Η φαρμακολογία δικτύου και η πειραματική επικύρωση αποκαλύπτουν τον μηχανιστικό ρόλο των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών του Cistanche στη θεραπεία της NAFLD μέσω της οδού TNF/PI3K/Akt

3. Αποτελέσματα

3.1 Φαρμακολογία Δικτύου

3.1.1 Ενεργές ενώσεις και πιθανοί στόχοι

Με βάση προηγούμενη έρευνα της ομάδας του έργου και πληροφορίες από βάσεις δεδομένων και βιβλιογραφία, επιλέχθηκαν δέκα αντιπροσωπευτικές ενώσεις με φαρμακολογική δράση [10-11]:βερμπασκοσίδη, ισοβερβασκοσίδη, εχινακοσίδη, 2'-ακετυλο-βερβασκοσίδη, κιστανοσίδη Α, κιστανοσίδη Β, σαλιδροσίδη, ισοκρενατοσίδη II, γλυκοσίδη κιστάνζης Α, και γλυκοσίδη της κιστάνζης F.

Υψηλής περιεκτικότητας Verbascoside (acteoside) Cistanche Extract για θεραπεία λιπιδίων αίματος

Λίστα προδιαγραφών εκχυλίσματος Cistanche

Επικοινωνήστε μαζί μας αγοράστε τώρα

ΧρησιμοποιώνταςSwissTargetPredictionΕπιτεύχθηκαν 44 στόχοι.NetInferπροέβλεψε τους 20 κορυφαίους στόχους, αποδίδοντας 45 στόχους.SuperPredαπέδωσε 118 στόχους. Μετά τη συγχώνευση και την αφαίρεση των διπλότυπων,195 μοναδικοί στόχοιταυτοποιήθηκαν.

Από τοGSE89632σύνολο δεδομένων, το οποίο περιελάμβανε 39 δείγματα NAFLD και 24 κανονικά δείγματα,589 διαφορικά εκφρασμένα γονίδιαπροβλήθηκαν. Συνδυασμός δεδομένων απόGeneCardsκαιDisGeNET, 2.315 γονίδια ασθενειών που σχετίζονται με NAFLDελήφθησαν μετά την αφαίρεση των διπλών (Εικόνες 1Α-1Β). Διασταυρώνοντας στόχους που σχετίζονται με την ένωση με στόχους ασθενειών,77 επικαλυπτόμενοι στόχοιταυτοποιήθηκαν ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών Cistanche έναντι της NAFLD (Εικόνα 1C).

Αυτοί οι στόχοι εισήχθησαν στοΣΕΙΡΑ database with an interaction threshold >0,400. Οι απομονωμένοι κόμβοι αφαιρέθηκαν και το δίκτυο οπτικοποιήθηκε μέσωCytoscape, με αποτέλεσμα αΔίκτυο PPI με 75 κόμβους και 408 άκρες(Εικόνα 1Δ). Χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση "Analyze Network" στο Cytoscape, οι 10 κορυφαίοι στόχοι με βάση την τιμή πτυχίου προσδιορίστηκαν ως βασικοί στόχοι:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.

3.1.2 Αναλύσεις εμπλουτισμού GO, KEGG και DO

Η ανάλυση εμπλουτισμού GO αποκάλυψε 93 όρους γιαμοριακή συνάρτηση (MF), 38 γιακυψελοειδές συστατικό (CC)και 989 γιαβιολογική διεργασία (BP). Οι 10 κορυφαίες συμμετοχές σε κάθε κατηγορία απεικονίστηκαν (Εικόνα 2). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες Cistanche μπορεί να ασκούν αντι-NAFLD αποτελέσματα μέσω οδών που σχετίζονται μεφλεγμονή, κυτοκίνες, μεταβολισμός και ανοσοαπόκριση.

Εντοπίστηκε DO εμπλουτισμός833 ασθένειεςπου σχετίζονται με τους στόχους, με τους κορυφαίους 25 οπτικοποιημένους (Εικόνα 4), συμπεριλαμβανομένωνμεταβολικές, ανοσολογικές, καρδιαγγειακές, σχετιζόμενες με την παχυσαρκία και ηπατικές παθήσεις, όλα στενά συνδεδεμένα με το NAFLD.

3.1.3 Δίκτυο "Σύνθετο-Στόχος-Διάδρομος".

Με βάση τα αποτελέσματα εμπλουτισμού KEGG, αδίκτυο "σύνθετος-στόχος-διαδρομή".κατασκευάστηκε χρησιμοποιώνταςCytoscape 3.9.1. Τα πράσινα τετράγωνα αντιπροσωπεύουν ενεργές ενώσεις, οι μπλε κύκλοι αντιπροσωπεύουν στόχους και οι πορτοκαλί κόμβοι σε σχήμα V αντιπροσωπεύουν μονοπάτια (Εικόνα 5). Αυτό δείχνει ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες Cistanche ασκούν αντι-NAFLD αποτελέσματα μέσωπολλαπλές ενώσεις, στόχους και μονοπάτια, μεεχινακοσίδη και βερμπασκοσίδηείναι οι πιο άφθονες και καταχωρημένες ενώσεις δεικτών στην έκδοση 2020 τουΚινεζική Φαρμακοποιία.

