Κλωνοποίηση, Λειτουργική Αναγνώριση και Ανάλυση Έκφρασης Συνθάσης Χαλκόνης από το Cistanche Tubulosa

Περίληψη: Στόχος Η μελέτη της λειτουργίας της συνθάσης χαλκόνης από το Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) και το μοτίβο έκφρασης του γονιδίου CtCHS σε λευκά, κόκκινα και μοβ άνθη.

Μέθοδοι Το γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε με RT-PCR και πραγματοποιήθηκε ανάλυση βιοπληροφορικής. Το πλασμίδιο pET-28a-CtCHS μεταφέρθηκε στο Escherichia coli για να προκληθεί έκφραση πρωτεΐνης με IPTG. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CtCHS επωάστηκε με τα υποστρώματα ρ-κουμαροϋλ CoA και μηλονυλ CoA και τα προϊόντα ανιχνεύθηκαν με HPLC και MS. Το πλασμίδιο pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS μεταφέρθηκε στον πρωτοπλάστη του Arabidopsis thaliana για να παρατηρηθεί ο υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης CtCHS. Το πρότυπο έκφρασης του CtCHSgene στα άνθη τουC. tubulosaμε τρία χρώματα ανιχνεύθηκε με qRT-PCR.

Αποτελέσματα Ένα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε. Το μήκος του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) ήταν 1173 bp, που κωδικοποιεί 390 αμινοξέα και το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης ήταν 42 8000. Το CtCHS περιείχε τα καταλυτικά υπολείμματα Cys164, His303, Asn336, τα οποία διατηρήθηκαν σε συνθάση χαλκόνης. Η CtCHSprotein εκφράστηκε σε Ε. coli και καθαρίστηκε για να ληφθεί η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. Η πρωτεΐνη CtCHS θα μπορούσε να καταλύσει το π-κουμαροϋλ CoA και το μηλονυλ CoA για να παράγει ναρινγενίνη χαλκόνη. Η πρωτεΐνη CtCHS εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Το γονίδιο CtCHS εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε μωβ και κόκκινα άνθη και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης ήταν 8,44 και 3,21 φορές υψηλότερα από αυτά στα λευκά άνθη, αντίστοιχα.

Συμπέρασμα Ένα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε από το άνθος τουC. tubulosaκαι η πρωτεΐνη εκφράστηκε. Η πρωτεΐνη CtCHS έχει λειτουργία συνθάσης χαλκόνης και η έκφραση του γονιδίου CtCHS είναι υψηλότερη σε πιο σκούρα άνθη, υποδεικνύοντας ότι το CtCHSgene μπορεί να ρυθμίζει το χρώμα των λουλουδιών του C. tubulosa, το οποίο θέτει τα θεμέλια για περαιτέρω έρευνα σχετικά μεμηχανισμός ρύθμισης του χρώματος των λουλουδιών του C. tubulosa.

Λέξεις-κλειδιά:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; συνθάση χαλκόνης; ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας; υποκυτταρικός εντοπισμός? εξπρεσιονάλυση

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 30% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 12% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-κατάστημα

