Κλωνοποίηση γονιδίων, λειτουργική ταυτοποίηση, δομική ανάλυση και ανάλυση έκφρασης της συνθάσης σακχαρόζης από το Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Ανάλυση έκφρασης του CtSus σε διαφορετικά μέρη του Cistanche tubulosa και σε σύστημα κυτταροκαλλιέργειας υπό συνθήκες ξηρασίας

4.1 Ανάλυση έκφρασης του CtSus σε διάφορα μέρη του Cistanche tubulosa

In vitro πειράματα μετασχηματισμού ολόκληρων κυττάρων και πειράματα ενζυματικής καταλυτικής αντίδρασης επιβεβαίωσαν ότι η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο CtSus έχει την ικανότητα να καταλύει τη σύνθεση της UDP-γλυκόζης. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ αυτού του γονιδίου και της βιοσύνθεσης των γλυκοσιδικών ενώσεων στο Cistanche tubulosa, το επίπεδο έκφρασης αυτού του γονιδίου σε διάφορα μέρη τουCistanche tubulosaαναλύθηκε.

ΠΩΛΟΥΝΤΑΙ ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ CISTANCHE ΥΨΗΛΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ

Υποστήριξη της Wecistanche-Επικοινωνήστε μαζί μας λάβετε πληροφορίες για την έκπτωση:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Εχινακοσίδηείναι η πιο αντιπροσωπευτική ένωση γλυκοσιδίου στο Cistanche tubulosa και η περιεκτικότητά του μπορεί να φτάσει περισσότερο από το 30% του ξηρού βάρους των φυτών Cistanche tubulosa [23]. Η ερευνητική ομάδα μέτρησε προηγουμένως την περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη σε διαφορετικά μέρη φυτών Cistanche tubulosa και η συγκεκριμένη απόδοση ήταν: η περιεκτικότητα σεechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>εναέριο μέρος; Μεταξύ αυτών, η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη στο haustorium ήταν η υψηλότερη. Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας cDNA από διαφορετικά μέρη του Cistanche tubulosa ως πρότυπα και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν από το 2–Μέθοδος ΔΔCT και πραγματοποιήθηκε διαφορική ανάλυση. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4Α. Το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου CtSus στο haustorium ήταν το υψηλότερο, 1,5 φορές από αυτό του υπέργειου τμήματος, και το επίπεδο έκφρασης στο υπόγειο τμήμα ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό στο υπέργειο τμήμα, το οποίο είναι σύμφωνο με το πρότυπο συσσώρευσης γλυκοσιδίων φαινυλαιθανόλης αντιπροσωπεύεται από εχινακοσίδη σε διάφορα μέρη τουCistanche tubulosa.

Σχήμα 4 Σχετικά επίπεδα έκφρασης του CtSus σε διαφορετικά μέρη του C. tubulosa και σε κύτταρα εναιωρήματος που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PEG6000. Α: Σχετικό επίπεδο έκφρασης του CtSus σε διάφορα μέρη του C. tubulosa. Β: Επίπεδο σχετικής έκφρασης του CtSus σε κύτταρα εναιωρήματος C. tubulosa που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PEG6000 σε διαφορετικά χρονικά σημεία n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ CISTANCHE ΥΨΗΛΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ

4.2 Ανάλυση έκφρασης του CtSus σε κύτταρα αιωρήματος Cistanche deserticola υπό συνθήκες στρες ξηρασίας