3.1.4 Μοριακή σύνδεση

Οι πέντε κορυφαίοι βασικοί στόχοι στο δίκτυο PPI (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1) συνδέθηκαν με τις δραστικές ενώσεις και υπολογίστηκαν οι ελάχιστες ενέργειες δέσμευσής τους (Εικόνα 6). Όλες οι βαθμολογίες ελλιμενισμού ήταν μικρότερες από–6 kcal/mol, υποδεικνύοντας ισχυρές δεσμευτικές συγγένειες.Το TNF εμφάνισε την ισχυρότερη συγγένεια. Ορισμένα αποτελέσματα σύνδεσης οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώνταςPyMOL(Εικόνα 7).

3.2 Πειράματα κυττάρων

3.2.1 Επιδράσεις του FFA στη Συσσώρευση Λιπιδίων σε Κύτταρα HepG2

Όπως φαίνεται στοΕικόνα 8, η αύξηση των συγκεντρώσεων FFA από 0,5 σε 2 mmol/L οδήγησε σε αύξηση των κόκκινων σταγονιδίων λιπιδίων, τα οποία συγχωνεύτηκαν σε μεγάλα σταγονίδια λιπιδίων, υποδεικνύοντας επιτυχή φόρτωση λιπιδίων.

3.2.2 Επιδράσεις των FFA και των Cistanche φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών στη βιωσιμότητα των κυττάρων

Όπως φαίνεται στοΕικόνα 9Α, συγκεντρώσεις FFA του1 mmol/L και κάτωδεν είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων (P > 0,05). έτσι,1 mmol/Lεπιλέχθηκε για μόντελινγκ. Όπως φαίνεται στοΕικόνα 9Β, Cistanche φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες μέχρι200 μg/mLδεν επηρέασε σημαντικά τη βιωσιμότητα (P > 0,05), αλλά400 μg/mLανέστειλε σημαντικά τη βιωσιμότητα (P <0,01). Επομένως,25, 50 και 100 μg/mLεπιλέχθηκαν ως χαμηλές, μεσαίες και υψηλές δόσεις για θεραπεία.

3.2.3 Επιδράσεις στη συσσώρευση λιπιδίων

Όπως φαίνεται στοΕικόνα 10, η ομάδα μοντέλου εμφάνισε σημαντική συσσώρευση κόκκινων σταγονιδίων λιπιδίων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (P <0,01), επιβεβαιώνοντας την επιτυχημένη μοντελοποίηση. Θεραπεία με50 και 100 μg/mLτων γλυκοσιδών φαινυλαιθανοειδών Cistanche μείωσαν σημαντικά τον σχηματισμό σταγονιδίων λιπιδίων (P < 0,01). ΣεΕικόνα 11, τα επίπεδα TG και TC ήταν αυξημένα στην ομάδα μοντέλου (P < 0,01), ενώ όλες οι ομάδες θεραπείας εμφάνισαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου (P < 0,01).

3.2.4 Επιδράσεις στη μιτοχονδριακή βλάβη

Η βαφή JC-1 συσσωρεύεται σε υγιή μιτοχόνδρια και εκπέμπει κόκκινο φθορισμό. σε κατεστραμμένα μιτοχόνδρια, παραμένει σε μονομερή μορφή και εκπέμπει πράσινο φθορισμό. Όπως φαίνεται στοΕικόνα 12, ο κόκκινος φθορισμός κυριάρχησε στην ομάδα ελέγχου, ενώ ο πράσινος φθορισμός ήταν εμφανής στην ομάδα του μοντέλου. Οι ομάδες θεραπείας έδειξαν μειωμένο πράσινο φθορισμό και αυξημένο κόκκινο φθορισμό, υποδεικνύοντας βελτιωμένο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης.

3.2.5 Επιδράσεις στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS

Όπως φαίνεται στοΕικόνα 13, η ομάδα μοντέλων εμφάνισε σημαντικά αυξημένη ένταση φθορισμού (P <0,01), υποδεικνύοντας αυξημένο ROS. Η θεραπεία με γλυκοσίδες φαινυλαιθανοειδών Cistanche μείωσε σημαντικά τα επίπεδα ROS σε όλες τις συγκεντρώσεις (P < 0,01).

3.2.6 Επιδράσεις στην απόπτωση

Το Hoechst 33342 χρωματίζει πυρήνες, με αποπτωτικούς πυρήνες να εμφανίζουν φωτεινό μπλε, συμπυκνωμένη ή κατακερματισμένη μορφολογία. Όπως φαίνεται στοΕικόνα 14, η ομάδα ελέγχου είχε ελάχιστο φωτεινό φθορισμό, ενώ η ομάδα μοντέλου παρουσίασε άφθονους φωτεινούς μπλε αποπτωτικούς πυρήνες. Οι ομάδες θεραπείας εμφάνισαν μειωμένη ένταση φθορισμού, υποδεικνύοντας μειωμένη απόπτωση.

