Το Cistanche Tubulosa προστατεύει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες μέσω της ρύθμισης της απόπτωσης και του νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται από νευρογλοιακά κύτταρα: in Vivo και in vitro-Ⅰ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η νόσος του Πάρκινσον (PD) είναι μια κοινή νευροεκφυλιστική νόσος που εμφανίζεται σε ηλικιωμένα άτομα με παθολογικές εκδηλώσεις απώλειας ντοπαμινεργικών νευρώνων στη μέλαινα ουσία (SN) λόγω εκφυλισμού. Η σοβαρότητα της νόσου συσχετίζεται με την απώλεια νευρωνικών κυττάρων ντοπαμίνης (DA) στο SN, η οποία συνάδει με την άποψη ότι η νευροεκφυλιστική διαδικασία εξελίσσεται για πολλά χρόνια πριν εμφανιστούν συμπτώματα (Sawle και Myers, 1993). Η προοδευτική φύση της νόσου υποδηλώνει ενδιαφέρουσες δυνατότητες για θεραπευτική παρέμβαση αναστέλλοντας την υποκείμενη νευροεκφυλιστική διαδικασία. Η αναζήτηση για ισχυρές και ειδικές δράσεις νευροτροφικών παραγόντων στην επιβίωση του νευρώνα DA έχει ως εκ τούτου σημαντικό ενδιαφέρον.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR PROTECT DOPAMINERGIC NEURONS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Οι νευροτροφικοί παράγοντες είναι βασικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένου του νευρικού αυξητικού παράγοντα (NGF), του νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF) και του νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται από νευρογλοιακά κύτταρα (GDNF), οι οποίοι προάγουν την ανάπτυξη των νεύρων, τη νευρολογική ανάπτυξη, την αξονική καθοδήγηση και τη νευρωνική λειτουργία. Μεταξύ όλων των νευροτροφικών παραγόντων που προστατεύουν και προάγουν την επιδιόρθωση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, το GDNF έχει τα ισχυρότερα αποτελέσματα (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Το GDNF έχει αποδειχθεί ότι έχει ισχυρά νευροτροφικά αποτελέσματα στους νευρώνες DA in vitro (Lin et al., 1993) και ότι ασκεί νευροπροστατευτικά αποτελέσματα in vivo. Το GDNF έχει αποδειχθεί ότι διασώζει τους νευρώνες DA από κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από βλάβες μετά από χειρουργική ή τοξίνη επαγόμενη αξοτομία σε αρουραίους (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) και εν μέρει επίσης μετά από συστηματική χορήγηση τουΝ-μεθυλ-4-φαινυλ-1, 2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη (MPTP)σε ποντίκια (Tomac et al., 1995). Η αυξημένη επίπτωση της νευρωνικής απόπτωσης και η μειωμένη προστατευτική δράση των νευροτροφικών παραγόντων, που δυνητικά προκαλούνται από διάφορους παθολογικούς παράγοντες, αποτελούν τη βάση του εκφυλισμού των ντοπαμινεργικών νευρώνων (Holden et al., 2006).

Το C. tubulosa είναι ένα φυτικό φάρμακο που προέρχεται από πολλά φυτά του γένους Cistanche. Είναι μια σημαντική θεραπευτική επιλογή για το σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας που σχετίζεται στενά με τις ορμόνες των ανδρογόνων στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM). Μέχρι σήμερα, πολλές κλινικές και βασικές έρευνες για το C. tubulosa έχουν δείξει τις δραστηριότητες των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Ο προσδιορισμός των συνταγών τονωτικών νεφρών TCM στη θεραπεία της PD μπορεί επομένως να παρέχει μια εναλλακτική κλινική θεραπεία για την PD.Εχινακοσίδη (ECH)είναι ένα σημαντικό βιοδραστικό συστατικό που βρίσκεται στο φαρμακευτικό βότανο C. tubulosa. Μελέτες έχουν δείξει τα θεραπευτικά αποτελέσματα των γλυκοσιδών του Cistanche και του ECH,βερμπασκοσίδη(VER) και ικαριίνη (ICA) σε ασθενείς με νόσο του Alzheimer (AD), PD και άλλους ασθενείς με αγγειακή άνοια (Urano and Tohda, 2010· Wang et al., 2013· Wu et al., 2014). Οι Wu et al. (2014) πρότεινε ότι τα εκχυλίσματα C. tubulosa που περιείχαν αρκετή ECH και ακτεοσίδη βελτίωσαν τη γνωστική δυσλειτουργία που προκαλείται από το A -42 μέσω του αποκλεισμού της εναπόθεσης αμυλοειδούς και της αντιστροφής της χολινεργικής και ιπποκαμπικής ντοπαμινεργικής νευρωνικής λειτουργίας. Οι Tao et al. (2015) διαπίστωσε ότιφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδεςαπό το C. tubulosa (Ph Gs-Ct) απέτρεψε το εγκεφαλικό οίδημα σε μεγάλο υψόμετρο μειώνοντας την έκφραση πρωτεΐνης και mRNA του AQP4 στον εγκεφαλικό ιστό μοντέλων αρουραίου.

