Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες Cistanche Tubulosa προκαλούν απόπτωση σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος H22 μέσω τόσο των εξωγενών όσο και των εγγενών οδών σηματοδότησης

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li και Jinyao Li

Αφηρημένη

Ιστορικό:Cistanche tubulosa(Schenk) Το R. Wight είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο που παρασιτοποιεί τις ρίζες του φυτού Tamarix και έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της ανδρικής ανικανότητας, της στειρότητας, της αδυναμίας του σώματος και ως τονωτικό. Ωστόσο, η αντικαρκινική του δράση στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι ακόμα άγνωστη. Εδώ, διερευνήσαμε την αντικαρκινική επίδραση τουC. tubulosa φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(CTPG) σε κύτταρα Η22 ηπατοκυτταρικού καρκινώματος τόσο in vitro όσο και in vivo και οι μηχανισμοί του. Μέθοδοι: Η μορφολογία, η βιωσιμότητα, η απόπτωση, ο κυτταρικός κύκλος και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψm) των κυττάρων Η22 αναλύθηκαν με ανεστραμμένη μικροσκοπία, δοκιμασία ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. Η έκφραση και η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών στην οδό απόπτωσης ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western. Το in vivo αντικαρκινικό αποτέλεσμα αξιολογήθηκε σε ένα μοντέλο ποντικού όγκου που δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας αρσενικά ποντίκια Kunming. Αποτελέσματα: Η θεραπεία με CTPG κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων Η22 με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση και τον χρόνο, ο οποίος συσχετίστηκε με την αυξημένη απόπτωση και τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G0/G1 και G2/M. Επιπλέον, παρατηρήθηκε χρωμοσωμική συμπύκνωση σε κύτταρα Η22 που υπέστησαν αγωγή με CTPG. Η θεραπεία με CTPG αύξησε σημαντικά την αναλογία Bax/Bcl{10}}, μείωσε το Δψm και ενίσχυσε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c. Τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης-8 και της κασπάσης-9 τόσο στις εξωτερικές όσο και στις ενδογενείς οδούς σηματοδότησης αυξήθηκαν σημαντικά σε σχέση με τη διαδοχικά ενεργοποιημένη κασπάση-7 και -3 για τη διάσπαση της PARP. Τέλος, CTPG (Cistancheσωληνοειδήςφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες) ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Η22 σε ποντίκια και βελτίωσε το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών με όγκο. Συμπεράσματα: Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η CTPG κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Η22 μέσω τόσο της εξωγενούς όσο και της ενδογενούς απόπτωσης.

