Η σύγκριση μεταξύ QPCR και RNA-seq αποκαλύπτει τις προκλήσεις του ποσοτικού προσδιορισμού της έκφρασης HLA Μέρος 2

Ομαλοποίηση

Χρησιμοποιήσαμε εκτιμήσεις έκφρασης σε μεταγραφές ανά εκατομμύριο (TPM), που είναι η τυπική κανονικοποίηση που παράγεται από τον Salmon και αντιστοιχεί στη σχετική ποσότητα μιας δεδομένης μεταγραφής σε ένα δείγμα. Για κάθε δεδομένο γονίδιο, η εκτίμηση είναι απλώς το άθροισμα των TPM για τις μεταγραφές του. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν δείχνουμε τυπικές κανονικές εκτιμήσεις μετασχηματισμού, πραγματοποιήσαμε έναν κανονικό μετασχηματισμό κατάταξης των δεδομένων RNAseq χρησιμοποιώντας το πακέτο GenABEL R (Aulchenko et al. 2007), το οποίο συνήθως εφαρμόζεται, για παράδειγμα, σε γραμμικά μοντέλα χαρτογράφησης eQTL (Delaneau et al. 2017).

Η χαρτογράφηση QTL είναι μια μέθοδος για τη μελέτη του ρυθμιστικού μηχανισμού της γονιδιακής έκφρασης συγκρίνοντας τη συσχέτιση μεταξύ γονιδιακής έκφρασης και γονιδιακού πολυμορφισμού σε έναν πληθυσμό. Το γραμμικό μοντέλο είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος χαρτογράφησης eQTL, η οποία μπορεί να χρησιμοποιήσει ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης για να εκτιμήσει τη συσχέτιση μεταξύ γονιδιακής έκφρασης και γονιδιακού πολυμορφισμού.

Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα πολύπλοκο βιολογικό σύστημα που προστατεύει τον οργανισμό από λοιμώξεις και ασθένειες όπως ο καρκίνος. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης παίζει σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα και μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος.

Επομένως, μπορούν να χρησιμοποιηθούν γραμμικά μοντέλα χαρτογράφησης eQTL για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ των ρυθμιστικών μηχανισμών έκφρασης γονιδίων και της ανοσίας. Για παράδειγμα, η μελέτη της συσχέτισης μεταξύ ενός συγκεκριμένου γονότυπου και της έκφρασης ενός βασικού γονιδίου του ανοσοποιητικού σε έναν πληθυσμό μπορεί να αποκαλύψει την επίδραση αυτού του γονότυπου στη ρύθμιση της έκφρασης του ανοσοποιητικού γονιδίου. Τέτοια έρευνα μπορεί να προσφέρει σημαντική διαφώτιση για τη θεραπεία και την πρόληψη των παθήσεων του ανοσοποιητικού. Αυτό δείχνει τη σημασία της ανοσίας, επομένως πρέπει να βελτιώνουμε το ανοσοποιητικό μας καθημερινά. Ο κιμάς έχει επίσης αντι-ιικές, αντικαρκινικές και άλλες επιδράσεις, οι οποίες μπορούν να ενισχύσουν την ανοσία Η ικανότητα του συστήματος να αντιστέκεται και να βελτιώνει την ανοσία του σώματος.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστανάκι

Διαβάστε την ευθυγράμμιση με το γονιδίωμα αναφοράς

Για την ανάλυση της κάλυψης ανάγνωσης στα γονίδια HLA που αναφέρονται στο Σχήμα S7, ευθυγραμμίσαμε τις αναγνώσεις με το γονιδίωμα αναφοράς GRCh38 με το STAR v2.7.3a (Dobin et al. 2013), χρησιμοποιώντας σχολιασμούς γονιδίου Gencode v37. Για τον έλεγχο της μεροληψίας χαρτογράφησης στα γονίδια HLA, επεξεργαστήκαμε περαιτέρω τα αρχεία BAM με το hlamapper v4.3 (Castelli et al. 2018).

Προσομοίωση

Δεδομένα βασικής αλήθειας

Για να δημιουργήσουμε προσομοιωμένα δεδομένα, εκτελέσαμε πρώτα το Salmon v1.3.0 (Patro et al. 2017) στο πραγματικό δείγμα #66K00003 για να μάθουμε τα επίπεδα έκφρασης των μεταγραφών Gencode v37. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το πακέτο Polyester (v1.26.0) για να δημιουργήσουμε 50 συνθετικά δείγματα με πανομοιότυπα επίπεδα έκφρασης σε επίπεδο μεταγραφώματος, εκτός από τα HLA-A, -B και -C. Τα επίπεδα έκφρασης για αυτά τα γονίδια βασίστηκαν σε 50 τυχαία επιλεγμένα άτομα από τα πραγματικά μας δεδομένα (για τα οποία έχουμε διαθέσιμα δεδομένα αλληλόμορφων HLA). Για κάθε γονίδιο HLA, επιλέξαμε τις ισομορφές που αντιπροσώπευαν τουλάχιστον το 90 τοις εκατό της συνολικής έκφρασης μεταγραφής κωδικοποίησης πρωτεΐνης σε ένα Salmon που εκτελέστηκε στο πραγματικό σύνολο δεδομένων (το οποίο είχε ως αποτέλεσμα μόνο 1 μεταγραφή ανά γονίδιο) και εξατομικεύσαμε τις αλληλουχίες μεταγραφής σύμφωνα με Αλληλόμορφα HLA που μεταφέρονται από κάθε άτομο.

Αυτή η διαδικασία μας επέτρεψε να δημιουργήσουμε συνθετικά 50 άτομα με πανομοιότυπα επίπεδα έκφρασης υποβάθρου, αλλά με μεταβλητή έκφραση HLA και με πολυμορφισμό HLA ενσωματωμένο στις προσομοιωμένες αναγνώσεις.

Για να αντικατοπτριστούν τα πραγματικά μας δεδομένα, προσομοιώθηκαν τριάντα εκατομμύρια αναγνώσεις ζευγαρώματος 126 bp με μέσο μέγεθος θραύσματος 261 bp για κάθε άτομο, χρησιμοποιώντας τις προεπιλογές για άλλες παραμέτρους πολυεστέρα (π.χ. την τυπική απόκλιση του μήκους του θραύσματος=25 bp, ποσοστό σφάλματος=0.005, ομοιόμορφη κατανομή αναγνώσεων και χωρίς προκατάληψη). Ο πολυεστέρας βγάζει αρχεία FASTA, από τα οποία παράγαμε αρχεία FASTQ με σταθερή βαθμολογία ποιότητας (αντίστοιχο σύμβολο "F").