ΣΝΑΚ ΦΥΣΙΚΟΥ CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΜΝΗΜΗΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι κινεζικές φυτικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των τριών συστατικών των C. tubulosa, epimedium και rhizoma polygonati, μετριάζουν τη βλάβη στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες και αύξησαν τα επίπεδα ντοπαμίνης ρυθμίζοντας την έκφραση νευροτροφικών παραγόντων (Wu et al., 2013). Έτσι, δεν είναι ακόμη γνωστό εάν τα νευροπροστατευτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από το C. tubulosa είναι μακροχρόνια και σε ποιο βαθμό η διάσωση των νευρώνων DA με τη χορήγηση του GDNF μπορεί να προσφέρει σημαντική διατήρηση των κινητικών συμπεριφορών που σχετίζονται με τη συμπτωματολογία των ζώων με PD. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε μια συνταγή τονωτικής νεφρικής TCM, τη νανοσκόνη C. tubulosa, η οποία έχει λάβει εθνικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (αριθμός διπλώματος ευρεσιτεχνίας: 2011103028541) στην Κίνα και έχει δείξει προηγουμένως ένα συγκεκριμένο θεραπευτικό αποτέλεσμα στην PD. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να εξετάσει τις νευροπροστατευτικές και αναγεννητικές επιδράσεις της θεραπείας με C. tubulosa και να διερευνήσει την απόπτωση στα κύτταρα MES23.5 και τους οριστικούς αρουραίους της συμπεριφοράς και τη ρύθμιση του GDNF, όπως μετρήθηκε με μια σειρά δοκιμών-στόχων .

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Υλικά, Αντιδραστήρια και Εξοπλισμός

Το C. tubulosa αγοράστηκε από την Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, China. Τα ECH, VER και ICA προέρχονται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Ελέγχου Τροφίμων και Φαρμάκων της Κίνας. Η ντοπαμινεργική νευρωνική κυτταρική σειρά MES23.5 ήταν δώρο από τον καθηγητή Biao Chen, Εργαστήριο Νευροβιολογίας, Capital Medical University, Πεκίνο, Κίνα. Πενήντα αρσενικά ποντίκια C57BL/6 (με βάρος 20–25 g το καθένα) αγοράστηκαν από τη Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (αριθμός άδειας: SCXK2012-0002), Σαγκάη, Κίνα.

ΜΡΡ+, ΜΤΤ και γλουταμίνη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ΗΠΑ). Το μέσο DMEM/F12 και ο εμβρυϊκός βόειος ορός αγοράστηκαν από την Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). και MPTP, πρότυπο DA και πρότυπο ομοβανιλικού οξέος (HVA) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). Αντισώματα -ακτίνη, Bax, Bcl2, GDNF, άλφα υποδοχέα οικογένειας GDNF (GFR 1) και Ret αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, ΜΑ, ΗΠΑ). Το κιτ αντιδραστηρίου χρώσης 3,3'-διαμινοβενζιδίνης (DAB) αγοράστηκε από την Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Κίνα). και κιτ προετοιμασίας δειγμάτων γέλης SDS-PAGE, κιτ ανίχνευσης υπερευαίσθητης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) και δοκιμασία δικινχονικού οξέος (BCA) αγοράστηκαν από το Beyotime Institute of Biotechnology (Πεκίνο, Κίνα).