Το βιοσυνθετικόμονοπάτι των φλαβονοειδώνξεκινά με το φαινυλοπροπανοειδές μονοπάτι.Φαινυλαλανίνημετατρέπεται πρώτα σε κινναμωμικό οξύ κάτω από τοδράση της αμμωνιαλυάσης της φαινυλαλανίνης(PAL) και το κινναμωμικό οξύ 4-υδροξυλιώνεται από το κινναμωμικό οξύ. Το ένζυμο (κινναμωμικό οξύ-4-υδροξυλάση, C4H) και 4-κουμαρατεκοένζυμο Α λιγάση (4-κουμαρατεκοένζυμο Α λιγάση, 4CL) καταλύουν την αντίδραση για να δημιουργήσουν 4-κουμαροϋλ-CoA [11 ]. Ένα μόριο 4-κουμαροϋλ-CoA και τρία μόρια μηλονυλ-CoA καταλύονται από τη συνθάση της χαλκόνης (CHS) για τη δημιουργία χαλκόνης ναρινγενίνης, η οποία έχει φλαβονοειδή ενώσεις. Η διυδροφλαβονόλη 4-ρεδουκτάση, κ.λπ. παράγει μια ποικιλία φλαβονοειδών όπως ισοφλαβόνες, φλαβονόλες, ανθοκυανίνες κ.λπ. [12]. Ως βασικό ένζυμο στη βιοσυνθετική οδό των φλαβονοειδών, το CHS ρυθμίζει την περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή στα φυτά και επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του χρώματος των λουλουδιών των φυτών [13]. Για παράδειγμα, η μετα-μεταγραφική σίγαση του γονιδίου Gentiana scabra Bunge CHS μπορεί να αναστείλει τη βιοσύνθεση των ανθοκυανινών και να προκαλέσει ειδική λεύκανση των λοβών του στεφάνη [14]. Σίγαση γονιδίου CHS του Actinidia erianthaBenth. Το CHS μειώνει την περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνη στα πέταλα και κάνει τα πέταλα κόκκινα. Τα πέταλα γίνονται πιο ανοιχτόχρωμα[15]. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, ένα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε από άνθη Cistanche tubulosa και διεξήχθησαν σε αυτό ανάλυση βιοπληροφορικής, προκαρυωτική έκφραση και καθαρισμός, ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας, ανάλυση υποκυτταρικού εντοπισμού και ανάλυση έκφρασης σε τρία χρώματα λουλουδιών για να διερευνηθεί η λειτουργία του CtCHS πρωτεΐνη και το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου CtCHS χρησιμοποιήθηκαν για την προκαταρκτική διερεύνηση της σχέσης μεταξύ CtCHS και χρώματος λουλουδιών Cistanche tubulosa, που έθεσε τα θεμέλια για τη μελέτη του ρυθμιστικού μηχανισμού τουΧρώμα λουλουδιών Cistanche tubulosa.

1 Υλικά και όργανα

1.1 Υλικά

Τα άνθη Cistanche tubulosa συλλέχθηκαν από την κομητεία Yutian, στην επαρχία Hotan, στο Xinjiang τον Μάιο του 2018. Κατά τη δειγματοληψία ακολουθήθηκε η τυχαία αρχή και επιλέχθηκαν άνθη Cistanche tubulosa με καλή φυσιολογική κατάσταση και σταθερό ύψος φυτού. Τρία στελέχη Cistanche tubulosa με τρία χρώματα λουλουδιών λευκό, κόκκινο και μοβ λήφθηκαν και αναγνωρίστηκαν ως Cistanche tubulosa (Schenk) Wight από τον καθηγητή Tu Pengfei της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Πεκίνου. Καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στο Πεκίνο σε αποθήκευση ξηρού πάγου. Τα χημικά ικανά κύτταρα E. coli DH5 αγοράστηκαν από την Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. και E. coli BL21 (DE3) χημικά ικανά κύτταρα αγοράστηκαν από την Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Ο φορέας αγοράστηκε από την Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Το Malonyl-CoA αγοράστηκε από την Sigma Company, 4-κουμαροϋλ-CoA, naringenin -Η χαλκόνη αγοράστηκε από τη Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., και η ναρινγενίνη από τη Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Όργανα

Φασματοφωτόμετρο Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, ΗΠΑ); όργανο gradient PCR (Eppendorf Company, Γερμανία). Όργανο ποσοτικής PCR φθορισμού CFX 96, συσκευή απεικόνισης γέλης UVP, όργανο ηλεκτροφόρησης γέλης, όργανο ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (BioRad Company, ΗΠΑ) ;EnSpire

Συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (PerkinElmer Company, ΗΠΑ). θερμοκοιτίδα σταθερής θερμοκρασίας (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Ταλαντωτής πλήρους θερμοκρασίας μεγάλης χωρητικότητας DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory). THZ-82Ένας ταλαντωτής σταθερής θερμοκρασίας υδατόλουτρου ( Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Εξαιρετικά καθαρός πάγκος εργασίας AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); αποστειρωτής ατμού υψηλής πίεσης (TOMY Company, Ιαπωνία). Όργανο καθαρού νερού Milli Q (Millipore, Ηνωμένες Πολιτείες). LC-20Ένας χρωματογράφος υγρής φάσης υψηλής απόδοσης (Shimadzu Company, Ιαπωνία). Φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, ΗΠΑ). Συνεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ FV1200 (Olympus Company, Ιαπωνία).