Μετρήσεις για την ακρίβεια

Τα TPMs υπολογίστηκαν σε προσομοιωμένες μετρήσεις δεδομένων των μηκών μεταγραφής και του μέσου μεγέθους θραυσμάτων των 261 bp. Η αναλογία "Εκτιμώμενο TPM/True TPM" χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της απόδοσης στην ανάκτηση προσομοιωμένων επιπέδων έκφρασης και μας επιτρέπει να παρατηρούμε κάτω ή υπερεκτίμηση.

Γραφικά

Ετοιμάσαμε όλες τις γραφές σε αυτό το άρθρο χρησιμοποιώντας το πακέτο ggplot2 v3.3.2 (Wickham 2016) στο R.

Αποτελέσματα

Ακρίβεια ποσοτικού προσδιορισμού RNA-seq HLA

Δεδομένης της απουσίας μεθόδου που μπορεί να θεωρηθεί το πειραματικό χρυσό πρότυπο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης HLA από δεδομένα RNA-seq, αξιολογήσαμε αρχικά την ακρίβεια των μεθόδων ποσοτικοποίησης RNA-seq για HLA χρησιμοποιώντας προσομοιωμένα δεδομένα όπου είναι γνωστά τα πραγματικά επίπεδα έκφρασης αφού δημιουργούνται σε έναν υπολογιστή για μίμηση πραγματικών πειραμάτων. Αυτό έγινε για να επιλεγεί η καλύτερη υπολογιστική προσέγγιση μεταξύ των μεθόδων που βασίζονται σε RNA-seq, επιτρέποντας μια επακόλουθη αντίθεση με προσεγγίσεις μη-RNA-seq.

Προσομοιώσαμε ένα πείραμα RNA-seq για 50 άτομα χρησιμοποιώντας τη συσκευασία Polyester (Frazee et al. 2015). Αυτά τα συνθετικά άτομα έχουν τα ίδια επίπεδα έκφρασης για όλα τα γονίδια στο γονιδίωμα, εκτός από τα HLA-A, -B και -C, για τα οποία διαφοροποιήσαμε τα επίπεδα έκφρασης. Εξατομικεύσαμε επίσης τις σχολιασμένες αλληλουχίες μεταγραφής HLA από το Gencode v37 για να εισαγάγουμε πραγματική γενετική παραλλαγή που παρατηρείται σε τυχαία επιλεγμένα άτομα από ένα σύνολο δεδομένων 96 ατόμων (τα οποία είχαν γονότυπο HLA με αλληλουχία Sanger όπως περιγράφεται παρακάτω). Οι εξατομικευμένες μεταγραφές που προέκυψαν είχαν ταυτότητα διάμεσης αλληλουχίας με αναφορά μεγαλύτερη από 95 τοις εκατό για όλους τους τόπους HLA.

Συγκρίναμε εκτιμήσεις της έκφρασης HLA που ελήφθησαν με δύο βιοπληροφορικές μεθόδους: (1) "Ref transcriptome", το οποίο χρησιμοποιεί Salmon (Patro et al. 2017) για να ευθυγραμμίσει τις αναγνώσεις με το τυπικό μεταγραφικό αναφοράς, ποσοτικοποιώντας την αφθονία μεταγραφής και (2) "Personalized" που χρησιμοποιεί επίσης Salmon, αλλά χαρτογραφεί τις αναγνώσεις σε εξατομικευμένες μεταγραφές HLA, που αντικατοπτρίζουν τον γονότυπο HLA του ατόμου (Εικ. 1). Η προσέγγιση "Εξατομικευμένη" επεκτείνει την προηγούμενη στρατηγική μας (Aguiar et al. 2019) χρησιμοποιώντας μια εξατομικευμένη μεταγραφή, αντί για μια ενιαία κανονική κωδικοποιητική ακολουθία για κάθε αλληλόμορφο που φέρει το άτομο.

Η μέθοδος "Ref transcriptome" υποτίμησε τα επίπεδα έκφρασης, ιδιαίτερα για αλληλόμορφα με μεγαλύτερη αναλογία διαφορών αλληλουχίας σχετικά με το γονιδίωμα αναφοράς (Εικ. 1). Αυτό είναι αναμενόμενο δεδομένου ότι ένα υψηλότερο ποσοστό αναντιστοιχίας μεταξύ των αναγνώσεων και της αναφοράς επηρεάζει αρνητικά την ευθυγράμμιση (Brandt et al. 2015). Αυτή η προσέγγιση υπερεκτίμησε επίσης την έκφραση HLA-C για ορισμένα άτομα, ως συνέπεια των αναγνώσεων από το HLA-B που χαρτογραφήθηκαν στα μεταγραφήματα αναφοράς HLA-C (Εικ. S1). Η «Εξατομικευμένη» προσέγγιση, από την άλλη πλευρά, ελέγχει την προκατάληψη χαρτογράφησης και επιτυγχάνει τη βέλτιστη ακρίβεια.

Αν και η προσομοίωση μας παρέχει ενθαρρυντικά αποτελέσματα σχετικά με τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης HLA χρησιμοποιώντας RNAseq, πρέπει να λάβουμε υπόψη ορισμένες προειδοποιήσεις. Τροποποιήσαμε την αλληλουχία των σχολιασμένων ισομορφών σύμφωνα με τα αλληλόμορφα HLA των ατόμων χρησιμοποιώντας ένα μοναδικό σύνολο ισομορφών για όλα τα αλληλόμορφα σε ένα δεδομένο γονίδιο HLA. Αυτές οι αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν τόσο στην προσομοίωση αναγνώσεων όσο και στην ποσοτικοποίηση της έκφρασης. Συνεπώς, αναμένουμε τη βέλτιστη ακρίβεια. Σε ένα πραγματικό σενάριο, διαφορετικά αλληλόμορφα HLA μπορεί να σχετίζονται με διαφορετικές ισομορφές. Αργότερα σε αυτό το άρθρο, συζητάμε ένα συγκεκριμένο παράδειγμα που παρατηρήσαμε για το HLA-A, σύμφωνα με την υπόθεση ότι ορισμένες ισομορφές είναι αποκλειστικές για συγκεκριμένα αλληλόμορφα. Ωστόσο, δεδομένου ότι ενδιαφερόμαστε κυρίως για τις εκτιμήσεις έκφρασης σε επίπεδο γονιδίου και σε επίπεδο αλληλόμορφου HLA, αναμένουμε ότι οι εξατομικευμένες αλληλουχίες αντιπροσωπεύουν μια βελτίωση σε σχέση με ένα μεμονωμένο μεταγραφικό αναφοράς μειώνοντας την προκατάληψη χαρτογράφησης.