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε τα ακόλουθα όργανα: ELX800 συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Bio Tek Winooski, VT, ΗΠΑ). θερμοκοιτίδα CO2 (Heraeus, Hanau, Γερμανία); Σύστημα ανάλυσης απεικόνισης gel DOC 2000, κυψέλη ηλεκτροφόρησης και δεξαμενή ηλεκτροφόρησης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Αναλυτής πρωτεΐνης DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, ΗΠΑ); 5417R φυγόκεντρος ψύξης υψηλής ταχύτητας (Eppendorf, Αμβούργο, Γερμανία). SXQM διπλός πλανητικός μύλος σφαιρών (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Χουνάν, Κίνα). Μύλος ανάμιξης MM400 (Retsch GmbH, Haan, Γερμανία); Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic ηλεκτροφόρηση, PowerPac Basic διαμεμβρανικό σύστημα μεταφοράς, Universal Hood II απεικόνιση χημειοφωταύγειας, S1000 Thermal Cycler RNA σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Bio-Rad). Σύστημα ανάλυσης εικόνας ιστών και κυττάρων Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Κίνα).

Προετοιμασία τουC. tubulosaΝανοσκόνη

Το C. tubulosa ζυγίστηκε, στη συνέχεια καθαρίστηκε και αφυδατώθηκε. Μετά από συμβατική κονιοποίηση, η λεπτή σκόνη C. tubulosa περάστηκε από 200-πλέγμα και λυοφιλοποιήθηκε. Ένας μύλος κενού ελεγχόμενης θερμοκρασίας και υψηλής ενέργειας σφαιρόμυλος χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή της νανοσκόνης C. tubulosa. Αρχικά, η ακατέργαστη νανοσκόνη C. tubulosa τοποθετήθηκε σε μια δεξαμενή άλεσης με σφαίρα κενού που ήταν φορτωμένη με σφαίρες λείανσης καρβιδίου. Η αναλογία μεταξύ των σφαιρών λείανσης και της νανοσκόνης C. tubulosa κυμαινόταν από 15:1 έως 5:1. Για να ληφθεί μια λεπτή σκόνη, η ταχύτητα και η διάρκεια του μύλου υψηλής ενέργειας ρυθμίστηκαν στις 300 rpm και 20 λεπτά, αντίστοιχα. Η λεπτή σκόνη ζυγίστηκε για την επεξεργασία υλικών νανοκλίμακας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία στον μύλο ανάμιξης με συχνότητα 25/s και ταλάντωση 20 δευτερολέπτων για τρεις επαναλήψεις. Το PBS χρησιμοποιήθηκε για τη διάλυση και την παρασκευή ενός μητρικού διαλύματος 25 mg/mL, ακολουθούμενο από 30 λεπτά υπερήχων, αποστείρωση σε αυτόκλειστο και τελικά αποθήκευση στους -20°C.

Ποιοτικός Έλεγχος των Ενεργών Στοιχείων τουC. tubulosaμε HPLC

Τα ECH και VER περιείχαν έκλουση βαθμίδωσης με οκταδεκυλοσιλάνιο δεσμευμένο πυρίτιο ως πληρωτικό, μεθανόλη ως κινητή φάση Α και 0.1% διάλυμα μυρμηκικού οξέος ως κινητή φάση Β. Το μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν 330 nm. Το ICA περιείχε βαθμιδωτή έκλουση με πυρίτιο συνδεδεμένο με οκταδεκυλοσιλάνιο ως πληρωτικό και ακετονιτρίλιο-νερό (30:70) ως κινητή φάση. Το μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν 270 nm. Το δείγμα, ο έλεγχος και ο αρνητικός έλεγχος μετρήθηκαν ως 10 μL το καθένα για τη δοκιμή.