Ιστορικό

Ο καρκίνος του ήπατος κατέλαβε την έκτη θέση για τη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου και την τέταρτη θέση για τους θανάτους από καρκίνο παγκοσμίως. Επιπλέον, κατέλαβε την τέταρτη θέση για τη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου και την πρώτη για τη θνησιμότητα από καρκίνο σε χώρες με χαμηλό κοινωνικοδημογραφικό δείκτη [1]. Στην Κίνα, ο καρκίνος του ήπατος είναι η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο το 2015 [2]. Περισσότερο από το 90 τοις εκατό των πρωτοπαθών καρκίνων του ήπατος είναι ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) στον κόσμο [3]. Επί του παρόντος, η ηπατική εκτομή είναι η κύρια επιλογή για τη θεραπεία του HCC. Ωστόσο, λιγότερο από το 30 τοις εκατό των ασθενών με HCC πληρούσαν τα κριτήρια της θεραπευτικής ηπατικής εκτομής και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-του έτους εξακολουθεί να είναι τόσο χαμηλό όσο 35-50 τοις εκατό λόγω του υψηλού ποσοστού υποτροπών [4, 5 ]. Η διαθεσιμότητα θεραπευτικών επιλογών για ασθενείς με ενδιάμεσο έως προχωρημένο HCC είναι πολύ περιορισμένη. Το Sorafenib, ένα μοριακά στοχευμένο φάρμακο, έχει εγκριθεί από τον FDA ως θεραπεία πρώτης γραμμής για προχωρημένο HCC. Ωστόσο, το sorafenib παρατείνει μόνο περίπου 3 μήνες επιβίωσης και το ποσοστό ανταπόκρισης είναι μικρότερο από 4 τοις εκατό [6, 7]. Είναι επείγον να αναπτυχθούν νέα φάρμακα ή στρατηγικές κατά του HCC. Η παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM) μόνη της ή σε συνδυασμό με άλλες στρατηγικές έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του HCC και έχει δείξει τα κλινικά οφέλη που περιλαμβάνουν παρατεταμένο χρόνο επιβίωσης, βελτιωμένη ποιότητα ζωής, μειωμένες ανεπιθύμητες ενέργειες και ούτω καθεξής [8, 9].Cistanche, ένα είδος TCM, έχει διάφορες βιολογικές λειτουργίες, όπως π.χαντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης, αντιγηραντική,και νευροπροστασία [10, 11]. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες έχουν θεωρηθεί τα κύρια δραστικά συστατικά τουCistanche, οι οποίες έχουν ποικίλες δραστηριότητες, όπως αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης, ηπατοπροστασία και νευροπροστασία [12-15]. Η ομάδα μας το έχει αναφέρειΦαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες Cistanche tubulosa(CTPG) θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση σε κύτταρα μελανώματος B16-F10 και ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων σε ποντίκια [16]. Σε αυτή τη μελέτη, μετρήσαμε την αντικαρκινική επίδραση του CTPG σε κύτταρα HCC H22 τόσο in vitro όσο και in vivo και διερευνήσαμε τους μηχανισμούς του. Βρήκαμε ότι το CTPG προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα Η22 μέσω τόσο των εξωγενών όσο και των εγγενών μονοπατιών σηματοδότησης και κατέστειλε την ανάπτυξη όγκων Η22 σε ποντικούς.

Μέθοδοι

Κυτταρική γραμμή

Τα κύτταρα H22 ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ποντικού ελήφθησαν από το Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Πανεπιστήμιο Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 100 U/ml πενικιλίνης και 10 στρεπτομυκίνη και 10 τοις εκατό εμβρυϊκός βόειος ορός απενεργοποιημένου με θερμότητα (Gibco) στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2.

Δοκιμασία ΜΤΤ

Το CTPG αγοράστηκε από την Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Κίνα) και οι κύριες ενώσεις του CTPG πιστοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης [16]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2, βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , USA) δοκιμασία. Κύτταρα Η22 εμβολιάστηκαν σε 96-τρυβλία φρεατίων με πυκνότητα 2 × 104 κύτταρα σε 100 μΙ μέσο ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 ug/ml) ή 0,3 τοις εκατό DMSO (ίσο με αυτό σε 400 ug/ml CTPG) για 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα. . Μετά από φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 7 λεπτά, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και 100 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg/ml σε PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 4 ώρες και προστέθηκαν 100 μΙ DMSO για να διαλυθούν οι σχηματισμένοι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Οι τιμές OD490 ανιχνεύθηκαν από έναν αναγνώστη μικροπλακών πηγαδιού 96- (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: Κυτταρική βιωσιμότητα ( ποσοστό )=(επεξεργασμένο με OD/δεν υποβλήθηκε σε επεξεργασία) × 100 τοις εκατό .

Ανίχνευση απόπτωσης

Τα κύτταρα H22 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 ug/ml) ή 0,3 τοις εκατό DMSO για 24 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin V FITC/ Κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ιωδιούχου προπιδίου (PI) (YEASEN, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (BD FACSCalibur, ΗΠΑ).

Ανίχνευση δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης

Τα κύτταρα H22 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 200 και 400 ug/ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με τη διαπερατή από τη μεμβράνη βαφή JC-1 (Beyotime, Κίνα) για 20 min στις 37 μοίρες. Μετά από δύο φορές πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα JC-1, τα δείγματα επαναιωρήθηκαν με 300 ul ρυθμιστικού διαλύματος JC-1 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (BD FACSCalibur, ΗΠΑ).