Εκτίμηση της έκφρασης HLA από πραγματικά δεδομένα RNA-seq

Πραγματοποιήσαμε εκτίμηση έκφρασης σε δεδομένα RNA-seq ολόκληρου του μεταγραφώματος για 96 άτομα, για τα οποία εκτιμήθηκαν προηγουμένως τα επίπεδα επιφανειακής έκφρασης του qPCR για HLAA, -B, και -C και HLA-C (Kulkarni et al. 2013; Ramsuran et al. 2015, 2017) και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για σύγκριση με τα αποτελέσματα RNAseq (βλ. Εικ. S2 για αναλύσεις QC σε δεδομένα RNA-seq).

Δεδομένης της υψηλότερης ακρίβειας της εξατομικευμένης προσέγγισης στην προσομοίωση, αντιπαραθέτουμε αυτήν τη μέθοδο εκτιμήσεων έκφρασης που βασίζονται σε RNA με εκείνη άλλων προσεγγίσεων που δεν είναι αλληλουχίες RNA, αλλά παρέχουμε τα αποτελέσματα για τις προσεγγίσεις που βασίζονται σε μεταγραφικό στοιχείο αναφοράς στο "Συμπληρωματικές πληροφορίες. " Εξατομικεύσαμε τις αλληλουχίες μεταγραφής λαμβάνοντας υπόψη τους μεμονωμένους γονότυπους HLA που ελήφθησαν με την αλληλουχία Sanger. Τρέξαμε τα HLApers (Aguiar et al. 2019) και το Kourami (Lee and Kingsford 2018) για να συμπεράνουμε αλληλόμορφα απευθείας από τα δεδομένα RNA-seq και να επιβεβαιώσουμε τις κλήσεις Sanger (βλ. «Υλικά και μέθοδοι»).

Οι εκτιμήσεις έκφρασης σε επίπεδο γονιδίου δείχνουν ότι το HLA-B έχει την υψηλότερη έκφραση μεταξύ των θέσεων HLA στο σύνολο δεδομένων μας, ακολουθούμενο από τα HLA-C και HLA-A (Εικ. 2Α). Αυτή η σειρά είναι συνεπής με το σύνολο δεδομένων ολικού αίματος GTEx (GTEx Consortium 2020) και με μια προηγούμενη μέθοδο RNAseq σύλληψης HLA που εφαρμόστηκε σε PBMC (Yamamoto et al. 2020). Ωστόσο, αυτό το μοτίβο διαφέρει από αυτό που είδαν οι Boegel et al (2018), οι οποίοι παρατήρησαν παρόμοια επίπεδα στα γονίδια χρησιμοποιώντας μια διαφορετική στρατηγική για την αντιμετώπιση της χαρτογράφησης ανάγνωσης σε πολλαπλούς τόπους, η οποία μπορεί να συμβάλει στην έλλειψη διάκρισης μεταξύ των τόπων όσον αφορά το επίπεδο έκφρασης ). Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να διαχωρίσουν τη συμβολή των διαφορών στις μεθοδολογίες ή τη σύνθεση κυτταρικού τύπου σε αυτές τις διαφορές.

Σύγκριση RNA-seq και qPCR σε πραγματικά δεδομένα

Στη συνέχεια συγκρίναμε τις εκτιμήσεις έκφρασης RNA-seq με αυτές που ελήφθησαν με qPCR (Εικ. 2Β). Αν και η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης RNA-seq και qPCR ήταν στατιστικά σημαντική για όλα τα γονίδια (ρ=0.024, 0.002, 0.000000016, για τα HLA-A, -B, και -C, αντίστοιχα· δοκιμή Spearman για θετική συσχέτιση), το μέγεθος των συσχετίσεων ήταν μέτριο για τα HLA-A και -B και υψηλότερο για το -C. Η χρήση μιας εξατομικευμένης αναφοράς για RNA-seq αύξησε μέτρια τη συσχέτιση με το qPCR σε σύγκριση με μια τυπική αναφορά (Εικ. S3). Αυτό συμφωνεί με την προηγούμενη παρατήρησή μας ότι οι εκτιμήσεις έκφρασης σε επίπεδο γονιδίου δεν διαφέρουν ουσιαστικά μεταξύ των προσεγγίσεων που βασίζονται στο γονιδίωμα αναφοράς ή των εξατομικευμένων προσεγγίσεων για γονίδια κατηγορίας Ι HLA (Aguiar et al. 2019), με το κύριο πλεονέκτημα των εξατομικευμένων προσεγγίσεων να είναι οι εκτιμήσεις στο Επίπεδο αλληλίου HLA, το οποίο εξερευνούμε παρακάτω. Η χρήση διόρθωσης μεροληψίας στον σολομό (προκατάληψη GC, μεροληψία ειδικής ακολουθίας και μεροληψία ειδικής θέσης) βελτιώνει τη συσχέτιση με το qPCR, με τον υψηλότερο αντίκτυπο για το HLA-B (συγκρίνετε τα Σχήματα 2Β και S4, για διορθωμένα και μη διορθωμένα δεδομένα, αντίστοιχα).

Σύγκριση επιπέδων mRNA με επιφανειακή έκφραση

Επειδή η έκφραση του RNA είναι ενημερωτική για τα αρχικά στάδια της κυτταρικής σηματοδότησης και της απόκρισης στα ερεθίσματα, η ανάλυση της σχέσης του με τους κατάντη μοριακούς φαινοτύπους (όπως η έκφραση πρωτεΐνης στην κυτταρική επιφάνεια) μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε τον ρόλο της μετα-μεταγραφικής και μετα-μεταφραστικής ρύθμισης στην Έκφραση HLA. Αναμένονται διαφορές μεταξύ της αφθονίας RNA και πρωτεϊνών καθώς υπόκεινται σε διαφορετικούς τρόπους ρύθμισης. Τα τεχνικά αποτελέσματα μπορούν επίσης να εισάγουν διαφορές, καθώς οι τεχνικές RNA και πρωτεΐνης διαφέρουν και επηρεάζονται από μη συσχετιζόμενους τύπους σφαλμάτων (Li and Biggin 2015; Kaur et al. 2017; Carey et al. 2019). Επιπλέον, στην περίπτωση της μελέτης μας, η γονιδιακή έκφραση μετρήθηκε σε συνολικά PBMCs, ενώ η έκφραση πρωτεΐνης μετρήθηκε σε ταξινομημένα κύτταρα CD3 plus. Με αυτή τη διαφορά κατά νου, μετρήσαμε τον βαθμό στον οποίο η πρωτεΐνη HLA στην κυτταρική επιφάνεια μπορεί να προβλεφθεί από την έκφραση mRNA. Αυτή η ανάλυση πραγματοποιήθηκε αποκλειστικά για το HLA-C, καθώς είναι ο μόνος τόπος για τον οποίο είναι διαθέσιμο ένα αντίσωμα που μπορεί να δεσμεύσει όλα τα αλληλόμορφα με ίσες συγγένειες. Είναι ενδιαφέρον ότι υπήρχε υψηλή συσχέτιση μεταξύ mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης για HLAC, με ελαφρώς υψηλότερη συσχέτιση για RNA-seq (Εικ. 2C).