Κυτταρική καλλιέργεια και ανάλυση MTT για τη μέτρηση της βιωσιμότητας της MPP+-Θεραπευμένα κύτταρα

Τα κύτταρα MES23.5 εμβολιάστηκαν με 5% ορό εμβρύου μόσχου, 1% γλουταμίνη, 2% 50× διάλυμα Sato και μέσο DMEM/F12 με 2% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη. Επωάστηκαν στους 37◦C σε επωαστήρα 5% CO2 με κορεσμένη υγρασία. Τα κύτταρα απομονώθηκαν και διαβιβάστηκαν με 0,25% θρυψίνη και το κυτταρικό εναιώρημα συλλέχτηκε στη φάση λογαριθμικής ανάπτυξης. Απομονωμένα κύτταρα με πυκνότητα 1 × 105 σπάρθηκαν σε πλάκες φρεατίων επικαλυμμένων με πολυλυσίνη, ακολουθούμενη από την προσθήκη διαφορετικών τελικών συγκεντρώσεων (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 και 800 μmol/L ) των μέσων MPP+. Κύτταρα MES23.5 που επωάστηκαν με κανονικό μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες και 48 ώρες χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι στα πειράματα in vitro. Τα κύτταρα από τις διαφορετικές ομάδες θεραπείας επωάστηκαν με αντιδραστήριο ΜΤΤ για 4 ώρες. Το διάλυμα στα φρεάτια στη συνέχεια απορρίφθηκε και προστέθηκαν 150 μL DMSO και ταλαντώθηκαν για 10 λεπτά. Η απορρόφηση κάθε δείγματος σε μήκος κύματος 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αυτόματο αναγνώστη μικροπλάκας. Το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας (%)=μέση απορρόφηση της πειραματικής ομάδας/μέση απορρόφηση της ομάδας αρνητικού ελέγχου × 100%.

Σχετικές συγκεντρώσεις μέσου MPP+ προστέθηκαν για την 24-ωριαία θεραπεία σε κύτταρα MES23.5 χρησιμοποιώντας την ίδια προσέγγιση όπως και για την in vitro καλλιέργεια. Μετά την επεξεργασία, το διάλυμα στο φρεάτιο απορρίφθηκε. Μέσα που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 50, 100, 200, 250, 500 και 1000 μg/mL) νανοσκόνης C. tubulosa προστέθηκαν στα κύτταρα MES23.5 σε διαφορετικά φρεάτια και αφέθηκαν να επωαστούν για 24 ώρες και 48 ώρες. Τα κύτταρα MES23.5 που επωάστηκαν με κανονικό μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες και 48 ώρες χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα κύτταρα MES23.5 που επωάστηκαν με μέσο MPP+ χρησιμοποιήθηκαν ως φορέας. Οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Η απορρόφηση των αντίστοιχων ομάδων θεραπείας και ελέγχου μετρήθηκε για τον υπολογισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων.