Ανάλυση κυτταρικού κύκλου

Τα κύτταρα Η22 εμβολιάστηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 60 mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 ug/ml) ή 0,3 τοις εκατό DMSO για 24 h. Όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70 τοις εκατό παγωμένη αιθανόλη στους -20 βαθμούς για 2 ώρες και πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης ιωδιούχου προπιδίου/RNase 300 ul (BD Biosciences). Μετά από 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, συλλέχθηκαν δείγματα με κυτταρομετρία ροής (BD FACSCalibur, ΗΠΑ) και η κατανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με το λογισμικό ModFit LT 3.0.

Χρώση Hoechst 33,258

Οι μορφολογικές αλλαγές των πυρήνων των κυττάρων Η22 αναλύθηκαν με χρώση με διαπερατή από μεμβράνη συνδετική με DNA χρωστική Hoechst 33,258. Τα κύτταρα Η22 σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο 6-πηγαδιού σε συγκέντρωση 1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο σε ένα μέσο των 2 ml. Μετά από 60 τοις εκατό ~ 70 τοις εκατό συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 ug/ml) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παγωμένη παραφορμαλδεΰδη στους 4 βαθμούς για 10 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33.258 (Beyotime, China) στους 4 βαθμούς για 10 λεπτά. Τα δείγματα παρατηρήθηκαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon Eclipse Ti-E, Ιαπωνία).

Western blot

Anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, Anti-Bcl-2 και anti-Bax αγοράστηκαν από την Beyotime Biotech Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Anti-caspase-7, anti-cleaved-caspase-7, anti-caspase-8, anti-cleaved-caspase-8, anti-caspase-9, anti Η -διασπασμένη-κασπάση-9, η αντι-PARP, η αντιδιασπασμένη PARP, η IgG-HRP κατά ποντικού και η IgG-HRP κατά κουνελιού αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology. Η αντι{28}}ακτίνη αγοράστηκε από την Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα).

Τα κύτταρα Η22 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 μg/ml) ή 0,3 τοις εκατό DMSO για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με το διάλυμα λύσεως κυττάρων RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) για 30 λεπτά σε πάγο. Τα δείγματα περιδινήθηκαν (12,000 g για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς ) για τη συλλογή των υπερκειμένων και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με κιτ BCA (Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ). Μια ίση ποσότητα πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα απομονώθηκε με 12 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF (Biosharp, China). Μετά τον αποκλεισμό με ρυθμιστικό TBST που περιείχε 5 τοις εκατό μη λιπαρό γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίστοιχα πρωτογενή αντισώματα και δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με την υπεροξειδάση αγριοραπανιού (HRP), αντίστοιχα. Μετά από πλύση με TBST, οι πρωτεΐνες στόχοι ανιχνεύθηκαν με κιτ δοκιμασίας ECL (Beyotime, Κίνα).

Δήλωση για ζώα και ηθική

Αρσενικά ποντίκια Kunming ηλικίας 6-8 εβδομάδων αγοράστηκαν από το Animal Laboratory Center του Ιατρικού Πανεπιστημίου Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Κίνα). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε μια τυπική ελεγχόμενη με θερμοκρασία, ζωική εγκατάσταση με κύκλο φωτός του Πανεπιστημίου Xinjiang. Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου Xinjiang. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Πειραμάτων σε Ζώα του Βασικού Εργαστηρίου Βιολογικών Πόρων και Γενετικής Μηχανικής Xinjiang (BRGE-AE001), Πανεπιστήμιο Xinjiang.

Μελέτη ποντικού όγκου

Για επαγωγή μοντέλου ποντικού όγκου, αρσενικά ποντίκια Kunming εγχύθηκαν υποδόρια με 1 × 106 κύτταρα Η22 σε 100 μΙ PBS στη δεξιά πλευρά. Μετά από 3 ημέρες, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες (7 ποντίκια/ομάδα). Η ομάδα ελέγχου εγχύθηκε με 0,1 ml DMSO υποδορίως γύρω από τον όγκο. Οι ομάδες CTPG-200 και CTPG- 400 εγχύθηκαν υποδόρια με 200 ή 400 mg/kg CTPG σε 0,1 ml DMSO γύρω από τον όγκο. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία κάθε 2 ημέρες για έως και 21 ημέρες. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας παχύμετρα έως και 25 ημέρες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: όγκος όγκου (mm3)=(μήκος×πλάτος2)/2. Μετά από 25 ημέρες, η επιβίωση των ποντικών με όγκο παρακολουθούνταν κάθε μέρα μέχρι το τέλος αυτής της μελέτης.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία υπολογίστηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). p < 0.05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="">