Έκφραση σε επίπεδο αλληλόμορφου HLA

Τα γονίδια HLA περιέχουν ρυθμιστικά στοιχεία που σχετίζονται με τη συστατική μεταγραφή και τη δυναμικά ενεργοποιημένη μεταγραφή (René et al. 2016). Ως αποτέλεσμα, η έκφραση HLA ποικίλλει μεταξύ των ιστών και μπορεί να ρυθμιστεί από ρυθμιστικά δίκτυα που ενεργοποιούνται από διαφορετικά ερεθίσματα (Anderson 2018; Carey et al. 2019). Υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για την κατανόηση του εάν τα διαφορετικά αλληλόμορφα HLA σχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα βασικής έκφρασης και ρυθμιστικά προγράμματα (Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020) και εάν αυτή η παραλλαγή συμβάλλει σε φαινότυπους ασθενειών ή αποτελέσματα μεταμόσχευσης (Petersdorf et al. al. 2014, 2015· René et al. 2016· Bettens et al. 2022· Johansson et al. 2022). Επομένως, συγκρίθηκαν εκτιμήσεις έκφρασης σε επίπεδο αλληλόμορφου HLA για qPCR και RNA-seq. Επειδή τα μεμονωμένα αλληλόμορφα είναι συχνά αρκετά σπάνια στο σύνολο δεδομένων, τα ομαδοποιήσαμε κατά αλληλικές σειρές (δηλαδή, ομάδες αλληλόμορφων που ορίζονται φυλογενετικά από τη σχέση των εξονίων) (Elsner et al. 2002).

Κατατάξαμε τις σειρές σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασής τους με βάση τα δεδομένα RNA-seq και qPCR και αξιολογήσαμε τη συμφωνία των ταξινομήσεων μεταξύ των μεθόδων (Εικ. 3). Η εξατομικευμένη προσέγγισή μας RNA-seq παρέχει άμεσα εκτιμήσεις σε επίπεδο αλληλόμορφων, δεδομένου ότι οι αλληλουχίες αλληλόμορφων HLA χρησιμοποιούνται για την ευρετηρίαση των ευθυγραμμίσεων, επομένως παραγγείλαμε τις αλληλικές σειρές σύμφωνα με τα μέσα επίπεδα έκφρασής τους. Επειδή οι εκτιμήσεις μας για την έκφραση qPCR είναι σε επίπεδο γονιδίου και δεν παρέχουν άμεσα εκτιμήσεις σε επίπεδο αλληλόμορφων, παραγγείλαμε αλληλικές σειρές σύμφωνα με τα αποτελέσματά τους σε ένα γραμμικό μοντέλο επιπέδων έκφρασης που εξηγείται από τον γονότυπο HLA (βλ. Ramsuran et al. 2015). Στο Σχ. 3, οι τιμές έκφρασης απεικονίζονται δύο φορές για κάθε επίπεδο για κάθε αλληλόμορφο άτομο, και για qPCR, είναι απλώς η έκφραση σε επίπεδο γονιδίου που απεικονίζεται δύο φορές, αντανακλώντας την παρουσία δύο αλληλόμορφων.

Η σειρά των εκτιμήσεων έκφρασης είναι πιο παρόμοια μεταξύ RNA-seq και qPCR για HLA-C παρά για -A και -B (μέση διαφορά απόλυτης τάξης, όπου η διαφορά τάξης αναφέρεται στην παρατηρούμενη διαφορά στις θέσεις εντός μιας ταξινομημένης τάξης τιμών έκφρασης , μεταξύ ποσοτικοποίησης RNA-seq και qPCR, 2,3 για το HLA-C, 3,1 για -Α και 3,9 για -Β), ακολουθώντας ένα παρόμοιο πρότυπο συμφωνίας με αυτό της έκφρασης σε επίπεδο γονιδίου, για το οποίο βρήκαμε την υψηλότερη συσχέτιση μεταξύ RNA-seq και qPCR για HLA-C.

Μεταξύ των γενεών με τη μεγαλύτερη διαφορά μεταξύ RNA-seq και qPCR είναι η A*11. Μετρήσαμε την επιφανειακή έκφραση σε ένα υποσύνολο ετεροζυγώτων για A*03 ή A*11 χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που έχει ίση συγγένεια και για τις δύο γενεές και παρατηρήσαμε ότι το qPCR συσχετίζεται πιο ισχυρά με την έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας αυτών των δύο αλλοτύπων από ότι το RNA-seq (Εικ. S5). Στη συνέχεια, παρουσιάζουμε μια πιο εκτεταμένη αξιολόγηση των παραγγελιών αλληλόμορφων μέσω συγκρίσεων με προηγούμενες μελέτες έκφρασης HLA mRNA.

Ενώ υπάρχει ενδιαφέρον για τη σύγκριση των διαφορών έκφρασης μεταξύ των αλληλόμορφων HLA, διάφορες μελέτες δείχνουν ότι η διακύμανση στην έκφραση μέσα σε μια αλληλόμορφη ή αλληλική γενεαλογία είναι συχνά αρκετά υψηλή και οι διαφορές μεταξύ αλληλόμορφων διαφορετικών βαθμίδων είναι συχνά μικρές και μη σημαντικές. Κατά συνέπεια, μπορεί να μην είναι ρεαλιστικό να αναμένεται διατήρηση των τάξεων σε πολλαπλά αλληλόμορφα και μπορεί να είναι προτιμότερο να συγκρίνουμε εκτιμήσεις έκφρασης για αλληλόμορφα στα άκρα της έκφρασης.

Για τα δεδομένα μας RNA-seq, συγκρίνουμε τις εκτιμήσεις μας με αυτές από δύο προηγούμενες προσεγγίσεις RNA-seq προσαρμοσμένες στο HLA σε PBMC. Υπάρχει μια γενικά καλή συμφωνία με τους Yamamoto et al. (2020), όπου τα A*24, A*02, C*04 και C*06 εκφράζονται έντονα και τα A*03, C*03 και B*15 εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα, αν και βλέπουμε επίσης διαφορές όπως όσο για το B*35, το οποίο θα συμφωνούσε περισσότερο με τα δεδομένα qPCR μας. Όταν συγκρίνουμε τα δεδομένα RNA-seq μας με τους Johansson et al. (2021), ωστόσο, βλέπουμε πολλές περισσότερες διαφορές, αν και έχουν πολύ μικρά δείγματα για πολλές γενεαλογίες.