2 Πειραματικές μέθοδοι

2.1 Εκχύλιση RNA και σύνθεση cDNA.

Τα άνθη Cistanche tubulosa αλέστηκαν σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία εκχύλισης RNA.

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ (Norgen, Cat 17200), η συγκέντρωση και η ποιότητα του RNA ανιχνεύθηκαν με NanoDrop 2000C και δείγματα RNA με αναλογία Α260/Α280 μεταξύ 1,8 και 2,1 επιλέχθηκαν για αντίστροφη μεταγραφή για τη σύνθεση cDNA. Η αντίστροφη μεταγραφάση M-MLV (Promega, M170B) χρησιμοποιήθηκε για την ανάστροφη μεταγραφή του αναγνωρισμένου ολικού RNA σε cDNA. Οι πειραματικές πράξεις έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες.

2.2 Κλωνοποίηση του γονιδίου CtCHS

Με βάση τα δεδομένα μεταγραφής λουλουδιών Cistanche tubulosa της ερευνητικής μας ομάδας [16], εξετάστηκε ένα CtCHS με πλήρες ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης και το λογισμικό SnapGene χρησιμοποιήθηκε για τον σχεδιασμό συγκεκριμένων εκκινητών με βάση τη γονιδιακή αλληλουχία (Πίνακας 1). Η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας cDNA λουλουδιού Cistanche tubulosa ως πρότυπο. Το σύστημα ενίσχυσης ήταν 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, upstream και downstream primers (10 μmol/L) 2 μL το καθένα, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν: προ-μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 3 λεπτά. 25 κύκλοι μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 55 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 βαθμούς για 1 λεπτό. επέκταση αντίδρασης στους 72 βαθμούς για 5 λεπτά. Το προϊόν PCR ανιχνεύθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης 1% και το κιτ καθαρισμού DNA (Novizan, Cat DC301-01) χρησιμοποιήθηκε για ανάκτηση γέλης και στη συνέχεια το ανακτηθέν DNA καθαρίστηκε με κιτ ταχείας κλωνοποίησης (Novizan, Cat Γ601-01). Το θραύσμα DNA συνδέθηκε με τον φορέα pCE2TA/Blunt-Zero, μετασχηματίστηκε σε κατάλληλα κύτταρα Escherichia coli DH5 και μετά από καλλιέργεια όλη τη νύχτα στους 37 βαθμούς, επιλέχθηκαν στελέχη απλού κλώνου και στάλθηκαν στην εταιρεία για προσδιορισμό αλληλουχίας.

Πίνακας 1 Αλληλουχίες εκκινητών

2.3 Βιοπληροφορική ανάλυση

Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό λογισμικό ProtParam για να αναλύσετε τις φυσικές και χημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο Prot Scale για να αναλύσετε την υδροφιλία/υδροφοβία των πρωτεϊνών. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο SOPMA για να προβλέψετε τη δευτερογενή δομή πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό λογισμικό ανάλυσης SWISS-MODEL για να προβλέψετε την τριτογενή δομή πρωτεΐνης. χρήση διαδικτυακού λογισμικού TMHMM Πρόβλεψη της διαμεμβρανικής δομής της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό DNAMAN για να συγκρίνετε την ομολογία του CtCHS με τις αλληλουχίες αμινοξέων CHS άλλων ειδών. χρησιμοποιήστε το λογισμικό MEGA-X για να κατασκευάσετε ένα φυλογενετικό δέντρο, χρησιμοποιώντας γειτονική ένωση (NJ) και διόρθωση Poisson Η εξελικτική απόσταση υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bootstrap και ο αριθμός των επαναλήψεων Bootstrap είναι 1000 φορές.