Αποτελέσματα

Το CTPG μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων Η22 in vitro

Προκειμένου να διερευνηθεί η αντικαρκινική επίδραση του CTPG στο HCC, τα κύτταρα Η22 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 ug/ml) in vitro. Μετά από 24 ώρες, η μορφολογία των κυττάρων Η22 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Βρήκαμε ότι η μορφολογία των κυττάρων Η22 άλλαξε δραματικά με τη θεραπεία CTPG. Με την αύξηση της συγκέντρωσης CTPG, τα κύτταρα έγιναν μικρά και στρογγυλά και ο αριθμός των κυττάρων μειώθηκε επίσης πολύ (Εικ. 1α). Η δοκιμασία ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων Η22 μετά από θεραπεία CTPG για 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα. Το CTPG μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων Η22 με δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1β). Το CTPG στα 300 ug/ml έφτασε στον καλύτερο ανασταλτικό ρυθμό (Εικ. 1c). Οι τιμές του IC50 του CTPG για κύτταρα Η22 είναι 236 ug/ml στις 24 ώρες και 169,8 ug/ml στις 48 ώρες.

Η CTPG προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα Η22

Για να διερευνηθεί εάν η μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων Η22 προκαλείται από την επαγωγή απόπτωσης, τα κύτταρα Η22 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTPG (0, 100, 200, 300 και 400 ug/ml) για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με PI και Αννεξίνη V. Τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής έδειξαν ότι η CTPG προκάλεσε σημαντικά την απόπτωση των κυττάρων Η22 (συμπεριλαμβανομένης της πρώιμης και της όψιμης απόπτωσης) με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2α). Αν και η υψηλή δόση CTPG αύξησε επίσης σημαντικά τη νέκρωση των κυττάρων Η22, η νέκρωση παίζει μικρό ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Η22 λόγω της χαμηλότερης αναλογίας της (8,3 τοις εκατό) σε σύγκριση με αυτή της απόπτωσης (52,6 τοις εκατό). Περαιτέρω, οι συνολικές πρωτεΐνες των κυττάρων Η22 απομονώθηκαν μετά από θεραπεία με CTPG και οι εκφράσεις του αντι-αποπτωτικού λεμφώματος Β κυττάρων 2 (Bcl-2) και της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Χ που σχετίζεται με το BCL-2- (Bax) ανιχνεύθηκαν με Western blot. Τα δεδομένα σάρωσης σε κλίμακα του γκρι έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του Bax και του Bcl-2 αυξήθηκαν και μειώθηκαν, αντίστοιχα. Η αναλογία Bax/Bcl-2 αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. 2β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CTPG επάγει απόπτωση σε κύτταρα Η22.

Το CTPG προκαλεί χρωμοσωμική συμπύκνωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα Η22

Έχει αναφερθεί ότι η βλάβη του DNA και η διακοπή του κυτταρικού κύκλου που προκαλούνται από φάρμακα μπορεί να αναστείλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και να προκαλέσουν απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα [17, 18]. Για την ανίχνευση της μορφολογίας των πυρήνων σε κύτταρα Η22 μετά από αγωγή με CTPG για 24 ώρες, τα κύτταρα Η22 χρωματίστηκαν με Hoechst 33,342 και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ανεστραμμένη μικροσκοπία φθορισμού. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CTPG εμφάνισαν μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση της έντονα συμπυκνωμένης χρωματίνης των πυρήνων, ενώ τα κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή έδειξαν ομοιογενώς χρωματισμένους πυρήνες (Εικ. 3a). Η κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα Η22 αναλύθηκε περαιτέρω με χρώση ΡΙ μετά από επεξεργασία CTPG για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3β, η θεραπεία CTPG αύξησε σημαντικά την αναλογία των κυττάρων G0/G{1- και G2/M-φάσης και μείωσε σημαντικά την αναλογία των κυττάρων S-φάσης, υποδηλώνοντας ότι το CTPG επήγαγε G Διακοπή φάσης 0/G1 και G2/M σε κύτταρα Η22. Η υψηλή δόση CTPG αύξησε επίσης σημαντικά την αναλογία των υπό G1 κυττάρων.