3.2.7 Επιδράσεις στο TNF/PI3K/Akt Signaling Pathway και στην έκφραση Bax

Όπως φαίνεται στοΕικόνα 15, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η ομάδα μοντέλου έδειξε σημαντικά αυξημένη έκφραση τουTNF-α, PI3K p85, Akt και Baxπρωτεΐνες (Ρ < 0,05, Ρ < 0,01). Κατά τη θεραπεία:

Όλες οι ομάδες γλυκοζιτών φαινυλαιθανοειδών Cistanche έδειξαν μειωμένεςTNF-αέκφραση (P <0,01),

Ο50 μg/mLη ομάδα παρουσίασε μειωμένηPI3K p85έκφραση (P <0,01),

Ο100 μg/mLη ομάδα παρουσίασε μειωμένηΑκτ και Μπαξέκφραση (Ρ < 0,05).

4. Συζήτηση

Η NAFLD είναι μια πολύπλοκη ηπατική νόσος που σχετίζεται με μεταβολικές διαταραχές, που αφορούνανισορροπία του μεταβολισμού των λιπιδίων, αντίσταση στην ινσουλίνη και οξειδωτικό στρες[12]. Τα τελευταία χρόνια,παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM)έχει δείξει σημαντική υπόσχεση στη θεραπεία της NAFLD.

Η σύγχρονη έρευνα το έχει αποκαλύψειφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες από το Cistancheμπορεί να ρυθμίσει το μεταβολισμό των λιπιδίων και της γλυκόζης στο ήπαρ και να αναστείλει το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή και την ίνωση [13-15]. Το συκώτι χρησιμοποιείβ-οξείδωσηνα μεταβολίζει τα λιπαρά οξέα καιCYP7A1για τη μετατροπή της χοληστερόλης σε χολικά οξέα για την ομοιόσταση των λιπιδίων [16-18]. Σε περιβάλλοντα με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, η μεταβολική ανισορροπία οδηγεί σε συσσώρευση λιπιδίων και NAFLD [19].

Αυτή η μελέτη το επιβεβαίωσεΚύτταρα HepG2 που προκαλούνται από FFAπαρουσίασαν αυξημένα σταγονίδια λιπιδίων και αυξημένα επίπεδα TC και TG. Η θεραπεία με γλυκοσίδες φαινυλαιθανοειδών Cistanche μείωσε σημαντικά τον σχηματισμό σταγονιδίων λιπιδίων και τα επίπεδα TC/TG, βελτιώνοντας την ηπατική στεάτωση.

Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία οδηγεί σε μειωμένη β-οξείδωση, υπερβολική παραγωγή ROS και υπεροξείδωση λιπιδίων [20]. Το ROS καταστρέφει περαιτέρω τα μιτοχόνδρια, επιδεινώνοντας τη στεάτωση [21]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistancheμείωση ROS, βελτίωσηδυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, και ανακουφίζειοξειδωτικό στρες, μετριάζοντας έτσι τη συσσώρευση λίπους.

Η φαρμακολογία δικτύου έδειξε ότι τα αποτελέσματα κατά του NAFLD περιλαμβάνουν πολλαπλάμεταβολικές και σχετιζόμενες με την απόπτωση μονοπάτια. Η μοριακή σύνδεση έδειξε ισχυρές συγγένειες δέσμευσης μεταξύ δραστικών ενώσεων και στόχων, ιδιαίτεραTNF, υποδηλώνοντας τον κεντρικό του ρόλο.

ΟΜονοπάτι TNFείναι κρίσιμο στη σηματοδότηση κυψελών. Ο TNF-α συνδέεται μεTNFR1, ενεργοποιώντας τις οδούς των υποδοχέων θανάτου και επάγοντας απόπτωση [22]. Ενεργοποιεί επίσης τοΜονοπάτι PI3K/Aktμέσω παρακρινής σηματοδότησης [23-24]. Η μη φυσιολογική σηματοδότηση PI3K/Akt συνδέεται με τη συσσώρευση λιπιδίων, τη φλεγμονή και την ίνωση στο NAFLD [25]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistancheαναστέλλουν την απόπτωσηκαι να μειώσει την έκφραση τουTNF-α, PI3K, Akt, καιΜπαξ, σύμφωνα με τις προβλέψεις δικτύου, επιβεβαιώνοντας τη σημασία τουTNF/PI3K/Akt μονοπάτι.

Σύναψη

Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche ρυθμίζουν τη NAFLD μέσωπολλαπλές διαδικασίες και μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένων:

Μείωση της συσσώρευσης λιπιδίων,

Αναστολή οξειδωτικού στρες,

Ανακούφιση της μιτοχονδριακής βλάβης,

Καταστολή της απόπτωσης.

Αυτές οι επιπτώσεις μπορεί να συνδέονται στενά με τηνΔιαδρομή σηματοδότησης TNF/PI3K/Akt. Αυτή η μελέτη παρέχει όχι μόνο επιστημονική υποστήριξη για την εφαρμογή των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών Cistanche στη θεραπεία NAFLD, αλλά και μια αναφορά για την ανάπτυξη και την κλινική έρευνα νέων θεραπευτικών φαρμάκων.