2.4 CtCHS προκαρυωτική έκφραση και καθαρισμός

Σχεδιάστε εκκινητές με θέσεις περιορισμού BamHⅠ και XhoⅠ με βάση την αλληλουχία CtCHS και η PCR ενισχύουν τα αντίστοιχα θραύσματα στόχου. Ο φορέας pET-28και το θραύσμα στόχος υποβλήθηκαν σε πέψη χρησιμοποιώντας ενδονουκλεάσες BamHI και Το κλωνοποιημένο στέλεχος αναλύεται σε αλληλουχία και το πλασμίδιο εκχυλίζεται μετά από σωστή αλληλούχιση. Το πλασμίδιο pET-28a-CtCHS που επαληθεύτηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας μεταφέρθηκε σε ικανά κύτταρα Escherichia coli BL21 (DE3). Ανατρέξτε στη μέθοδο των Ding Ning et al. [17] με ισοπροπύλιο

Η -D-θειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG) χρησιμοποιήθηκε για την πρόκληση έκφρασης πρωτεΐνης σε χαμηλή θερμοκρασία και καθαρίστηκε μέσω στήλης χρωματογραφίας συγγένειας Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Η πρωτεΐνη συμπυκνώθηκε με φυγοκέντρηση σε σωλήνα υπερδιήθησης (Millipore, 30 000) και αφαλατώθηκε. Φυλάσσετε σε ρυθμιστικό διάλυμα KPB 20 mmol/L (pH 8,0, που περιέχει 1 mmol/LEDTA) και φυλάξτε το σε ψυγείο -80 βαθμούς για μακροχρόνια αποθήκευση.

2.5 Ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας CtCHS

Σύστημα ενζυμικής αντίδρασης CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-κουμαροϋλ-CoA 2 μL, CtCHS ανασυνδυασμένο πρωτεΐνη 20 μL, σε Μετά από αντίδραση σε υδατόλουτρο στους 37 βαθμούς για 12 ώρες, το μείγμα εκχυλίστηκε τρεις φορές με 800 μL οξικού αιθυλεστέρα, ξηράνθηκε με ροή αζώτου και στη συνέχεια διαλύθηκε σε 100 μL μεθανόλης. Χρησιμοποιήστε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για την ανίχνευση του προϊόντος. Οι συνθήκες είναι στήλη Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), θερμοκρασία στήλης 30 μοίρες, όγκος δείγματος 10 μL και νερό (Α) και ακετονιτρίλιο (Β) ως ροή. Φάση, βαθμίδα έκλουσης: 0~10

min, 30% Β; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100 % B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Ο ογκομετρικός ρυθμός ροής είναι 1 mL/min και η ανίχνευση είναι σε μήκος κύματος 290 nm.

Το UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανίχνευση. Οι συνθήκες υγρής φάσης ήταν στήλη Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), θερμοκρασία στήλης 40 βαθμοί, naringenin- ελέγχους χαλκόνης και ναρινγενίνης. Ο όγκος φόρτωσης του προϊόντος είναι 4 μL και ο όγκος φόρτωσης του προϊόντος της ενζυμικής αντίδρασης είναι 7 μL. Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται νερό (Α)-ακετονιτρίλιο (Β). Η βαθμίδα έκλουσης είναι: 0 έως 5 λεπτά, 30% Β. 5 έως 15 λεπτά, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Ο ογκομετρικός ρυθμός ροής είναι 0,3 mL/min. Οι συνθήκες φασματομετρίας μάζας είναι πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού, άζωτο ως φέρον αέριο, πίεση αερίου περιβλήματος 3,5 MPa, πίεση βοηθητικού αερίου 1,0 MPa, πίεση ψεκασμού 3500 V, θερμοκρασία τριχοειδούς 350 μοίρες, θερμοκρασία θέρμανσης βοηθητικού αερίου 200 μοίρες, θετικές και αρνητικές λειτουργίες ιόντων, σάρωση Το εύρος ιόντων m/z είναι 100-1500, η ανάλυση πλήρους MS είναι 35 000, η ανάλυση dd-MS2 είναι 17 500, (N)

CE/stepped nce ορίστηκε σε 35, 60.