Το CTPG μείωσε το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και αύξησε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c

Το μονοπάτι που εξαρτάται από τα μιτοχόνδρια παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση απόπτωσης [19, 20]. Οι αλλαγές του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψm) μπορούν να παρακολουθηθούν με χρώση JC-1 λόγω του ότι το συσσωμάτωμα JC{{4} (κόκκινος φθορισμός) μπορεί να αποσυντεθεί σε μονομερές (πράσινος φθορισμός) με τη μείωση του Δψm [21]. Μετά από επεξεργασία CTPG για 24 ώρες, τα κύτταρα Η22 χρωματίστηκαν με χρωστική JC- 1. Τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής έδειξαν ότι ο κόκκινος φθορισμός στο κανάλι FL-2 και ο πράσινος φθορισμός στο κανάλι FL-1 μειώθηκαν σημαντικά και αυξήθηκαν κατά τη θεραπεία με CTPG. Η αναλογία των κυττάρων PE− FITC plus αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. 4a), υποδηλώνοντας ότι το CTPG μείωσε το Δψm στα κύτταρα H22. Αυτό είναι συνεπές με την αυξημένη αναλογία Bax/Bcl-2. Συνεπώς, παρατηρήσαμε ότι η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c αυξήθηκε σημαντικά κατά τη θεραπεία με CTPG (Εικ. 4β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η CTPG μπορεί να προκαλέσει εν μέρει απόπτωση σε κύτταρα Η22 μέσω μιας εξαρτώμενης από τα μιτοχονδριακά (εγγενή) οδού.

Το CTPG ενεργοποίησε την οδό κασπάσης και εμπόδισε την επιδιόρθωση του DNA

Στη συνέχεια, αναλύθηκε η ενεργοποίηση της κασπάσης που προκαλείται από CTPG μέσω τόσο εξωτερικών όσο και ενδογενών μονοπατιών σηματοδότησης. Μετά από αγωγή με CTPG για 24 ώρες, οι συνολικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κύτταρα Η22 και τα επίπεδα των προ-και διασπασμένων-κασπασών ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western. Σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο ή τον μάρτυρα DMSO, η θεραπεία με CTPG ρύθμισε σημαντικά προς τα πάνω όχι μόνο το επίπεδο της διασπασμένης κασπάσης-8 (εξωτερική οδός) αλλά και το επίπεδο της διασπασμένης κασπάσης-9 (εσωτερική οδός) (Εικ. 5). Διαδοχικά, η ενεργοποιημένη κασπάση-8 και η -9 διέκοψαν την κατάντη προ-κασπάση-3 και -7 που παρατηρήθηκαν στο Σχ. 5. Η ενεργοποιημένη κασπάση-3 διέκοψε το DNA επισκευαστικό ένζυμο πολυμεράσης πολυ (ADP-ριβόζης) (PARP) για την πρόληψη της επιδιόρθωσης του DNA και της συσσώρευσης βλάβης του DNA όπως παρατηρείται στο Σχ. 3α.

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CTPG προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα Η22 μέσω τόσο των εξωγενών όσο και των ενδογενών οδών σηματοδότησης.

Το CTPG καταστέλλει την ανάπτυξη του H22 HCC in vivo και βελτιώνει το ποσοστό επιβίωσης των καρκινικών ποντικών

Τέλος, η αντικαρκινική επίδραση του CTPG στο HCC αξιολογήθηκε σε μοντέλο ποντικού όγκου, το οποίο καθορίστηκε με υποδόρια ένεση κυττάρων Η22. Μετά από 3 ημέρες ένεσης κυττάρων Η22, τα ποντίκια όγκου υποβλήθηκαν σε αγωγή με CTPG 8 φορές. Το σωματικό βάρος των ποντικών και τα μεγέθη των όγκων παρακολουθήθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6α, το σωματικό βάρος των ποντικών σε κάθε ομάδα δεν έχει σημαντική διαφορά, υποδηλώνοντας ότι οι επιλεγμένες δόσεις CTPG δεν έχουν εμφανείς παρενέργειες. Είναι ενδιαφέρον ότι η ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με 200 mg/kg και 400 mg/kg CTPG ανεστάλη σημαντικά (Εικ. 6β). Επιπλέον, οι δύο δόσεις θεραπείας με CTPG βελτίωσαν σημαντικά την επιβίωση των ποντικών με όγκο (3/7, 3/7) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (0/7) στο τέλος του πειράματος (Εικ. 6b). Βρήκαμε επίσης ότι το CTPG ενίσχυσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των σπληνοκυττάρων που απομονώθηκαν από αρσενικά ποντίκια Kunming με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 6c), υποδηλώνοντας ότι το CTPG έχει ανοσοδιεγερτικό αποτέλεσμα.