ΦΥΣΙΚΌ CISTANCHE TUBULOSA ΕΚΧΎΛΙΣΜΑ ΑΝΤΙ ΚΌΠΩΣΗ PHGS75% 25 ECH 30% 25 ACT 12% 25

Έκφραση ΤΗ Μετρημένη με Ανοσοκυτταροχημεία

Όταν η νανοσκόνη C. tubulosa ήταν σε 100, 200 και 250 μg/ml, το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά (Εικόνα 2G). Έτσι, σε επόμενα πειράματα, δοκιμάσαμε τις τρεις συγκεντρώσεις: ομάδες χαμηλής δόσης, μεσαίας δόσης και υψηλής δόσης. Τρεις επαναλήψεις δοκιμάστηκαν για καθεμία από τις ομάδες C. tubulosa. Αποστειρωμένες, επικαλυμμένες με πολυλυσίνη καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων. Στη συνέχεια, 5 χ 104 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες. Το συμβατικό φρέσκο ​​μέσο αντικαταστάθηκε στην κανονική ομάδα ελέγχου και μια τελική συγκέντρωση 100 μmol/L μέσου MPP+ αντικαταστάθηκε στις υπόλοιπες ομάδες θεραπείας για επώαση για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα συμβατικά φρέσκα μέσα αντικαταστάθηκαν στις ομάδες φυσιολογικού ελέγχου και φορέα και οι τελικές συγκεντρώσεις 100, 200 και 250 μg/mL νανοσκόνης C. tubulosa επωάστηκαν με τα κύτταρα για 24 ώρες στη χαμηλή, μέτρια και υψηλή δόση Ομάδες θεραπείας C. tubulosa, αντίστοιχα. Τα κύτταρα MES23.5 στις διαφορετικές ομάδες πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS για να απομακρυνθεί το υπερκείμενο και σταθεροποιήθηκαν περαιτέρω σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με έναν αναστολέα υπεροξειδάσης στους 37°C για 30 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν ξανά με PBS. Ένα διάλυμα 0,2% Triton X-100 χρησιμοποιήθηκε για διαπερατότητα κυττάρων για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από πλύση με PBS. Σε κάθε δείγμα προστέθηκε κανονικός ορός κατσίκας και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Ο κανονικός ορός κατσίκας στη συνέχεια αφαιρέθηκε και το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:400 σε PBS προστέθηκε σε κάθε δείγμα και επωάστηκε στους 4°C όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα στην ομάδα αρνητικού ελέγχου επωάστηκαν με PBS στους 4°C όλη τη νύχτα. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με σημασμένα με βιοτίνη δευτερεύοντα αντισώματα στον θάλαμο υγρασίας στους 37°C για 20 λεπτά. Κάθε δείγμα στη συνέχεια πλύθηκε σε PBS και επισημάνθηκε με συζυγή χρένο υπεροξειδάσης-στρεπταβιδίνης (διάλυμα εργασίας C) στους 37°C για 20 λεπτά. Μετά το πλύσιμο με PBS, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντιδραστήριο DAB στο σκοτάδι για περίπου 1-10 λεπτά και η ανάπτυξη ενός καφέ χρώματος παρακολουθήθηκε σε μικροσκόπιο φωτός. Κάθε δείγμα στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές σε απεσταγμένο νερό για 1-2 λεπτά και οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με διάλυμα αιματοξυλίνης για 0,5-1 λεπτό. Μετά από σχολαστικό ξέπλυμα κάθε δείγματος σε νερό, τα κύτταρα βυθίστηκαν σε αλκοόλη υδροχλωρικού οξέος 1% για διαφοροποίηση και 1% υδατική αμμωνία, ακολουθούμενη από σχολαστική πλύση των κυττάρων σε νερό. Τα κύτταρα από κάθε δείγμα στη συνέχεια αφυδατώθηκαν σε 70% αιθανόλη για 2 λεπτά, 80% αιθανόλη για 2 λεπτά, 90% αιθανόλη για 2 λεπτά δύο φορές, 95% αιθανόλη για 2 λεπτά δύο φορές και 100% αιθανόλη για 2 λεπτά δύο φορές. Τα κύτταρα μετά βυθίστηκαν σε διάλυμα ξυλολίου για 2 λεπτά δύο φορές και τοποθετήθηκαν σε γυάλινη πλάκα με ουδέτερες ρητίνες. Κάτω από μικροσκόπιο φωτός, κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε λήψη εικόνας και τυχαία επιλογή 5-10 αποτελεσματικών οπτικών πεδίων για τον προσδιορισμό της έκφρασης επιλεγμένων πρωτεϊνών σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες που υποδεικνύεται από την ένταση των καφέ σωματιδίων και για τον ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη με τη μέση τιμή του γκρι. .

Ρυθμός απόπτωσης κυττάρων MES23.5 που μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής

Τα προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS. Για απομόνωση κυττάρων, προστέθηκε κατάλληλη ποσότητα διαλύματος θρυψίνης χωρίς EDTA σε θερμοκρασία δωματίου και το διάλυμα μεταφέρθηκε απαλά με πιπέτα για να επιτραπεί η αποκόλληση των προσκολλημένων κυττάρων. Στη συνέχεια προστέθηκε ένα μέσο κυτταρικής καλλιέργειας για να σταματήσει η θρυψινοποίηση. Το μίγμα μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα φυγοκέντρησης και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 1500 rpm για τη συλλογή των απομονωθέντων κυττάρων. Μετά την απόρριψη του υπερκειμένου, το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε ήπια χρησιμοποιώντας PBS και τα κύτταρα μετρήθηκαν. Περίπου 1 χ 105 έως 5 χ 105 επαναιωρημένα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 1500 rpm και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Πέντε μικρολίτρα διαλύματος δέσμευσης Annexin V-FITC προστέθηκαν στο κυτταρικό ίζημα για να επαναιωρηθούν ήπια τα κύτταρα. Προστέθηκαν άλλα 5 μL Annexin V-FITC και αναμίχθηκαν επιμελώς. Πέντε μικρολίτρα διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου χρησιμοποιήθηκαν για χρώση κυττάρων με επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά λίγο πριν από την κυτταρομετρία ροής.