Αντιπαραβάλλουμε επίσης τα αποτελέσματά μας με αυτά από δύο προηγούμενες μελέτες qPCR που εφάρμοσαν εκκινητές ειδικούς για αλληλόμορφα. Bettens et al. (2014) χρησιμοποίησαν εκκινητές ειδικούς για αλληλόμορφα για ορισμένες σειρές HLAC και είδαν τα C*04 και C*06 ως εξαιρετικά εκφρασμένα, ενώ τα C*07 και C*03 εκφράστηκαν σε χαμηλά επίπεδα, σύμφωνα με αυτό που έχουμε και για τα δύο RNA-seq και qPCR. Οι René et al. (2015) εφάρμοσαν εκκινητές ειδικούς για αλληλόμορφα για το HLA-A και παρατήρησαν Α*02 ​​(υψηλό) και Α*29 (χαμηλό) στα άκρα έκφρασης, κάτι που συμφωνεί περισσότερο με τα αποτελέσματά μας RNAseq παρά με το qPCR μας. Ωστόσο, βλέπουμε πολλές διαφορές σε άλλες αλληλόμορφες γενεές

Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορούμε επίσης να αξιολογήσουμε τη συμφωνία με λειτουργικές μελέτες. Για παράδειγμα, προηγούμενες αναλύσεις θέσεων δέσμευσης μεταγραφικού παράγοντα (TFBS) και δραστηριότητας προαγωγέα (ανασκόπηση στο Anderson 2018) και μελέτες για τη ρύθμιση του miRNA (Kulkarni et al. 2011), δείχνουν ότι τα C*03 και C*07 είναι ασθενώς εκφρασμένα αλληλόμορφα, που συμφωνεί με τις παρατηρήσεις μας τόσο για το RNA-seq όσο και για το qPCR.

Πιθανές πηγές διαφορών

Στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν η επεξεργασία των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για RNA-seq θα μπορούσε να έχει συμβάλει στις διαφορές μεταξύ των εκτιμήσεων έκφρασης που ελήφθησαν με qPCR και RNA-seq.

Μια συγκεκριμένη ανησυχία ήταν η διάρκεια αποθήκευσης των δειγμάτων σε καταψύκτη –80 βαθμών (περίπου 4 χρόνια μεταξύ των προσδιορισμών qPCR και RNA-seq), καθώς και άλλα βήματα ειδικά για το πείραμα RNA-seq, συμπεριλαμβανομένης της απόψυξης των δειγμάτων. Για να το αντιμετωπίσουμε αυτό, πραγματοποιήσαμε ένα δεύτερο πείραμα RNAseq σε φρέσκο ​​αίμα που λήφθηκε εκ νέου από 11 άτομα, τα οποία είναι ένα υποσύνολο των 96 που αναλύθηκαν σε αυτήν τη μελέτη, και συγκρίναμε τις εκτιμήσεις έκφρασης μεταξύ των δύο χρονικών σημείων. Παρόλο που αυτή η δεύτερη δοκιμασία φέρει τόσο τεχνικές όσο και βιολογικές διαφορές σχετικά με το πρώτο πείραμα αλληλουχίας RNA (Εικ. S6A και B), η συσχέτιση σε επίπεδο μεταγραφώματος στις εκτιμήσεις έκφρασης μεταξύ χρονικών σημείων είναι υψηλή (Εικ. S6C).

Αν και η αξιολόγηση της συσχέτισης με 11 άτομα μπορεί να είναι θορυβώδης, οι συσχετίσεις στα γονίδια HLA είναι από τις μεγαλύτερες γονιδιακές συσχετίσεις μεταξύ των δύο δειγμάτων (Εικ. S6D και F). Υπολογίσαμε επίσης αναλογίες αλληλόμορφων εντός του ατόμου, που είναι η αναλογία έκφρασης μεταξύ των δύο αλληλόμορφων HLA ενός ετερόζυγου ατόμου, και τα συγκρίναμε μεταξύ χρονικών σημείων. Η συσχέτιση ήταν μεγαλύτερη από 0.94 για τα HLA-A, -B και -C (Εικ. S6E). Ως εκ τούτου, δεν είδαμε στοιχεία για μια σημαντική συμβολή της αποικοδόμησης RNA για να εξηγηθεί η χαμηλή συσχέτιση μεταξύ RNA-seq και qPCR στο αρχικό μας δείγμα.

Μια άλλη πιθανή συμβολή στις διαφορές μεταξύ RNA-seq και qPCR είναι ότι το συγκεκριμένο αλληλόμορφο HLA μπορεί να είναι πιο προκατειλημμένο στη μία ή στην άλλη μέθοδο, οπότε τα άτομα που φέρουν τέτοια αλληλόμορφα θα συνέβαλαν σε μεγάλες διαφορές. Για παράδειγμα, για άτομα που φέρουν A*03 ή για ομοζυγώτες για C*07, υπάρχει αρνητική σχέση μεταξύ qPCR και RNA-seq (Εικ. 4Α).

Μια πρόσθετη πηγή διαφορών μεταξύ των μεθόδων μπορεί να προκύψει από το γεγονός ότι, στην προσέγγισή μας RNA-seq, εξατομικεύουμε όλες τις μεταγραφές με σχολιασμό Gencode για κάθε αλληλόμορφο HLA. Ωστόσο, η αληθινή ποικιλομορφία μεταγραφής και η συσχέτισή της με συγκεκριμένα αλληλόμορφα HLA δεν είναι καλά κατανοητές. Για παράδειγμα, οι Kulkarni et al. (2017) έδειξε ότι τα A*01 και A*11 παράγουν μικρότερα 3'-UTR. Για να διερευνήσουμε εάν μπορούμε να αντιγράψουμε αυτή τη χρηματοδότηση στα δεδομένα μας RNA-seq, χαρτογραφήσαμε τις αναγνώσεις στο γονιδίωμα αναφοράς και διορθώσαμε για χαρτογράφηση μεροληψίας στα γονίδια HLA με έναν χαρτογράφο hla (Castelli et al. 2018). Πράγματι, για άτομα που φέρουν A*01 ή A*11, η κάλυψη ανάγνωσης στο 3'-UTR του HLA-A δείχνει μια απότομη πτώση στα ~120 bp πριν από το σχολιασμένο άκρο γονιδίου (Εικ. S7).