Η προκαταρκτική έρευνα για το έργο έδειξε ότιστρες ξηρασίας που προκαλείται από το PEG6000κουτίαυξηθεί σημαντικάοσυσσώρευση γλυκοζιτών φαινυλαιθανόληςσε κελιά ανάρτησης Cistanche. Από 3 έως 9 ημέρες μετά την επαγωγή, η περιεκτικότητα σε εχινασίδη αυξήθηκε σημαντικά. Από τη 12η έως τη 15η ημέρα, ηρυθμός ανάπτυξης της εχινακεσίδηςΤο περιεχόμενο επιβραδύνθηκε και έφτασε στη μέγιστη τιμή τη 15η ημέρα. Στη συνέχεια, καθώς αυξανόταν ο χρόνος καλλιέργειας, η περιεκτικότητα σε εχινακεσίδη αυξήθηκε σημαντικά. Η περιεκτικότητα σε φρουκτοσίδη μειώθηκε σταδιακά [24]. Βάσει αυτής της έρευνας, αυτό το άρθρο χρησιμοποίησε το cDNA των μη επεξεργασμένων κυττάρων εναιωρήματος Cistanche deserticola και των κυττάρων εναιωρήματος Cistanche deserticola που προκλήθηκαν από PEG ως πρότυπα για τη διεξαγωγή ποσοτικής ανίχνευσης φθορισμού PCR σε πραγματικό χρόνο για την εξέταση του γονιδίου CtSus στο εναιώρημα Cistanche deserticola κύτταρα υπό συνθήκες στρες ξηρασίας. αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4Β. Σε κύτταρα εναιωρήματος Cistanche deserticola που προκλήθηκαν από PEG6000, η ​​έκφραση του CtSus αυξήθηκε σημαντικά την 6η ημέρα μετά την επαγωγή και έφτασε στην υψηλότερη τιμή την 9η ημέρα και στη συνέχεια έπεσε στο ίδιο επίπεδο με τον έλεγχο. ομάδες του ίδιου επιπέδου. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι το στρες ξηρασίας μπορεί να αυξήσει σημαντικά την έκφραση του γονιδίου CtSus στην κυτταρική σειρά εναιωρήματος Cistanche deserticola, η οποία είναι σύμφωνη με το πρότυπο συσσώρευσης της εχινακεσίδης σε συνθήκες στρες ξηρασίας. Ωστόσο, η κορυφαία έκφραση του γονιδίου CtSus εμφανίζεται νωρίτερα από την κορυφή της περιεκτικότητας σε εχινακεσίδη, επειδή ο ενεργός δότης γλυκοζυλίου που συντίθεται με την κατάλυση CtSus είναι ένας σημαντικός πρόδρομος που απαιτείται για την αντίδραση γλυκοζυλίωσης πολλαπλών σταδίων στην επακόλουθη βιοσυνθετική οδό της εχινακεσίδης. , επομένως εικάζεται ότι αφού υποβληθούν σε στρες ξηρασίας, οι οργανισμοί θα κινητοποιήσουν κατά προτίμηση γονίδια που σχετίζονται με τον πρωτογενή μεταβολισμό για να επιτύχουν τη συσσώρευση ενεργών δοτών και στη συνέχεια να επιτύχουν τη συσσώρευση σημαντικών δευτερογενών μεταβολιτών.

ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ CISTANCHE ΥΨΗΛΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ

5 Τρισδιάστατη μελέτη δομής πρωτεΐνης CtSus και ανάλυση βασικών ενεργών θέσεων

Με βάση τη λειτουργία του CtSus στην κατάλυση της παραγωγής UDP-γλυκόζης δότη γλυκοζυλίου, μελετήθηκε περαιτέρω η δομική βάση της καταλυτικής δραστηριότητας του CtSus. Το διαδικτυακό εργαλείο SOPMA χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της δευτερογενούς δομής της πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δευτερεύουσα δομή του CtSus περιείχε 55,28% -έλικες, 25,47% τυχαίες σπείρες, 12,80% εκτεταμένους κλώνους και 6,46% -στροφές (Εικόνα 5Α), υποδεικνύοντας ότι οι -έλικες είναι οι πιο σημαντικές δευτερεύουσες δομικές μονάδες στην πρωτεΐνη CtSus. ακολουθούμενες από τυχαίες σπείρες, οι οποίες αντιπροσωπεύουν επίσης ένα μεγάλο ποσοστό της πρωτεΐνης. Οι εκτεταμένοι κλώνοι και οι στροφές κατανέμονται σε όλη την πρωτεΐνη. Σύμφωνα με υπάρχουσες μελέτες, η συνθάση σακχαρόζης υπάρχει συνήθως με τη μορφή ενός τετραμερούς, το οποίο θεωρείται ότι είναι η δραστική του μορφή. Ως εκ τούτου, αυτό το άρθρο χρησιμοποίησε περαιτέρω το AlphaFold2 για να προβλέψει τη δομή της πρωτεΐνης CtSus και έλαβε την τρισδιάστατη δομή των τετραμερών πρωτεΐνης. Η σύγκριση της βάσης δεδομένων PDB (Protein Data Bank) διαπίστωσε ότι η ομοιότητα αλληλουχίας μεταξύ της συνθάσης σακχαρόζης Arabidopsis thaliana AtSus1 (PDBID 3S28) και του CtSus μπορεί να φτάσει το 77,93%. Η προβλεπόμενη δομή CtSus συγκρίθηκε με την τρισδιάστατη δομή AtSus1 και η τιμή μέσης τετραγωνικής απόκλισης ρίζας (RMSD) μετά την υπέρθεση πρωτεΐνης ήταν 1,11 Α, υποδεικνύοντας ότι οι χωρικές δομές των δύο είναι εξαιρετικά συνεπείς (Εικόνα 5Β).

