αξιολογηθεί εάν το στάδιο της κύησης μπορεί να επηρεάσει τον μιτοχονδριακό μεταβολισμό, τα f-hAFS και p-hAFS αναλύθηκαν σε τυπικές συνθήκες in vitro καλλιέργειας με βιοχημικές αναλύσεις. Η αξιολόγηση του αερόβιου μεταβολισμού έδειξε ότι ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) και η σύνθεση ATP ήταν χαμηλότερες στο f-hAFS σε σχέση με το p-hAFS, και τα δύο όταν διεγέρθηκαν με πυροσταφυλικό συν μηλικό (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Η υποξική προετοιμασία δεν επηρεάζει το εμβρυϊκό και το περιγεννητικό έχει βιωσιμότητα και διατηρεί την εκκριτική τους δραστηριότητα

Προκειμένου να οριστούν σκευάσματα εκκριτικού hAFS, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ελεύθερες ορού για να αποφευχθεί οποιαδήποτε μόλυνση από FBS. Δείξαμε προηγουμένως ότι οι συνθήκες υποξικής καλλιέργειας 24 ωρών χωρίς ορό (SF) και 1 τοις εκατό O2 δεν άλλαξαν σημαντικά τη βιωσιμότητα του εμβρυϊκού hAFS Ⅱ τριμήνου (f-hope), ενώ υποστήριξαν την απελευθέρωση αναγεννητικών παρακρινών παραγόντων στο κυτταρικά ρυθμισμένο μέσο τους. (hAFS-CM) και σε εξωκυτταρικά κυστίδια (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Εδώ, εκτός από το προφίλ των κλασμάτων έκκρισης p-hAFS για πρώτη φορά, αξιολογήσαμε εάν το p-έχει παρουσιάσει παρόμοια συμπεριφορά κάτω από το ίδιο καθεστώς προετοιμασίας, χρησιμοποιώντας τη συνθήκη νορμοξικής καλλιέργειας ως έλεγχο. Η βιωσιμότητα των f-hAFS και p-hAFS αναλύθηκαν μετά από 24 ώρες στις ακόλουθες ρυθμίσεις: νορμοξική (20 τοις εκατό O2) κατάσταση σε μέσο καλλιέργειας πλήρους ελέγχου (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo και Ctrl p-hAFSnormo), μια νορμοξική κατάσταση στο μέσο SF (SF f-hAFSnormo και SF p-hAFSnormo), υποξική (1 τοις εκατό O2) κατάσταση σε πλήρες μέσο ελέγχου (Ctrlf-has hypo και Ctrl p-hAFSnypo) και υποξική κατάσταση σε SF μέσο (SF f-has hypo και SF p -έχει υπογλυκαιμία, Εικόνα 3Α). Επιβεβαιώσαμε ότι η βιωσιμότητα του f-has ήταν αμετάβλητη τόσο σε συνθήκες Ctrl όσο και σε συνθήκες SF και υπό υποξική διέγερση, με περισσότερο από το 80 τοις εκατό (έως σχεδόν 88 τοις εκατό) των συνολικών κυττάρων να είναι ανεπηρέαστα. Τα πρώιμα και όψιμα αποπτωτικά κύτταρα κυμαίνονταν από περίπου. 13 τοις εκατό έως 18 τοις εκατό σε συνθήκες SF, χωρίς καμία στατιστικά σημαντική συνάφεια. Ομοίως, η περιγεννητική βιωσιμότητα ήταν της τάξης του 80-92 τοις εκατό και τα πρώιμα και όψιμα αποπτωτικά κύτταρα αντιπροσώπευαν έως και 18 τοις εκατό σε συνθήκες SF. Τα p-hAFS επηρεάστηκαν οριακά μόνο υπό τις συνδυασμένες συνθήκες υποξίας και SF. Πράγματι, ενώ η προετοιμασία δεν επηρέασε την επιβίωση των κυττάρων όταν τα p-hAFS καλλιεργήθηκαν σε ένα πλήρες μέσο, ​​η αντίστοιχη συνθήκη SF έδειξε αύξηση κατά περίπου. 4-διπλώστε (* σελ<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Εικόνα 2. Μεταβολικός χαρακτηρισμός της εμβρυϊκής και περιγεννητικής AFS. (Α) Ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR), σύνθεση ATP μέσω συνθάσης F{2}}F.ATP και αναλογία P/O σε f-have και-have παρουσία πυροσταφυλικού συν μηλικού (P/M) ή ηλεκτρικού (Succc);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche ΑυστραλίαΗ σύγκριση του ποσοστού αναστολής της σύνθεσης OCR και ATP σε f-and-hAFS λόγω των αναστολέων που υποδεικνύονται παραπάνω αναφέρεται στο κάτω πλαίσιο B. Για πειράματα OCR: hAFS συν Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την απόδοση των κλασμάτων εκκριτικού που ελήφθησαν από το f-hAFS έναντι του p-hAFS με βάση τον εμπλουτισμό πρωτεΐνης. Το σύνολο έχει εκκριτικό, καθώς το σύνολο των παρακρινών παραγόντων που εκκρίνονται από τα κύτταρα, αντιπροσωπεύεται εδώ από το hAFS-CM. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του f-hAFS-CM και του p-hAFS-CM σε μέσο SF μετά την προετοιμασία υποξικών κυττάρων έναντι της νορμοξικής κατάστασης ελέγχου ως βασική γραμμή (δηλαδή, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo και p -hAFS-CMHypo,) αξιολογήθηκε με δοκιμασία BCA και μετρήθηκε σύμφωνα με κύτταρα 10§.κιστανάκιΤα αποτελέσματα που αποκτήθηκαν υποδηλώνουν ότι τα f-has-CM και p-hAFS-CM έδειξαν εξίσου θετική τάση στον εμπλουτισμό πρωτεΐνης μετά από υποξική εκκίνηση (f-hAFS-CMnypo'166,10±22,13 ug/10 βαθμών κυττάρων;p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 βαθμών κυττάρων) σε σχέση με τα αντίστοιχα νορμοξικά τους (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 κύπαρα μοιρών· p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 μοιρών κυττάρων). Ομοίως, η συγκέντρωση πρωτεΐνης στην επιφάνεια των hAFS-EVs μετρήθηκε σε f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo και p-hAFS-EVShy Τα EVs έδειξαν συγκρίσιμη απόδοση όταν ελήφθησαν από f-hAFS ή p-hAFS. Όσον αφορά τα σκευάσματα hAFS-CM, μια θετική τάση στην αύξηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη στα f-hAFS-EV και p-hAFS. Τα EVs εκτιμήθηκαν μετά από υποξική διέγερση σε αντίστοιχη νορμοξική κατάσταση (f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 μοίρες κύτταρα και p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 μοίρες κύτταρα, f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 μοίρες κύτταρα -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/κύτταρα 10 μοιρών, Εικόνα 3C).