Επειδή οι τιμές μεταγραφής ανά εκατομμύριο (TPM) υπολογίζονται λαμβάνοντας υπόψη το μήκος αναφοράς, η χρήση αναφοράς μεγαλύτερης από την πραγματική μεταγραφή οδηγεί σε υποεκτίμηση της έκφρασης. Προσπαθήσαμε να ελέγξουμε την πιθανότητα τέτοιων συντομότερων μεταγραφών συμπεριλαμβάνοντας μια έκδοση κάθε μεταγραφής HLA-A με συντομευμένο 3'-UTR στο ευρετήριό μας για ευθυγράμμιση ανάγνωσης. Ωστόσο, δεν βρήκαμε στοιχεία έκφρασης της βραχύτερης ισομορφής (Εικ. S8), πιθανώς επειδή αυτές οι μικρότερες ισομορφές περιέχονται στις ισομορφές κανονικού μήκους και η υλοποίηση του Salmon εκχωρεί όλες τις αναγνώσεις στη μεγαλύτερη ισομορφή. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση σε επίπεδο ισομορφής αποκαλύπτει μια ισομορφή με μακρύτερο 5'-UTR αποκλειστικά στο A*11, το οποίο συμβάλλει σε μεγάλο ποσοστό της συνολικής έκφρασης για αυτό το αλληλόμορφο (Εικ. S8).

Δοκιμάσαμε επίσης μια κανονικοποίηση των εκτιμήσεων έκφρασης, κατά την οποία προσαρμόσαμε τα μήκη ανάγνωσης δεδομένης της κάλυψης ανάγνωσης που υποστηρίζει ένα εγγύς ή απομακρυσμένο άκρο 3'-UTR (σταθμισμένος μέσος όρος των μηκών μεταγραφής χρησιμοποιώντας την κάλυψη ανάγνωσης ως βάρη). Αν και παρατηρούμε αύξηση έως και 20 τοις εκατό στα επίπεδα έκφρασης για άτομα που φέρουν A*01 ή/και A*11, βλέπουμε μόνο μια μικρή βελτίωση στη συσχέτιση με την qPCR μετά από αυτήν την προσαρμογή (από rho=0. 20 στο Σχ. 2 έως το rho=0.24 στο Σχ. 4Β).

Τα A*01 και A*11 είναι μεταξύ των αλληλόμορφων με τις μεγαλύτερες διαφορές κατάταξης μεταξύ RNA-seq και qPCR (Εικ. 3) και μια ατελής αναπαράσταση των σχετικών μεταγραφών τους στον σχολιασμό μπορεί να εισάγει μεροληψία στις εκτιμήσεις μας RNA-seq.

Τέλος, οι μέθοδοι κανονικοποίησης που χρησιμοποιούνται για τη λήψη τελικών εκτιμήσεων έκφρασης από τα ακατέργαστα δεδομένα qPCR μπορούν επίσης να αποτελέσουν πηγή διαφορών μεταξύ των εκτιμήσεων qPCR και RNA-βλ. Οι ποσοτικές αναλύσεις PCR για γονίδια HLA Τάξης Ι συνήθως ενισχύουν περιοχές εντός των εξονίων 1 έως 4 και η τυποποίηση με την έκφραση ενός γονιδίου οικιακής φροντίδας όπως το B2M (2-μικροσφαιρίνη) πραγματοποιείται συνήθως (όπως συνέβη στην παρούσα μελέτη ). Το σκεπτικό αυτής της διαδικασίας είναι ότι εάν τα επίπεδα έκφρασης τυποποιηθούν από μια σταθερά εκφρασμένη αναφορά, οι εκτιμήσεις για διαφορετικά άτομα τοποθετούνται στην ίδια κλίμακα, επιτρέποντας έτσι συγκρίσεις μεταξύ των ατόμων.

Το B2M κωδικοποιεί για την ελαφριά αλυσίδα στο μόριο HLA Τάξης Ι και είναι εύλογο ότι τα γονίδια B2M και HLA τάξης Ι έχουν κάποιο συντονισμό έκφρασης, καθώς μοιράζονται παρόμοιες αρχιτεκτονικές υποκινητή (Kobayashi και van den Elsen 2{{1{{{12} }}}12· Vijayan et al. 2019), και μπορεί να ρυθμιστεί από κοινούς μεταγραφικούς παράγοντες (για παράδειγμα, το NLRC5/CITA επάγει την έκφραση τόσο της HLA τάξης I όσο και της B2M στις κυτταρικές σειρές Jurkat (Meissner et al. 2{{20}}10). Η ομαλοποίηση της έκφρασης του γονιδίου HLA με συσχετισμένες τιμές μπορεί να εισάγει μεροληψία στις εκτιμήσεις qPCR μας, ειδικά για το HLA-B, για το οποίο βλέπουμε υψηλό συσχέτιση με την έκφραση B2M (Εικ. 4C). Η κλιμάκωση μιας μεταβλητής από μια διαφορετική αλλά συσχετισμένη μεταβλητή μπορεί να εισαγάγει διαταραχή φέρνοντας ακραίες τιμές στο μέσο της κατανομής και μειώνοντας τη διακύμανση· σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, οι συντελεστές διακύμανσης για τα δεδομένα qPCR είναι 0,61 και 0,50 για τα HLA-A και -C, αντίστοιχα, αλλά πέφτει στο 0,17 για το HLA-B (ως σύγκριση, τα CV για τα δεδομένα RNA-seq είναι 0,20, 0,14 και 0,29 για τα HLA-A, -B και -C , αντίστοιχα). Ωστόσο, χρησιμοποιώντας τον ίδιο σχεδιασμό qPCR, οι Ramsuran et al. (2017) κανονικοποίησε την έκφραση HLA-B είτε από το γονίδιο B2M, GAPDH, 18 s και b-Actin, και παρατήρησε πολύ σταθερά αποτελέσματα, τα οποία δεν υποστηρίζουν την επίδραση της κανονικοποίησης του B2M στις εκτιμήσεις qPCR.

