Το Cistanoside Of Cistanche Herba Βελτιώνει την ανδρική αναπαραγωγική βλάβη που προκαλείται από την υποξία μέσω της καταστολής του οξειδωτικού στρες-Ⅰ

Εισαγωγή

Επί του παρόντος, περίπου 48,5 εκατομμύρια (15%) ζευγάρια αναπαραγωγικής ηλικίας παγκοσμίως επηρεάζονται από υπογονιμότητα, μεταξύ των οποίων το 40-50% των περιπτώσεων αποδίδεται σε ανδρική υπογονιμότητα, μια κατάσταση που συνδέεται έντονα με περιβαλλοντικούς παράγοντες και παράγοντες του τρόπου ζωής. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η ευαισθησία του όρχεως των θηλαστικών σε χαμηλή πίεση οξυγόνου είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας σε ορισμένες μορφές ανδρικής υπογονιμότητας. Όπως αποδείχθηκε σε προηγούμενες μελέτες, η σπερματογένεση μειώνεται και μειώνεται κατά την έκθεση σε υποβαρική υποξία.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Για να διερευνηθεί ο υποκείμενος μηχανισμός, μελέτες έχουν δείξει ότι η έκθεση σε υποβαρική υποξία αυξάνει την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Το ROS παίζει σημαντικό ρόλο στο ανδρικό αναπαραγωγικό σύστημα. Σε χαμηλά επίπεδα, απαιτούνται για τη χωρητικότητα του σπέρματος, την αντίδραση ακροσωμάτων και τη σύντηξη σπερματοζωαρίων-ωοκυττάρων [10]. Ωστόσο, η υπερβολική ROS μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο πυρηνικό/μιτοχονδριακό DNA του σπέρματος και υπεροξειδωτική βλάβη της πλασματικής μεμβράνης, τα οποία με τη σειρά τους είναι κύριοι αιτιολογικοί παράγοντες για τηναυξημένος κίνδυνος ανδρικής υπογονιμότητας. Έτσι, η συσσώρευση ROS που προκαλείται από υποξία μπορεί να είναι μια αιτία ανδρικής υπογονιμότητας.

Cistanches Herba, ένα πολυετές παρασιτικό φαρμακευτικό φυτό, είναι ευρέως διαδεδομένο σε άνυδρες περιοχές και χρησιμοποιείται ευρέως λόγω των φαρμακολογικών του δραστηριοτήτων. Μεταξύ όλων των αποτελεσματικών περιεχομένων τουCistanches Herba, τα PhGs έχουν θεωρηθεί ως το κύριο δραστικό συστατικό. Μέχρι σήμερα, 34 PhGs έχουν απομονωθεί απόΦυτά Κιστάνι. Κιστανοζίτη(Cis), ένα ενεργό PhG που απομονώθηκε απόCistanches Herba, έχει τραβήξει την προσοχή για την αντιοξειδωτική του δράση.

Λαμβάνοντας υπόψη τις αντιοξειδωτικές επιδράσεις του Cis και τον ρόλο των ROS στην ανδρική υπογονιμότητα που προκαλείται από υποξία, το Cis θεωρείται πιθανό υποψήφιο φάρμακο για τη θεραπεία τηςανδρική υπογονιμότητα που προκαλείται από υποξία. Ωστόσο, λίγες αναφορές έχουν ασχοληθεί με τις αντιοξειδωτικές επιδράσεις του Cis που εξάγεται από το Cistanches Herba στη θεραπεία της ανδρικής υπογονιμότητας που προκαλείται από υποξία ή στις εμπλεκόμενες οδούς σηματοδότησης. Σε αυτή τη μελέτη, κατασκευάστηκαν in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα υποξίας και αξιολογήθηκαν τα συστατικά επιδράσεων διαφορετικών Cis.