2.4. EVs απελευθέρωσης hAFS εμβρυϊκού και περιγεννητικού με ανάλογη μορφολογία και κατανομή μεγέθους

Η μορφολογική ανάλυση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) αύξησε τον υψηλό EV-εκκριτικό πολλαπλασιασμό τόσο του f-hAFS όσο και του p-hAFS (Εικόνα 4). Διερευνήσαμε περαιτέρω το μέγεθος και την περιοχή των f-hAFS-EVs και p-hAFS-EVs (Εικόνα 4Β) μετά από υποξική προετοιμασία σε σύγκριση με τη νορμοξική γραμμή βάσης. Τα εμβρυϊκά και τα περιγεννητικά έχουν απελευθερώσει EVs ετερογενούς μεγέθους, στην περιοχή των 40-250 nm, συμπεριλαμβανομένων των εξωσωμάτων/μικρών EV και των μικροκυστιδίων/διαλυτικών κυστιδίων. Το μέσο μέγεθος των EVs/πεδίου στις διάφορες ομάδες ήταν συγκρίσιμο, τα εμβρυϊκά hAFS-EV μετρήθηκαν 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f. -have-EVSHvpo:97,10±10,10 nm)και περιγεννητικών που μετρήθηκαν 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94,60±19,53 nm· p-hAFS-EVShypo:76,43±4.{37}} nm 4Β, αριστερό πλαίσιο). Όσον αφορά την απόδοση, το hAFS που διεγείρεται υπό υποξία έδειξε θετική τάση στην αύξηση της ποσότητας των μικρών EVs, αν και αυτή η αύξηση δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Το f-hAFS-EVStypo μέτρησε 40-70 nm, το οποίο ήταν σχεδόν διπλάσιο από αυτό σε σύγκριση με το νορμοξικό αντίστοιχο. Το Perinatal-has-EVSHypo που μέτρησε 40-70 nm,{70-100 nm και 100-130 nm ήταν σχεδόν τριπλάσια από αυτά που ελήφθησαν σε νορμοξική καλλιέργεια (Εικόνα 4Β).