2.3 Βιοπληροφορική ανάλυση

Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό λογισμικό ProtParam για να αναλύσετε τις φυσικές και χημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο Prot Scale για να αναλύσετε την υδροφιλία/υδροφοβία των πρωτεϊνών. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο SOPMA για να προβλέψετε τη δευτερογενή δομή πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό λογισμικό ανάλυσης SWISS-MODEL για να προβλέψετε την τριτογενή δομή πρωτεΐνης. χρήση διαδικτυακού λογισμικού TMHMM Πρόβλεψη της διαμεμβρανικής δομής της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό DNAMAN για να συγκρίνετε την ομολογία του CtCHS με τις αλληλουχίες αμινοξέων CHS άλλων ειδών. χρησιμοποιήστε το λογισμικό MEGA-X για να κατασκευάσετε ένα φυλογενετικό δέντρο, χρησιμοποιώντας γειτονική ένωση (NJ) και διόρθωση Poisson Η εξελικτική απόσταση υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bootstrap και ο αριθμός των επαναλήψεων Bootstrap είναι 1000 φορές.

2.4 CtCHS προκαρυωτική έκφραση και καθαρισμός

Σχεδιάστε εκκινητές με θέσεις περιορισμού BamHⅠ και XhoⅠ με βάση την αλληλουχία CtCHS και η PCR ενισχύουν τα αντίστοιχα θραύσματα στόχου. Ο φορέας pET-28και το θραύσμα στόχος υποβλήθηκαν σε πέψη χρησιμοποιώντας ενδονουκλεάσες BamHI και Το κλωνοποιημένο στέλεχος αναλύεται σε αλληλουχία και το πλασμίδιο εκχυλίζεται μετά από σωστή αλληλούχιση. Το πλασμίδιο pET-28a-CtCHS που επαληθεύτηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας μεταφέρθηκε σε ικανά κύτταρα Escherichia coli BL21 (DE3). Ανατρέξτε στη μέθοδο των Ding Ning et al. [17] με ισοπροπύλιο

Η -D-θειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG) χρησιμοποιήθηκε για την πρόκληση έκφρασης πρωτεΐνης σε χαμηλή θερμοκρασία και καθαρίστηκε μέσω στήλης χρωματογραφίας συγγένειας Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Η πρωτεΐνη συμπυκνώθηκε με φυγοκέντρηση σε σωλήνα υπερδιήθησης (Millipore, 30 000) και αφαλατώθηκε. Φυλάσσετε σε ρυθμιστικό διάλυμα KPB 20 mmol/L (pH 8,0, που περιέχει 1 mmol/LEDTA) και φυλάξτε το σε ψυγείο -80 βαθμούς για μακροχρόνια αποθήκευση.

2.5 Ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας CtCHS

Σύστημα ενζυμικής αντίδρασης CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-κουμαροϋλ-CoA 2 μL, CtCHS ανασυνδυασμένο πρωτεΐνη 20 μL, σε Μετά από αντίδραση σε υδατόλουτρο στους 37 βαθμούς για 12 ώρες, το μείγμα εκχυλίστηκε τρεις φορές με 800 μL οξικού αιθυλεστέρα, ξηράνθηκε με ροή αζώτου και στη συνέχεια διαλύθηκε σε 100 μL μεθανόλης. Χρησιμοποιήστε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για την ανίχνευση του προϊόντος. Οι συνθήκες είναι στήλη Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), θερμοκρασία στήλης 30 μοίρες, όγκος δείγματος 10 μL και νερό (Α) και ακετονιτρίλιο (Β) ως ροή. Φάση, βαθμίδα έκλουσης: 0~10

min, 30% Β; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100 % B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Ο ογκομετρικός ρυθμός ροής είναι 1 mL/min και η ανίχνευση είναι σε μήκος κύματος 290 nm.