Ανάλυση Western Blot γιαin vitro

Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε μια κανονική ομάδα, ομάδα θεραπείας MPP+, χαμηλής δόσηςC. tubulosaομάδα θεραπείας, ομάδα θεραπείας με μέτρια δόση C. tubulosa και ομάδα θεραπείας υψηλής δόσης C. tubulosa. Η έκφραση των Bcl2 και Bax μετρήθηκε σε καθένα. Συνολικά 1 × 105 κύτταρα ανά φρεάτιο στην πλάκα 6-πηγαδιού χρησιμοποιήθηκαν για μοντελοποίηση και επεξεργασία σε κάθε ομάδα πριν από τη συλλογή των κυττάρων. Ένα μικτό προϊόν λύσης, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RIPA, αναστολέα πρωτεάσης και αναστολέα φωσφατάσης, προστέθηκε για λύση των κυττάρων για 30 λεπτά σε πάγο. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση πρωτεΐνης. Η ολική πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία BCA και διαχωρίστηκε με 10% SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη και επωάστηκαν με ένα ρυθμιστικό αποκλεισμού αποβουτυρωμένου γάλακτος 5% σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε σε πρωτογενές αντίσωμα (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, αραίωση 1:200) στους 4°C όλη τη νύχτα. Μετά από ένα στάδιο πλύσης, η μεμβράνη επωάστηκε σε ένα δευτερεύον αντίσωμα (0,5 mg/ml, αραίωση 1:5000) στους 4°C για 1 ώρα και στη συνέχεια σε συσκευή ανάπτυξης ECL για 2 λεπτά για συμβατική ανάπτυξη. Το λογισμικό Quantity One χρησιμοποιήθηκε για την ημιποσοτική ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης.

ΦΥΣΙΚΌ CISTANCHE TUBULOSA FOR ANTI FATIGUE PROTECT LIVER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Experimental Animal Modeling and Drug Administration

Πενήντα αρσενικά ποντίκια 8-εβδομάδων χωρίς συγκεκριμένα παθογόνα χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες: κανονική ομάδα, ομάδα θεραπείας με MPTP (όχημα), ομάδα θεραπείας με χαμηλή δόση C. tubulosa, μέτρια δόση θεραπείας με C. tubulosa ομάδα θεραπείας με υψηλή δόση C. tubulosa. Τα ζώα στεγάστηκαν στους 20-22◦C με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Στα ποντίκια της φυσιολογικής ομάδας χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση με ίσο όγκο φυσιολογικού ορού για επτά διαδοχικές ημέρες. Τα ποντίκια στις άλλες ομάδες θεραπείας ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με MPTP (30 mg/kg/ημέρα) για επτά διαδοχικές ημέρες για τη δημιουργία φορέων.

Κατά τη διάρκεια της μοντελοποίησης της PD, στα ποντίκια στις ομάδες θεραπείας με χαμηλή δόση, μέτρια δόση και υψηλή δόση C. tubulosa χορηγήθηκαν ενδογαστρικά ισοδύναμοι κλινικοί όγκοι 4 g/kg/ημέρα, 8 g/kg/ημέρα και 16 g/ kg/dΝανοσκόνη C. tubulosa, αντίστοιχα, για 14 συνεχόμενες ημέρες. Στα ποντίκια στις ομάδες ελέγχου και φορέα χορηγήθηκαν ενδογαστρικά ισοδύναμοι όγκοι φυσιολογικού ορού για 14 διαδοχικές ημέρες. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Fujian του TCM και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις διεθνώς αποδεκτές αρχές για εργαστηριακή χρήση και φροντίδα ζώων. Καταβλήθηκαν όλες οι προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων σε αυτή τη μελέτη.