Η ανάλυση παρακολούθησης νανοσωματιδίων (NTA) έδειξε αυξημένο αριθμό σωματιδίων και στα παρασκευάσματα f-hAFS-EV και p-hAFS-EV και επιβεβαίωσε την αύξηση των EVs στα υποξικά δείγματα, όπως επίσης παρατηρήθηκε από τις προηγούμενες αναλύσεις (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'σωματίδια/10 κυψέλες μοιρών· f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10 μοίρες σωματίδια/10 μοίρες κυψέλες ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 σωματίδια μοιρών/κύτταρα 10 μοιρών· p-hAFS-EVshypo: 3,05±0,62×10 σωματίδια μοιρών/κύτταρα 10 μοιρών, Εικόνα 4C).

Εικόνα 4. Μορφολογικός χαρακτηρισμός των εμβρυϊκών και περιγεννητικών έχουν-EVs. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (TEM) των f-hAFS και p-hAFS (άνω και κάτω αριστερό πλαίσιο, αντίστοιχα, με μαύρα βέλη που υποδεικνύουν ενδοκυτταροπλασματικά πολυκυστιδώδη σώματα με μικρά EVs/εξωσώματα μέσα τους) και f -hAFS-EV και p-hAFS-EV (άνω και κάτω δεξιός πίνακας, αντίστοιχα) που απελευθερώνονται σε συνθήκες χωρίς ορό και υπό κανονική έναντι υποξικής προετοιμασίας (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo, και f-hAFS-EVshypo, αντίστοιχα), ράβδοι κλίμακας: 200 nm. (Β)Αριστερό πλαίσιο: ανάλυση TEM της κατανομής μεγέθους hAFS-EV. δεξιό πλαίσιο: λήφθηκε υπόψη η κατανομή του αριθμού f-hAFS-EV και p-hAFS-EV ανά διαστήματα μεγέθους πεδίου από 40 nm έως 250 nm. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος±sem n=3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Ανάλυση παρακολούθησης νανοσωματιδίων για μέγεθος και κατανομή hAFS. Αριστερό πλαίσιο: αντιπροσωπευτική εικόνα της γραφικής εξόδου. δεξιός πίνακας: συγκέντρωση hAFS-EVs μετρημένη ως σωματίδια 10 μοιρών ανά εκκρίνοντα κύτταρα 10 μοιρών. nm: νανόμετρο; mL: χιλιοστόλιτρο.

2.5. Ο πρωτεομικός χαρακτηρισμός του εμβρύου έναντι του περιγεννητικού hAFS Υπογραμμίζει τις διαφορές στη σύνθεση του εκκρίματός τους ανάλογα με την ηλικία κύησης και την υποξική προετοιμασία

Ο πρωτεομικός χαρακτηρισμός τόσο των σκευασμάτων εκκρίματος f-hAFS όσο και p-hAFS πραγματοποιήθηκε μέσω μιας πλατφόρμας χωρίς ετικέτα κυνηγετικού όπλου, με βάση τη σύζευξη νανο υγρής χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης (nLC-HRMS). Σαράντα οκτώ πρωτεομικά προφίλ αποκτήθηκαν με την διπλή ανάλυση τριών βιολογικών αντιγράφων του hAFS-CM και του has-EVs από τα f-hAFS και p-hAFS που υποβλήθηκαν σε προετοιμασία υποξικών κυττάρων σε σύγκριση με τη νορμοξική κατάσταση ως μάρτυρα. Συνολικά 4179 διακριτές πρωτεϊνικές ομάδες ταυτοποιήθηκαν με τουλάχιστον ένα μοναδικό πεπτίδιο και με μοριακά βάρη που κυμαίνονται από 2 έως 3900 kDa και ισοηλεκτρικά σημεία από 3,6 έως 13. Παρατηρήθηκε υψηλότερη μέση έκφραση πρωτεΐνης στα hAFS-EVs σε σύγκριση με το hAFS-CM . Η ευθυγράμμιση όλων των καταλόγων πρωτεϊνών που ελήφθησαν πραγματοποιήθηκε με βάση τις αναγνωρισμένες πρωτεΐνες. Για κάθε πειραματική συνθήκη, δημιουργήθηκε μια μοναδική λίστα που κανονικοποιεί και υπολογίζει τον μέσο όρο[50] των τιμών αντιστοίχισης του φάσματος πεπτιδίων (PSM) που αποδίδονται στις πρωτεΐνες, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των φασμάτων μάζας που έχουν εκχωρηθεί σε καθεμία και αντιπροσωπεύουν έμμεσα την αφθονία τους στα δείγματα. Ο πλήρης κατάλογος των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στα σκευάσματα hAFS-CM και have-EV αναφέρεται στον Πίνακα S1.