Η αναφερόμενη δομή κρυσταλλικού συμπλέγματος πρωτεΐνης-συνδέτη του Arabidopsis AtSus1 με UDP και φρουκτόζη (PDBID3S29) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο [16] για την ανάλυση του τρόπου δέσμευσης του CtSus με UDP και φρουκτόζη. Τα αποτελέσματα μοριακής σύνδεσης φαίνονται στο Σχήμα 5Γ. Μπορεί να παρατηρηθεί ότι οι θύλακες δέσμευσης υποστρώματος των AtSus1 και CtSus είναι πολύ παρόμοιοι όσον αφορά τον τύπο αμινοξέων, τη χωρική κατανομή και τη διαμόρφωση και η επικάλυψη είναι υψηλή, αποδεικνύοντας ότι η αλληλουχία της συνθάσης σακχαρόζης διατηρείται σε μεγάλο βαθμό στα φυτά. Οι διαμορφώσεις των δύο προσδεμάτων, UDP και φρουκτόζης, στον θύλακα δέσμευσης υποστρώματος πρωτεΐνης φαίνονται στο Σχήμα 5D. Η πιο συμφέρουσα διαμόρφωση μοριακής σύνδεσης του UDP και του CtSus έχει καλή επικάλυψη με τη διαμόρφωση του UDP στο κρυσταλλικό σύμπλεγμα AtSus1-UDP, αποδεικνύοντας την ακρίβεια των αποτελεσμάτων μοριακής σύνδεσης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ της UDP και των βασικών υπολειμμάτων αμινοξέων στον θύλακα δέσμευσης υποστρώματος πρωτεΐνης φαίνεται στο Σχήμα 5Ε. Το UDP και το CtSus συνδέονται κυρίως μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Τα βασικά υπολείμματα αμινοξέων στον θύλακα δέσμευσης υποστρώματος περιλαμβάνουν: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 και Glu681.

Αναφορές

[1] Τραγούδι ZH, Lei L, Tu PF. Πρόοδοι στην έρευνα της φαρμακολογικής δραστηριότητας στα φυτά του CistancheHoffing. et Σύνδεσμος [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Σύγκριση χημείας μεταξύ καλλιεργημένης και άγριας Cistanchetubulosa χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία 1H-NMR [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, από είδος υπό εξαφάνιση σε μεγάλη μάρκα κινεζικής ιατρικής [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche deserticola προστατεύουν τα κύτταρα PC12 από τραυματισμό που προκαλείται από OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolution of plant nucleotide-sugar interconversion enzymes [J]. PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Σχηματισμός φυτικών νουκλεοτιδίων σακχάρου, αλληλομετατροπή και διάσωση με ανακύκλωση ζάχαρης [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Βιοχημικός χαρακτηρισμός UDP-GlcNAc/Glc4-επιμεράσης από Escherichia coli O86:B7 [J]. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Ταυτοποίηση της UDP-N-ακετυλογλυκοζαμινικής4-επιμεράσης που εμπλέκεται στη γλυκοζυλίωση της πρωτεΐνης εξωσπορίου στον Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Ταυτοποίηση γονιδίων συνθάσης σακχαρόζης σε επίπεδο μεταγραφήματος στο Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Συνθάση σακχαρόζης: μια μοναδική γλυκοζυλοτρανσφεράση για την ανάπτυξη διεργασίας βιοκαταλυτικής γλυκοζυλίωσης [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. The biosynthesis of sucrose [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.[12]Stein O, Granot