Συζήτηση

Οι αξιόπιστες εκτιμήσεις της έκφρασης μεταγραφής HLA μπορούν να συμβάλουν σε ποικίλα ερευνητικά ερωτήματα, και παρόλο που η έκβαση της νόσου διερευνάται συχνά στο πλαίσιο της παραλλαγής κωδικοποίησης HLA, τα επίπεδα έκφρασης είναι επίσης πιθανό να εξηγήσουν τη διακύμανση στα κλινικά αποτελέσματα (ανασκόπηση στο Dendrou et al. 2018, και στο Johansson et al. 2022). Τα επίπεδα έκφρασης έχουν επίσης τη δυνατότητα να λάβουν αποφάσεις κατά τον προγραμματισμό μεταμόσχευσης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. για παράδειγμα, εάν δεν είναι διαθέσιμο το τέλειο ταίριασμα στην επιλογή για αλλογενείς δότες, φαίνεται ωφέλιμο να επιλέγουμε αυτούς που δεν ταιριάζουν σε αλληλόμορφα χαμηλής έκφρασης (Petersdorf et al. 2014, 2015). Οι αξιόπιστες εκτιμήσεις της έκφρασης μεταγραφής μπορούν επίσης να βοηθήσουν στον εντοπισμό των eQTL που αποτελούν τη βάση του ελέγχου της έκφρασης HLA, η οποία θα μπορούσε να ενσωματωθεί στα ευρήματα GWAS, ερωτώντας εάν οι γνωστές επιτυχίες στην περιοχή MHC συμπίπτουν με eQTL για γονίδια HLA (βλ. π.χ. Πίνακα S6 στο Aguiar et al. 2019). Γενικότερα, οι βελτιωμένες εκτιμήσεις της έκφρασης μεταγραφής HLA θα μας βοηθήσουν να κατανοήσουμε τη γενετική αρχιτεκτονική της ρύθμισης του HLA, προσδιορίζοντας τη σχετική συμβολή των παραλλαγών που δρουν cis (δηλαδή, εκείνων που βρίσκονται κοντά στο γονίδιο HLA που ρυθμίζουν) και των παραλλαγών που συναλλάσσονται (αυτές που βρίσκονται σε απομακρυσμένες γονιδιωματικές θέσεις, συμπεριλαμβανομένων άλλων χρωμοσωμάτων). Αυτό θα παρέχει πληροφορίες σχετικά με το βαθμό στον οποίο η διακύμανση στην έκφραση HLA είναι μια ιδιότητα ειδική για το αλληλόμορφο έναντι ενός χαρακτηριστικού μεταξύ των ατόμων, ανεξάρτητο από την αλληλική ταυτότητα (βλ. Bettens et al. 2022).

Οι ποσοτικές τεχνικές PCR μας επέτρεψαν να αποκαλύψουμε συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης HLA και των φαινοτύπων της νόσου. Πιο πρόσφατα, το RNA-seq έχει γίνει η μέθοδος εκλογής για την αξιολόγηση της γονιδιακής έκφρασης σε μεγάλα σύνολα δεδομένων ολόκληρου μεταγραφώματος διαφορετικών πληθυσμών. Η δυνατότητα εξαγωγής ακριβών πληροφοριών για την έκφραση HLA από τέτοια δεδομένα είναι μια σημαντική πρόκληση και έχουν προταθεί πολλές μέθοδοι για την επίτευξη αυτού του στόχου. Ωστόσο, ο βαθμός στον οποίο τα αποτελέσματα που προκύπτουν από αναλύσεις RNA-seq συμφωνούν με αυτά που συσσωρεύονται με τη χρήση της qPCR είναι επί του παρόντος άγνωστος. Αν και αυτές οι μέθοδοι στοχεύουν στον ίδιο μοριακό φαινότυπο (αφθονία RNA), διαφέρουν σημαντικά στις πειραματικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται, τις μορφές ανάλυσης και κανονικοποίησης των δεδομένων, τις βιοπληροφορικές διαδικασίες και τις προκαταλήψεις στις οποίες υπόκεινται.

Από ό,τι γνωρίζουμε, προηγούμενες μελέτες που συνέκριναν προσεγγίσεις HLA προσαρμοσμένου RNA-seq με qPCR περιλάμβαναν μικρά δείγματα. Για παράδειγμα, οι Johansson et al. (2021) επικύρωσε το HLA-στοχευμένο RNA-seq του με qPCR μόνο σε 5 δείγματα στο HLA-C, χρηματοδοτώντας έναν συντελεστή συσχέτισης Pearson 0,9, ο οποίος δεν ήταν σημαντικός (p=0,08) .

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε ποσοτικές εκτιμήσεις έκφρασης PCR και RNA-seq για το κλασικό γονίδιο HLA τάξης I HLA-A, -B και -C σε ένα αντίστοιχο σύνολο 96 ατόμων. Βρήκαμε μέτριες αλλά σημαντικές συσχετίσεις στην έκφραση σε ένα δείγμα 96 ατόμων. Δεδομένης της έλλειψης ενός χρυσού προτύπου με το οποίο να συγκρίνονται αυτές οι εκτιμήσεις, τα σφάλματα εκτίμησης και οι προκαταλήψεις που σχετίζονται και με τις δύο μεθόδους μπορεί να συμβάλλουν στο συνολικό αποτέλεσμα.

Εξερευνήσαμε τις επιδράσεις διαφόρων παραγόντων που μπορεί να εξηγήσουν τη χαμηλή συσχέτιση μεταξύ εκτιμήσεων RNA-seq και qPCR, όπως η κακή εκτίμηση της έκφρασης για συγκεκριμένα αλληλόμορφα HLA και η κανονικοποίηση από ένα μόνο γονίδιο housekeeping στο qPCR. Τα αποτελέσματά μας δεν μπορούν να γενικευθούν σε κάθε σχεδιασμό qPCR ή αγωγό RNA-seq, για τις οποίες υπάρχει μεγάλη ποικιλία διαφορετικών προσεγγίσεων. Ωστόσο, από ό,τι γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη άμεση σύγκριση μεταξύ qPCR και RNA-seq για την εκτίμηση της έκφρασης HLA.

Η μελέτη μας προτείνει περιοχές που απαιτούν βελτίωση στον προσδιορισμό της έκφρασης μεταγραφής HLA. Οι συγκρίσεις μεταξύ RNA-seq και qPCR, για παράδειγμα, θα πρέπει να χρησιμοποιούν ομοιόμορφη επεξεργασία δειγμάτων σε όλες τις μεθόδους (π.χ. ίδιο πρωτόκολλο απομόνωσης RNA, χρόνος αποθήκευσης/απόψυξης, ακεραιότητα RNA) για να περιοριστούν οι τεχνητές διαφορές που σχετίζονται με αυτές τις μεθόδους. Η αντιστοίχιση σύντομων αναγνώσεων σε μεμονωμένα γονιδιώματα αναφοράς ή μεταγραφώματα δημιουργεί προκαταλήψεις και είναι απαραίτητες στρατηγικές που αντιστοιχούν τις αναγνώσεις που αντιστοιχούν στον πολυμορφισμό HLA. Δεδομένου ότι υπάρχουν πολλές στρατηγικές για να επιτευχθεί αυτό (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020), θα είναι σημαντικό να συγκρίνουμε το σχετική ακρίβεια αυτών των προσεγγίσεων.