Η εφαρμογή της ανάλυσης γραμμικής διάκρισης (LDA[51]) σε αυτόν τον κύριο κατάλογο επέτρεψε την εξαγωγή στατιστικά σημαντικών πρωτεϊνών (Fratio μεγαλύτερο από ή ίσο με 4,5 και** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 σε σκευάσματα hAFS-CM και have-EV εξετάζονται χωριστά. Ενώ περίπου το 69,5 τοις εκατό και το 69,9 τοις εκατό των πρωτεϊνών μοιράζονταν μεταξύ των συνθηκών hAFS-EV και hAFS-CM αντίστοιχα, το υπόλοιπο περιεχόμενο εμφανίστηκε αποκλειστικό σε διαφορετικές αναλογίες, που κυμαίνονταν από 3,7 τοις εκατό έως 13,4 τοις εκατό, μεταξύ των συνθέσεων.

Για να εξεταστούν ποσοτικά οι πρωτεομικές αλλαγές, πραγματοποιήθηκε μια διαφορική ανάλυση χωρίς ετικέτα χρησιμοποιώντας το οικιακό λογισμικό MAProMa και εφαρμόζοντας δύο αλγόριθμους, DAve (Διαφορικός μέσος όρος) και DCI (Δείκτης Διαφορικής Εμπιστοσύνης, που αντιπροσωπεύουν την αναλογία και την εμπιστοσύνη στη διαφορική έκφραση. αντίστοιχα), στα PSM κάθε μεμονωμένης πρωτεΐνης μεταξύ των δύο συγκριτικών όρων. Χρησιμοποιώντας αυστηρά φίλτρα για DAve και DCI για τη μεγιστοποίηση της εμπιστοσύνης της ταυτοποίησης και για την εξέταση πρωτεϊνών με διακύμανση μεγαλύτερη από μια αλλαγή στο 1,5, συγκρίσεις ανά ζεύγη f-hAFS-CM έναντι p-hAFS-CM και f-hAFS-EVs έναντι Τα p-hAFS-EVs κατασκευάστηκαν σύμφωνα με το στάδιο κύησης των κυττάρων. Συνολικά 58 και 109 πρωτεΐνες βρέθηκαν διαφορικά εκφρασμένες στα παραπάνω διαμερίσματα has-CM και have-EV, αντίστοιχα, (Εικόνα S1B, C για επιλεγμένες λεπτομέρειες και Πίνακες S2-S3 σε εκτεταμένη μορφή). Μεταξύ αυτών, 30 πρωτεΐνες κατέληξαν σε ρύθμιση προς τα πάνω στο f-hAFS-CM και 28 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στο p-hAFS-CM (Εικόνα S1B). Παρομοίως, 44 διακριτές πρωτεΐνες είχαν ως αποτέλεσμα να ρυθμίζονται προς τα πάνω στα f-have-EVs και 65 να ρυθμίζονται προς τα πάνω σε p-hAFS-EVs (Εικόνα S1C). Σημειωτέον, οι πρωτεΐνες που οδήγησαν σε αυξημένη ρύθμιση στο f-have θα πρέπει να θεωρηθούν ως προς τα κάτω ρυθμισμένες στο p-has και αντίστροφα.

Οι τιμές αναφέρονται. δείτε τον Πίνακα S2 για τον πλήρη κατάλογο και τις λεπτομερείς παραμέτρους των αναφερόμενων πρωτεϊνών. (Γ) Ανάλυση εμπλουτισμού βιολογικών διεργασιών πρωτεϊνών που προσδιορίζονται με συχνότητα τουλάχιστον 2 σε εμβρυϊκό hAFS-CM (αριστερό πλαίσιο) και περιγεννητικό have-CM (δεξιό πλαίσιο) σύμφωνα με την υποξική προετοιμασία των κυττάρων. Με βάση το εργαλείο FunRich, οι όροι γονιδιακής οντολογίας εμφανίζονται σε ραβδογράμματα που αναφέρουν το ποσοστό των γονιδίων που εμπλουτίστηκαν για κάθε κατηγορία (ροζ ράβδοι για-have-CMnormo, μωβ ράβδοι για f-hAFS-CMhypor ανοιχτό μπλε ράβδοι για p-hAFS-CMnormo, και μπλε μπάλες για p-hAFS-CMhypo).αγοράστε κιστανάκιΜόνο οι όροι γονιδιακής οντολογίας με Bonferroni διορθώθηκαν με*σελ<0.05 are="">

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Int. J. ΜοΙ. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms