Οι πολυσακχαρίτες Cistanche Deserticola βελτιώνουν τη γήρανση του εντέρου αναστέλλοντας την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3

 

 

Η γήρανση οδηγεί σε σταδιακή μείωση πολλαπλών φυσιολογικών λειτουργιών και αυξάνει τον κίνδυνο ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία [1]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η γήρανση έχει σημαντικό αντίκτυπο στη δομή και τη λειτουργία του εντέρου [2]. Ως βασικό όργανο για την πέψη, το μεταβολισμό και την άμυνα του εντέρου, η γήρανση του εντέρου μπορεί να προκαλέσει δυσαπορρόφηση θρεπτικών συστατικών, μεταβολικές διαταραχές και μειωμένη ανοσοποιητική λειτουργία [3-4], αυξάνοντας έτσι την ευαισθησία σε γαστρεντερικές ασθένειες [5]. Η χρόνια φλεγμονή είναι χαρακτηριστικό της γήρανσης του εντέρου, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί της δεν έχουν ακόμη πλήρως διευκρινιστεί. Επί του παρόντος, οι αντιγηραντικοί παράγοντες περιλαμβάνουν κυρίως το βήτα-νικοτιναμίδιο μονονουκλεοτίδιο (NMN), τη ραπαμυκίνη, το dasatinib συν κερσετίνη και άλλα [3]. Μεταξύ αυτών, το NMN είναι ένας βασικός πρόδρομος του βασικού συνενζύμου NAD+ και πολλές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι καθυστερεί σημαντικά την εντερική γήρανση σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια. αναγνωρίζεται ευρέως στο πεδίο ως αποτελεσματική παρέμβαση [4-5]. Ως εκ τούτου, η διερεύνηση των σχετικών μηχανισμών και στρατηγικών παρέμβασης είναι μεγάλης σημασίας.

Cistanche πόσιμο ποτό για ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση

Επικοινωνήστε τώρα για να γνωρίσετε τους αγρότες cistanche στην Κίνα

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:
Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Το φλεγμονώδες πεδίο 3 (NLRP3) της οικογένειας υποδοχέα υποδοχέα ολιγομερισμού που δεσμεύει νουκλεοτίδια είναι ένας βασικός ρυθμιστής της έμφυτης ανοσίας και παίζει σημαντικό ρόλο σε ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση. Η ενεργοποίησή του απαιτεί δύο σήματα. Το πρώτο σήμα: τα μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με το παθογόνο (PAMPs) και τα μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με τη βλάβη (DAMPs) προκαλούν έκφραση του NLRP3 και του προδρόμου της ιντερλευκίνης-1 (προ-IL-1 ). Το δεύτερο σήμα (όπως η εκροή καλίου και η μιτοχονδριακή βλάβη) πυροδοτεί τη συναρμολόγηση φλεγμονωδών σωμάτων, ενεργοποιεί την κασπάση-1 και διασπά το pro-IL-1 και το pro-{IL-18 για να δημιουργήσει ώριμα IL-1 και IL-18, οδηγώντας έτσι τη φλεγμονή [6]. Κατά τη διάρκεια της γήρανσης, η εντερική ομοιόσταση διαταράσσεται, οδηγώντας στην απελευθέρωση προφλεγμονωδών παραγόντων όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), ο οποίος ενεργοποιεί επίμονα το φλεγμονώδες NLRP3, σχηματίζοντας χρόνια φλεγμονή χαμηλού βαθμού. Αυτό επιδεινώνει περαιτέρω τη βλάβη του εντερικού φραγμού και τη δυσβίωση, αλλάζει την έκφραση των πρωτεϊνών σφιχτής σύνδεσης, αυξάνει τη διαπερατότητα του εντέρου και επιταχύνει τη γήρανση του εντέρου [7-10].

Το Cistanche deserticola, ένα πολύτιμο παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό και ομόλογο βότανο με τρόφιμα, γνωστό ως «τζινσενγκ της ερήμου», τονώνει τα νεφρά γιανγκ, θρέφει την ουσία και το αίμα και ενυδατώνει τα έντερα για να ανακουφίσει τη δυσκοιλιότητα. Οι ενεργοί πολυσακχαρίτες του παρουσιάζουν αντιγηραντικές, αντιοξειδωτικές και προστατευτικές ιδιότητες του εντέρου [11-12]. Όσον αφορά την εντερική προστασία, οι πολυσακχαρίτες Cistanche deserticola (CDPs) μπορούν να ρυθμίσουν την ισορροπία της μικροχλωρίδας του εντέρου αναστέλλοντας την ενεργοποίηση της οδού του υποδοχέα τύπου Toll 4 (TLR4)/πυρηνικού παράγοντα-κάπα Β (NF-κB), μειώνοντας έτσι τα επίπεδα LPS και επιδιορθώνοντας την εντερική λειτουργία bar–14 [3. Τα CDPs μπορούν επίσης να βελτιώσουν τη μιτοχονδριακή λειτουργία μέσω της ενεργοποίησης της οδού ενεργοποιημένης με AMP πρωτεϊνική κινάση (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1), να καθυστερήσουν την κυτταρική γήρανση, να ρυθμίσουν το μεταβολισμό των λιπιδίων και να ανακουφίσουν τη λιποτοξική βλάβη στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα [15].

Αν και οι εντερικές προστατευτικές επιδράσεις των CDPs έχουν αποδειχθεί, παραμένει ασαφές εάν βελτιώνουν την εντερική γήρανση καταστέλλοντας τη φλεγμονώδη οδό NLRP3. Αυτή η μελέτη στοχεύει να διερευνήσει τον μηχανισμό με τον οποίο τα CDPs αναστέλλουν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 σεβελτίωση της γήρανσης του εντέρου.

Υλικά

 

1.1 Πειραματόζωα

Πενήντα υγιή αρσενικά ποντίκια C57BL/6J (10 σε ηλικία 2 μηνών· 40 σε ηλικία 20 μηνών) αγοράστηκαν από την Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Άδεια παραγωγής: SYXK (Beijing) 2023-0011. Τα ζώα στεγάστηκαν σε περιβάλλον φραγμού στην Εγκατάσταση Πειραματικών Ζώων του Επαρχιακού Νοσοκομείου Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής του Hebei υπό τις ακόλουθες συνθήκες: θερμοκρασία 22 ± 2 βαθμοί, σχετική υγρασία 50% ± 10% και κύκλος φωτός 12 ωρών/12 ωρών σκότους. Όλα τα ποντίκια εγκλιματίστηκαν για 1 εβδομάδα. Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Επαρχιακού Νοσοκομείου Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής του Hebei (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Όργανα και αντιδραστήρια

 

Κρυοστάτης (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (Nikon; AX)

Σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο (Thermo Fisher; 7500)

Πολυλειτουργικός αναγνώστης πιάτων (Tecan; Spark)

Βήτα-νικοτιναμίδιο μονονουκλεοτίδιο (Bontac, Κίνα, Κατ. BT05N120A005)

SA- -κιτ χρώσης γάλακτος (Solarbio, Πεκίνο, Γάτα. 250003003)

Κιτ ποντικιού LPS ELISA (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Κατ. CSB-E13066m)

Κιτ TransZol Up Plus RNA (TransGen Biotech, Πεκίνο, Κατ. ER501-01-V2)

Μίγμα MonAmp ChemoHS qPCR (Monad; Κατ. MQ00501S)

Πολυκλωνικό αντίσωμα Lgr5 (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα, μονοκλωνικό αντίσωμα NLRP3, μονοκλωνικό αντίσωμα κασπάσης-1, μονοκλωνικό αντίσωμα ASC, μονοκλωνικό αντίσωμα GAPDH, μονοκλωνικό αντίσωμα Ki67 (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179515, ab385549, ab315249, ab30949),

Μέθοδοι

 

2.1 Παρασκευή πολυσακχαριτών Cistanche deserticola

Το υλικό Cistanche (50 g) εκχυλίστηκε δύο φορές με αφέψημα με 8-πλάσιους όγκους νερού, 1 ώρα κάθε φορά. Τα διηθήματα συνδυάστηκαν και ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Προστέθηκε άνυδρη αιθανόλη σε τελική συγκέντρωση 80% για καταβύθιση. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Το ίζημα διαλύθηκε σε νερό, υποβλήθηκε σε διαπίδυση, στη συνέχεια λυοφιλίστηκε για να ληφθεί το δείγμα.

 

2.2 Ομαδοποίηση και χορήγηση ζώων

Μετά τον εγκλιματισμό, σαράντα ποντίκια C57BL/6J 20 μηνών κατατάχθηκαν τυχαία σε: ομάδα φυσικής γήρανσης, ομάδα χαμηλής δόσης CDP (2,5 g·kg−1), ομάδα CDP υψηλής δόσης (5,0 g·kg−1) και ομάδα NMN (200 mg·kg−1). Άλλα δέκα ποντίκια 2 μηνών SPF C57BL/6J χρησίμευσαν ως νεαρή ομάδα ελέγχου. Οι χαμηλές και υψηλές δόσεις CDP χορηγήθηκαν με στοματική καθετηρίαση στα 2,5 g·kg−1 και 5,0 g·kg−1, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας τη μετατροπή της επιφάνειας του σώματος και έναν παράγοντα μετατροπής από άνθρωπο σε ποντίκι 12 [16], αυτοί αντιστοιχούν σε περίπου 1× και 2× την κλινική ισοδύναμη δόση για ενήλικες. Η ομάδα NMN έλαβε NMN 200 mg·kg−1 με καθετήρα. Νεαρές ομάδες ελέγχου και φυσικής γήρανσης έλαβαν ίσους όγκους φυσιολογικού ορού (10 mL·kg-1). Οι θεραπείες χορηγήθηκαν συνεχώς για 2 μήνες.

 

2.3 Προετοιμασία κατεψυγμένων τμημάτων

Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης νατρίου (30 mg·kg−1) και υπέστησαν ευθανασία. Η κοιλιά άνοιξε γρήγορα, το μεσεντέριο διαχωρίστηκε και ο ιστός του ειλεού συλλέχτηκε και κόπηκε στα 5 μm για κατεψυγμένες τομές [17].

 

2.4 Δοκιμασία SA- -gal για τη δραστηριότητα της εντερικής γαλακτοσιδάσης

Η χρώση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ SA- -gal. Μετά την επώαση, το διάλυμα χρώσης απομακρύνθηκε και οι τομές πλύθηκαν με PBS. Οι εικόνες συλλέχθηκαν με χρήση ανεστραμμένου μικροσκοπίου.

 

2.5 PCR πραγματικού χρόνου για εκκριτικό φαινότυπο που σχετίζεται με τη γήρανση (SASP)

Ολικό RNA από ιστό ειλεού εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ TransZol Up Plus. Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με το σύστημα GoScript υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 42 μοίρες για 15 λεπτά, 70 μοίρες για 15 λεπτά, 4 μοίρες για 10 λεπτά. Η PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθη χρησιμοποιώντας MonAmp ChemoHS qPCR Mix με τον ακόλουθο κύκλο: 95 βαθμοί 10 λεπτά. στη συνέχεια 40 κύκλοι 95 μοιρών 15 δευτ., 60 μοιρών 1 λεπτό. Καμπύλη τήξης: 95 μοίρες 15 δευτ., 60 μοίρες 15 δευτ., 95 μοίρες 15 δευτ. Η GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά και η σχετική ποσοτικοποίηση χρησιμοποίησε τη μέθοδο 2^-ΔΔCt. Τα Primers αγοράστηκαν από την Promega. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

 

2.6 Χρώση ανοσοφθορισμού για έκφραση ZO-1

Ο ιστός του ειλεού στερεώθηκε σε 4% παραφορμαλδεΰδη και τεμαχίστηκε με παραφίνη στα 5 μm. Οι τομές διαπερατήθηκαν με 0,3% Triton X-100 για 15 λεπτά και μπλοκαρίστηκαν με ορό κατσίκας 10% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το πρωτογενές αντίσωμα κατά του ZO-1 (1:200) εφαρμόστηκε όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς . Μετά από πλύσεις PBS, το συζευγμένο με Cy3 δευτερεύον αντίσωμα (1:500) επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με DAPI για 5 λεπτά. Οι διαφάνειες τοποθετήθηκαν με μέσο κατά της εξασθένισης και απεικονίστηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία. Η ένταση του φθορισμού ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro.

2.7 Ανοσοϊστοχημεία για έκφραση Ki67 και Lgr5

Οι τομές ειλεού επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα Ki67 (1:1000) και Lgr5 (1:200) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κιτ IHC, στη συνέχεια με αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα. Το DAB χρησιμοποιήθηκε για χρωμογόνο ανάπτυξη. Τα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φωτός. Η μέση οπτική πυκνότητα προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro.

 

2.8 ELISA για επίπεδα LPS

Πρότυπα και δείγματα (100 μL ανά φρεάτιο) προστέθηκαν στην πλάκα και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1,5 ώρα. Στη συνέχεια προστέθηκε διάλυμα στρεπταβιδίνης συζευγμένο με HRP (100 μL ανά φρεάτιο) και επωάστηκε για 30 λεπτά. Το υπόστρωμα προστέθηκε υπό συνθήκες προστατευμένες από το φως και αντέδρασε για 30 λεπτά. Η αντίδραση τερματίστηκε με διάλυμα διακοπής και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm.

 

2.9 Western blot για NLRP3, Caspase-1 και ASC

Περίπου 30 mg ιστού ειλεού αλέστηκαν σε υγρό άζωτο. Προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης/φωσφατάσης. τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 χ g, 4 βαθμούς για 15 λεπτά για τη συλλογή υπερκειμένων. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA και προσαρμόστηκε στα 2 ug/μL. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (20-40 ug) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 5% μη λιπαρό γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα (NLRP3 1:1000, Κασπάση-1 1:500, ASC 1:1000) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς και στη συνέχεια με συζευγμένο με HRP δευτερογενή αντισώματα: 50h0 (1 σε θερμοκρασία δωματίου). Μετά από πλύσεις TBST, αναπτύχθηκαν σήματα. Οι εντάσεις της ζώνης κανονικοποιήθηκαν σε GAPDH.

 

2.10 Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Η στατιστική ανάλυση και η γραφική παράσταση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 26.0 και GraphPad Prism 8.0.2, αντίστοιχα. Η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των διαφορών μεταξύ των ομάδων, ακολουθούμενη από το post hoc τεστ Tukey. Η στατιστική σημασία ορίστηκε στο P < 0,05.

 

Πρακτικές σημειώσεις για αναγνώστες που ενδιαφέρονται για την κινητικότητα του εντέρου και την ανάπτυξη συμπληρωμάτων

 

Λειτουργική εστίαση του Cistanche deserticola: Παραδοσιακά χρησιμοποιείται για την ύγρανση των εντέρων και την ανακούφιση της δυσκοιλιότητας. Τα σύγχρονα δεδομένα υποστηρίζουν υποστήριξη φραγμού, διαμόρφωση φλεγμονής (TLR4/NF-κB) και μιτοχονδριακή λειτουργία μέσω AMPK/SIRT1.

Πιθανός αντιγηραντικός εντερικός μηχανισμός που διερευνάται εδώ: Καταστολή της ενεργοποίησης του φλεγμονώδους NLRP3. μείωση της φλεγμονής χαμηλού βαθμού που προκαλείται από LPS. διατήρηση στενών κόμβων (π.χ. ZO-1). διατήρηση επιθηλιακών δεικτών πολλαπλασιασμού/βλαστού (Ki67, Lgr5).

Τυπικές πειραματικές από του στόματος δόσεις σε ποντίκια: 2,5–5,0 g·kg−1 CDPs για 2 μήνες. NMN 200 mg·kg−1 ως θετικός έλεγχος.

Μεταφραστική προσοχή: Οι δόσεις ποντικιού δεν είναι άμεσες συστάσεις για τον άνθρωπο. Η μελέτη χρησιμοποιεί απολέπιση της επιφάνειας του σώματος. Η σύνθεση και η ασφάλεια ισοδύναμη με τον άνθρωπο, οι δοκιμές ταυτότητας και η κατασκευή GMP είναι απαραίτητες πριν από την ανάπτυξη του προϊόντος.