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήριο

Η κυτταρική σειρά σπερματογονίας ποντικού GC-1spg (GC-1) αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκε σε DMEM (Invitrogen, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 1% L-γλουταμίνη (100 mM), πενικιλλίνη (100 U/mL) και στρεπτομυκίνη (100 ug/mL) στους 37 βαθμούς σε υγροποιημένο επωαστήρα με 5% CO2. Το Cis (Cis-A, B, C, H) αγοράστηκε από την Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Κίνα).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμάστηκε με δοκιμασία κιτ μέτρησης κυττάρων{{0}} (CCK-8). Εν συντομία, κύτταρα GC-1 σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων σε 1,5×103 ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (20%, 15%, 10%, 5%) οξυγόνου ή διαφορετικές συγκεντρώσεις (2 μΜ, 0,2 μΜ, 0,02 μΜ) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) για τον απαιτούμενο χρόνο. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και ανιχνεύθηκαν βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα κιτ CCK-8 (Dojindo Japan). Η απορρόφηση κάθε φρεατίου μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (BioRad USA). Τέλος, οι βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: Κυτταρική βιωσιμότητα=(ODπειραματική ομάδα - ODblank ομάδα)/ (ομάδα ελέγχου OD - ομάδα ODblank) × 100%.

Ανάλυση Western blot

Τα συλλεχθέντα κύτταρα ή ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA για να εκχυλιστούν πρωτεΐνες (RIPA Beyotime China, Cocktail Roche Switzerland). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση των πρωτεϊνών δοκιμάστηκε με τη μέθοδο BCA (Beyotime). Περίπου 40 μg των εκχυλισμένων πρωτεϊνών από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φίλτρου νιτροκυτταρίνης (NC) (Beyotime China). Οι μεμβράνες φίλτρου NC μπλοκαρίστηκαν με 5% μη λιπαρό γάλα για 1,5 ώρα και επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000 όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, ΗΠΑ) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς. Στη συνέχεια, όλες οι μεμβράνες NC επωάστηκαν με το αντίστοιχο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και απεικονίστηκαν με ένα σύστημα απεικόνισης (Tannon, China).

Ανίχνευση κυτταρικού κύκλου

Πραγματοποιήθηκε μια κυτταρομετρική ανάλυση ροής (FCM) για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία υπό διαφορετικές συνθήκες για 72 ώρες και συλλέχθηκαν. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Για κάθε δείγμα, συλλέχθηκαν 1×104 κύτταρα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACS Calibur, BD Biosciences). Στη συνέχεια, υπολογίστηκε η αναλογία των κυττάρων φάσης G1/S/G2 και ο δείκτης πολλαπλασιασμού [Φάση(S+G2)/Φάση(G1+S+G2) × 100%].

Χρώση Ki-67

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα ομοεστιακό τρυβλίο και υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποξία ή διαφορετικούς υποτύπους Cis για 72 ώρες. Μετά τη στερέωση όλων των κυττάρων με 4% παραφορμαλδεΰδη, επωάστηκαν με ένα αντίσωμα anti-Ki-67 (1:200, Τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης). Στη συνέχεια, όλα τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντίστοιχο CY-3-συζευγμένο αντίσωμα κατά IgG κουνελιού (1:200, Boster, China) και διάλυμα DAPI (1,0 μg/mL, Beyotime). Ο φθορισμός παρατηρήθηκε με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο Fluoview FV1000 (Olympus, Ιαπωνία).

ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ CISTANCHE TUBULOSA TOP-TIER CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΤΕΣΤΟΣΤΕΡΟΝΗΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ανίχνευση ROS

Το FCM εισήχθη για τη μέτρηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων ROS χρησιμοποιώντας DCFH-DA. Τα αιωρούμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων και υποβλήθηκαν σε διαφορετικές επεξεργασίες. Μετά από 72 ώρες θεραπείας, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε DMEM χωρίς ορό με 10 μΜ DCFH-DA (Beyotime). Τα περιεχόμενα ROS στη συνέχεια προσδιορίστηκαν με ταξινόμηση κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό σε ένα σύστημα κυτταρομετρίας ροής Beckman Coulter με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και μήκος κύματος εκπομπής 525 nm [18].

Προσδιορισμός της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (LPO)

Η δοκιμασία αντιδραστικών ουσιών με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS) πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση LPO. Όλα τα βήματα λειτουργίας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες (Sigma USA). Οι συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν μοριακό συντελεστή απόσβεσης 1,56×105/(M·cm), ο οποίος ελήφθη χρησιμοποιώντας μηλονδιαλδεΰδη ως πρότυπο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως nmol ισοδυνάμων MDA/mg πρωτεΐνης.

Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστηριότητας

Οι ενζυμικές δραστηριότητες δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας που περιλαμβάνουν αναγωγάση γλουταθειόνης (GR), υπεροξειδάση γλουταθειόνης (GPx) και δισμουτάση υπεροξειδίου (SOD). Όλα τα βήματα λειτουργίας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Ζώα και Πειραματικό Πρωτόκολλο

Ώριμοι αρσενικοί αρουραίοι Wistar (180-220 γρ., 8 β.) ελήφθησαν από το κέντρο ζώων του Τέταρτου Στρατιωτικού Ιατρικού Πανεπιστημίου, Xi'an, Κίνα. Η άδεια χρήσης των ζώων λήφθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου (Αριθμός αναφοράς: 20190506). Το πείραμα σε ζώα πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις πανεπιστημιακές οδηγίες για τη φροντίδα και τη χρήση πειραματόζωων.

Όλοι οι αρουραίοι αφέθηκαν να προσαρμοστούν για περίπου 1 εβδομάδα πριν από την έναρξη του πειράματος. Μετά τον εγκλιματισμό, οι αρουραίοι κατανεμήθηκαν τυχαία σε 6 ομάδες με 5 ζώα σε κάθε ομάδα. Οι αρουραίοι στην ομάδα ελέγχου ανατράφηκαν υπό κανονική πίεση (PO2: 20%, πίεση αέρα: 101,3 kPa), ενώ οι αρουραίοι στο μοντέλο και στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με Cis ανατράφηκαν σε θάλαμο οξυγόνου χαμηλής πίεσης (εσωτερική πίεση 61,6 kPa , ισοδύναμο με ύψος 4000 μέτρων πάνω από την επιφάνεια της θάλασσας: 14,55%) για προσομοίωση υποξικού περιβάλλοντος σε μεγάλο υψόμετρο. Όλοι οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό σε πλαστικά κλουβιά στους 22 ± 2 βαθμούς και συνθήκες υγρασίας με αυτόματο 12-ωρο κύκλο φωτός/σκότους. Οι αρουραίοι στο μοντέλο και στις ομάδες που έλαβαν Cis παρέμειναν σε υποβαρικές συνθήκες αλλά μεταφέρονταν σε νορμοβαρικές συνθήκες κάθε 96 ώρες, οπότε τους παρείχαν τροφή και νερό και τα κλουβιά καθαρίζονταν. Η διάρκεια της μετάβασης από υποβαρικό σε υποβαρικό ήταν περίπου 2 ώρες. Όλες οι ομάδες θεραπείας υποβλήθηκαν σε αγωγή με το αντίστοιχο Cis (8 mg/kg/ημέρα) μέσω στοματικής καθετήρα για 8 εβδομάδες, ενώ οι αρουραίοι ελέγχου και μοντέλου υποβλήθηκαν σε αγωγή με ίσο όγκο νερού.

Μετά από 8 εβδομάδες, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν υπό αναισθησία. Οι όρχεις, η επιδιδυμίδα και τα σπερματικά κυστίδια διαχωρίστηκαν και ζυγίστηκαν και ο δείκτης οργάνου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: (βάρος οργάνου/βάρος ζώου) × 100%. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν σπερματοζωάρια στην επιδιδυμίδα και δοκιμάστηκαν η κινητικότητά τους και η ενζυμική δράση των ακροσωμάτων. Παρομοίως, συλλέχθηκαν ιστοί όρχεων για ιστοπαθολογικές μελέτες και ανίχνευση ROS, LPO και αντιοξειδωτικής ενζυμικής δραστηριότητας.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT CISTANCHE HERB INCREASE SEX POWER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Αξιολόγηση του ρυθμού ζωντανού σπέρματος

Η επιδιδυμίδα κόπηκε με χειρουργικό ψαλίδι και το εναιώρημα σπέρματος παρασκευάστηκε σε φυσιολογικό ορό. Για να αξιολογηθεί ο ρυθμός ζωντανού σπέρματος, 5 μL του εναιωρήματος σπέρματος αναμίχθηκαν προσεκτικά με ίσο όγκο χρώσης ηωσίνης-Υ. Στη συνέχεια τα σπερματοζωάρια μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Οι ρυθμοί ζωντανών σπερματοζωαρίων αξιολογήθηκαν με υπολογισμό τόσο του χρωματισμένου (νεκρού σπέρματος) όσο και του μη χρωματισμένου σπέρματος (ζωντανού σπέρματος).