Το UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανίχνευση. Οι συνθήκες υγρής φάσης ήταν στήλη Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), θερμοκρασία στήλης 40 βαθμοί, naringenin- ελέγχους χαλκόνης και ναρινγενίνης. Ο όγκος φόρτωσης του προϊόντος είναι 4 μL και ο όγκος φόρτωσης του προϊόντος της ενζυμικής αντίδρασης είναι 7 μL. Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται νερό (Α)-ακετονιτρίλιο (Β). Η βαθμίδα έκλουσης είναι: 0 έως 5 λεπτά, 30% Β. 5 έως 15 λεπτά, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Ο ογκομετρικός ρυθμός ροής είναι 0,3 mL/min. Οι συνθήκες φασματομετρίας μάζας είναι πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού, άζωτο ως φέρον αέριο, πίεση αερίου περιβλήματος 3,5 MPa, πίεση βοηθητικού αερίου 1,0 MPa, πίεση ψεκασμού 3500 V, θερμοκρασία τριχοειδούς 350 μοίρες, θερμοκρασία θέρμανσης βοηθητικού αερίου 200 μοίρες, θετικές και αρνητικές λειτουργίες ιόντων, σάρωση Το εύρος ιόντων m/z είναι 100-1500, η ανάλυση πλήρους MS είναι 35 000, η ανάλυση dd-MS2 είναι 17 500, (N)

CE/stepped nce ορίστηκε σε 35, 60.

2.6 Υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης CtCHS

Με βάση την αλληλουχία CtCHS και την αρχή της απρόσκοπτης κλωνοποίησης, σχεδιάστηκαν εκκινητές με θέσεις κοπής ενζύμου Kpn Ⅰ και BamH Ⅰ και τα αντίστοιχα θραύσματα στόχου ενισχύθηκαν με PCR. Το πλασμίδιο pCAMBIA1300-35S-GFP υποβλήθηκε σε πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Kpn Ⅰ και BamH Ⅰ και το θραύσμα στόχος και ο φορέας συνδέθηκαν μέσω του κιτ κλωνοποίησης χωρίς ραφή (Novizan, Cat C115-01) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κατάλληλα κύτταρα E. coli DH5. , επιλέξτε στελέχη μεμονωμένων κλώνων για αλληλούχιση και εκχυλίστε πλασμίδια από τα σωστά στελέχη. Τα πλασμίδια pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS και pCAMBIA 1300-35S-GFP μετασχηματίστηκαν σε πρωτοπλάστες Arabidopsis thaliana χρησιμοποιώντας PEG4000 και καλλιεργήθηκαν υπό χαμηλό φως για 8 έως 10 ώρες. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης CtCHS παρατηρήθηκε κάτω από ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ.

2.7 Ανάλυση προτύπων έκφρασης CtCHS

Οι ποσοτικοί εκκινητές φθορισμού πραγματικού χρόνου σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας DNAMAN με βάση την αλληλουχία CtCHS, με το F-box ως το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1. Η σχετική έκφραση του CtCHS σε άνθη Cistanche tubulosa διαφορετικών χρωμάτων ανιχνεύθηκε με φθορίζουσα ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο. Χρησιμοποιήστε το TransStart Green qPCR SuperMix (full gold, AQ101-02) για μέτρηση με τη μέθοδο φθορίζουσας βαφής SYBRGreen. Σύστημα αντίδρασης: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, εκκινητές ανάντη και κατάντη (10 μmol/L) 0.2 μL το καθένα, πρότυπο cDNA 0,5 μL, χρησιμοποιήθηκαν 4,1 μL νερού χωρίς νουκλεοτιδάση για την αντίδραση χρησιμοποιώντας μέθοδο δύο σταδίων. Η διαδικασία αντίδρασης βασίστηκε στη μέθοδο των Dong Xianjuan et al. [18]. Κάθε δείγμα περιείχε 3 βιολογικά αντίγραφα και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα πειραματικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Excel, η σχετική έκφραση του CtCHS υπολογίστηκε με τη μέθοδο 2−ΔΔCt και το GraphPadPrism 8 χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ανάλυσης σημασίας και τη σχεδίαση ιστογραμμάτων.