Συζήτηση

Το TCM έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων για μακρά ιστορία. Έχει αναφερθεί ότι η TCM μπορεί να προκαλέσει απόπτωση σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων μέσω τόσο εξωγενών (με τη μεσολάβηση υποδοχέα θανάτου) όσο και ενδογενών (εξαρτώμενων από τα μιτοχόνδρια) οδών σηματοδότησης για την άσκηση αντικαρκινικών επιδράσεων [22-25]. Τα δύο μονοπάτια μπορούν να ενεργοποιήσουν την κασπάση-8 και το -9, αντίστοιχα [24, 26]. Εδώ, διαπιστώσαμε ότι το CTPG κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων Η22 μέσω επαγωγής απόπτωσης και διακοπής του κυτταρικού κύκλου. Τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης-8 και -9 ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω από τη θεραπεία CTPG, υποδηλώνοντας ότι τόσο τα εξωτερικά όσο και τα εγγενή μονοπάτια σηματοδότησης εμπλέκονται στην πρόκληση απόπτωσης. Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι το CTPG προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα μελανώματος B16-F10 μέσω της εξαρτώμενης από τα μιτοχόνδρια οδού που αύξησε το επίπεδο της σχισμένης κασπάσης-9 αλλά όχι της κασπάσης-8 [16]. Το CTPG μπορεί να ενεργοποιήσει διακριτές οδούς σηματοδότησης σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων όγκου.

Η ακεραιότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης ρυθμίζεται στενά από τα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών BCL-2 συμπεριλαμβανομένων των Bax και Bcl-2 [27, 28]. Η αναλογία Bax προς Bcl-2 παίζει κρίσιμο ρόλο στο μονοπάτι της απόπτωσης που εξαρτάται από τα μιτοχόνδρια [29]. Σε κύτταρα Η22 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CTPG, η αναλογία Bax/Bcl-2 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω, γεγονός που μπορεί να προκαλέσει τη μείωση του Δψm και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c που παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Κατά συνέπεια, η προκασπάση-9 διασπάστηκε και ενεργοποιήθηκε. Τέλος, οι εκκινητές της ενεργής κασπάσης-8 και -9 ενεργοποίησαν τον δήμιο της κασπάσης-3 για να διασπάσουν το PARP για να αποτρέψουν την επιδιόρθωση του DNA. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η CTPG προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα Η22 μέσω τόσο των εξωγενών όσο και των εγγενών οδών σηματοδότησης.

Στο μοντέλο ποντικού όγκου, το CTPG κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του H22 HCC και βελτίωσε σημαντικά την επιβίωση των καρκινικών ποντικών. Είναι ενδιαφέρον ότι το CTPG εξαρτώμενα από τη δόση προώθησε τον πολλαπλασιασμό των σπληνοκυττάρων από ποντικούς Kunming, κάτι που είναι σύμφωνο με την προηγούμενη μελέτη μας [16].

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CTPG μπορεί να καταστέλλει την ανάπτυξη του H22 HCC σε ποντίκια τόσο μέσω της άμεσης αντικαρκινικής δράσης όσο και της έμμεσης ανοσολογικής ενίσχυσης.

συμπεράσματα

Το CTPG κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Η22 τόσο in vitro όσο και in vivo και προκάλεσε απόπτωση στα κύτταρα Η22 μέσω τόσο των εξωγενών όσο και των ενδογενών οδών σηματοδότησης. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το CTPG μπορεί να είναι πιθανός υποψήφιος για τη θεραπεία του HCC.