Προσδιορισμός ενζυμικής δραστηριότητας ακροσωμάτων σπέρματος

Η δοκιμασία ενζυμικής δραστηριότητας ακροσωμάτων σπέρματος χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των ενζύμων ακροσωμάτων του σπέρματος [19]. Τα αποτελέσματα σε κάθε ομάδα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Δραστηριότητα ενζύμου Acrosome (μIU)=(ODExperiment group - ODBlank group)/(247,5×10) × 106.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της υποξίας σε κύτταρα GC-1

Για να προσδιορίσουμε τις επιπτώσεις της υποξίας στα γεννητικά κύτταρα, εξετάσαμε πρώτα τις αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία υποξίας με διαφορετικές συγκεντρώσεις οξυγόνου (20%, 15%, 10% και 5%) για 1, 3, 5 , και 7 ημέρες, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας CCK-8 έδειξαν ότι σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (συγκέντρωση οξυγόνου 20%), τα κύτταρα που εκτέθηκαν σε υποξία εμφάνισαν σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα (Ρ < 0,01· Εικόνα 1Α). Επιπλέον, το ποσοστό επιβίωσής τους ήταν αντιστρόφως ανάλογο με τη συγκέντρωση οξυγόνου και μειώθηκε περαιτέρω με το χρόνο επαγωγής. Για να αποφευχθεί μια υπερβολική κυτταροτοξική επίδραση, μια συγκέντρωση οξυγόνου 10% και ο χρόνος επαγωγής 3-ημέρας επιλέχθηκαν ως κριτήρια υποξικού μοντέλου για μετέπειτα πειράματα in vitro.

Στη συνέχεια, διεξήχθη χρώση FCM και ανοσοφθορισμού για την περαιτέρω αξιολόγηση της μεταβολής πολλαπλασιασμού των κυττάρων GC{{0}} υπό θεραπεία υποξίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υποξία θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή των κυττάρων GC-1 στη φάση G1, μειώνοντας έτσι την είσοδο των κυττάρων στη φάση S και αναστέλλοντας την αντιγραφή του DNA. Έτσι, η υποξία μείωσε σημαντικά τον δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων GC-1 (Ρ < 0,01, Εικόνα 1Β). Η θετική χρώση Ki-67 είναι ένας άλλος συγκεκριμένος βιοδείκτης των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Επομένως, εξετάσαμε επίσης την αναλογία των θετικών κυττάρων Ki{{8} με ή χωρίς θεραπεία υποξίας. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η θεραπεία υποξίας μείωσε σημαντικά τα θετικά Ki-67-κύτταρα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1C.

Στη συνέχεια, στοχεύσαμε να διερευνήσουμε τον τρόπο αναστολής της βιωσιμότητας των κυττάρων GC{{0}} που προκαλείται από την υποξία. Όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία, το επίπεδο του ROS αυξήθηκε καθώς οι αρουραίοι εκτέθηκαν σε ένα υποβαρικό υποξικό περιβάλλον [8, 20]. Ως εκ τούτου, τα ενδογενή επίπεδα ROS σε κύτταρα GC-1 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία FCM. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλότερα επίπεδα ROS υπό υποξία σε σύγκριση με την ομάδα φυσιολογικού οξυγόνου (P < 0,01, Εικόνα 1D). Το συσσωρευμένο ROS προκαλεί σημαντική έκπτωση του DNA, το οποίο με τη σειρά του προκαλεί ενεργοποίηση της οδού κυτταρικής απόπτωσης και μπορεί να είναι ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας για τον αυξανόμενο κίνδυνο ανδρικής υπογονιμότητας [21, 22]. Στη συνέχεια, εντοπίσαμε το αποτέλεσμα της αποπτωτικής ενεργοποίησης της υποξίας σε κύτταρα GC-1 με χρώση TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Ε, η θεραπεία με υποξία οδήγησε σε αύξηση του φθορισμού TUNEL σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, υποδεικνύοντας αύξηση της απόπτωσης στην ομάδα μοντέλου.

Εφόσον η κυτταρική βλάβη που προκαλείται από το ROS προκαλείται συνήθως από το λειτουργικό σύστημα, δοκιμάσαμε περαιτέρω το λειτουργικό σύστημα των κυττάρων GC-1. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 1ΣΤ, τα επίπεδα LPO των κυττάρων GC-1 στην ομάδα μοντέλου αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα επίπεδα LPO των κυττάρων GC-1 στην ομάδα ελέγχου. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο τραυματισμός των κυττάρων GC{6}} που προκαλείται από υποξία μπορεί να σχετίζεται με το OS, το οποίο προκαλείται από τη συσσώρευση ROS.