Υπάρχει επίσης ανάγκη να αναπτυχθούν μέθοδοι που να λαμβάνουν επαρκώς υπόψη την παραλλαγή ισομορφής, όχι μόνο για να παρέχουν ένα άλλο επίπεδο πληροφοριών αλλά και πιο ακριβείς εκτιμήσεις έκφρασης, καθώς η κανονικοποίηση των μετρήσεων ανάγνωσης από ένα εσφαλμένο μήκος μεταγραφής είναι μια πιθανή πηγή λάθους. Σε αυτό το πλαίσιο, τα δεδομένα μακράς ανάγνωσης, τα οποία δημιουργούν άμεσα πλήρεις πληροφορίες μεταγραφής, μπορούν να αποτελέσουν ένα ισχυρό εργαλείο (Cornaby et al. 2022). Τέλος, η παραλλαγή αριθμού αντιγράφων, ένα γνωστό χαρακτηριστικό για ορισμένους τόπους HLA (π.χ. DRB), θα πρέπει επίσης να λαμβάνεται υπόψη κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε την Tatiana Torres (Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο), τον Yang Luo (Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ) και τα μέλη του Joint Biology Consortium στη Βοστώνη, για τις χρήσιμες συζητήσεις τους.

Συνεισφορά συγγραφέα

Οι Diogo Meyer, Mary Carrington, Richard M. Single και Vitor RC Aguiar συνέβαλαν στη σύλληψη και στο σχεδιασμό της μελέτης. Η προετοιμασία υλικού, η συλλογή δεδομένων και τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν από τους Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto και Mary Carrington. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε από τους Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Maria Gutierrez-Arcelus και Diogo Meyer. Το χειρόγραφο γράφτηκε από τους Vitor RC Aguiar και Diogo Meyer. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν, έκαναν συνεισφορές και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση

Η Υπηρεσία Χρηματοδότησης του Σάο Πάολο (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) παρείχε χρηματοδότηση στο DM (2012/18010-0 και 2013/22007-7) και στο VRCA (2014/{{{ 5}} και 2016/24734-1). Τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ παρείχαν χρηματοδότηση στο DM (NIH R01 GM075091), το οποίο υποστήριξε μέρος του μεταδιδακτορικού VRCA. Η Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) και το Υπουργείο Υγείας, Βραζιλία παρείχαν χρηματοδότηση για τα πειράματα RNA-seq και τις ερευνητικές ταξιδιωτικές επισκέψεις, ως μέρος μιας κοινής πρότασης ΗΠΑ-Βραζιλίας που ανατέθηκε στους MC και DM (470043/{{13} }). Το NIH/NIAID R01AI157850 υποστηρίζει το SK. Το VR χρηματοδοτήθηκε από το Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας της Νότιας Αφρικής (SAMRC) με πόρους από το Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας (DST). και υποστηρίζεται επίσης εν μέρει μέσω του Δικτύου της Υποσαχάριας Αφρικής για την Έρευνα Αριστείας για τη φυματίωση/HIV (SANTHE), μια πρωτοβουλία DELTAS Africa (Grant # DEL-15-006) από την AAS.

Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί εξ ολοκλήρου ή εν μέρει με ομοσπονδιακούς πόρους από το Εθνικό Εργαστήριο Έρευνας για τον Καρκίνο Frederick, σύμφωνα με τον Αρ. Σύμβασης HHSN261200800001E. Το περιεχόμενο αυτής της δημοσίευσης δεν αντικατοπτρίζει απαραίτητα τις απόψεις ή τις πολιτικές του Υπουργείου Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών, ούτε η αναφορά εμπορικών ονομάτων, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει έγκριση από την κυβέρνηση των ΗΠΑ. Αυτή η Έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ενδομυαλικό Ερευνητικό Πρόγραμμα του NIH, Frederick National Lab, Centre for Cancer Research.

Διαθεσιμότητα δεδομένων

Τα δεδομένα RNA-seq που παρουσιάζονται στην τρέχουσα δημοσίευση έχουν κατατεθεί και είναι διαθέσιμα από τη βάση δεδομένων dbGaP στο dbGaP accession phs003177.v1.p1.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, et al (2019) Εκτίμηση έκφρασης και χαρτογράφηση eQTL για γονίδια HLA με εξατομικευμένη διοχέτευση. PLoS Genet 15:e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M et al (2012) Η παραλλαγή κινδύνου πολλαπλής σκλήρυνσης HLA-DRB1*1501 σχετίζεται με υψηλή έκφραση του γονιδίου DRB1 σε διαφορετικούς ανθρώπινους πληθυσμούς. PLoS One 7:e29819.

3. Anderson SK (2018) Μοριακή εξέλιξη των στοιχείων που ελέγχουν την έκφραση HLA-C: Προσαρμογή σε έναν ρόλο ως συνδετήρα υποδοχέα τύπου ανοσοσφαιρίνης φονικού κυττάρου που ρυθμίζει τη λειτουργία των φυσικών κυττάρων φονέων. HLA 92:271–278.

4. Apps R, Meng Z, Del Prete GQ et al (2015) Σχετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών HLA class-I σε φυσιολογικά και μολυσμένα με HIV κύτταρα. J Immunol 194:3594-3600.

5. Apps R, Qi Y, Carlson JM, et al (2013) Επίδραση του επιπέδου έκφρασης HLA-C στον έλεγχο του HIV. Science 340:87–91.

6. Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmed WS et al (2023) Οι βοηθητικές πρωτεΐνες SARS-CoV-2 ORF7a και ORF3a χρησιμοποιούν διακριτούς μηχανισμούς για να μειώσουν τη ρύθμιση της επιφανειακής έκφρασης MHC-I. Proc Natl Acad Sci USA 120:e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: μια βιβλιοθήκη R για ανάλυση συσχέτισης σε επίπεδο γονιδιώματος. Bioinformatics 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, et al (2018) Η καθοδική ρύθμιση HLA-C από τον HIV-1 προσαρμόζεται στον γονότυπο HLA του ξενιστή. PLoS Pathog 14:e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) Υψηλή αλληλική μεταβλητότητα στην έκφραση HLA-C mRNA: συσχέτιση με απλότυπους εκτεταμένους με HLA. Genes Immun 15:176-181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G et al (2022) Ρύθμιση έκφρασης HLA τάξης Ι από μη κωδικοποιητικές παραλλαγές γονιδίου. PLoS Genet 18:e1010212

11.Boegel S, Bukur T, Castle JC, Sahin U (2018) In Silico Typing of Classical and Non-classical HLA Alleles from Standard RNA-Seq Reads. Methods ΜοΙ Biol 1802:177–191.

For more information:1950477648nn@gmail.com