Περίληψη

Η παρούσα εφεύρεση αποκαλύπτει αΕκχύλισμα Cistanche για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας (BMD). Στο απόσπασμα, τοσυνολική περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη (βερμπασκοσίδη)είναι>25 wt%. Το εκχύλισμα παρασκευάζεται με εκτέλεσηεξαγωγή απεσταγμένου νερούτουακατέργαστη σκόνη τουCistanche tubulosa, ακολουθούμενο απόδιήθηση, φυγοκέντρησητου διηθήματος,συγκέντρωση, εκχύλιση υγρού-υγρού, συγκέντρωση με αφαίρεση ακαθαρσιών, διάλυση, μετά τη θεραπεία, και μετάτελική συμπύκνωση και ξήρανσηγια να λάβετε το εκχύλισμα Cistanche.

 

 

Διαδικασία εκχυλίσματος Cistanche

Στο εκχύλισμα Cistanche για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας σύμφωνα με την εφεύρεση, τοσυνολική περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδηείναι25–30% κ.β.(χωρίς 25% κ.β.), και το εκχύλισμα είναι επίσης πλούσιο σεσικιμικό οξύκαθώς καισυστατικά τύπου φαινυλοπροπιονικού οξέοςκαισυστατικά αλκαλοειδούς τύπου, δίνοντάς του τη δυνατότητα ναασκούν σταθερά ένα αποτέλεσμα βελτίωσης της οστικής πυκνότητας.

 

Αξιώσεις

1. Μέθοδος Παρασκευής

Μια μέθοδος παρασκευής εκχυλίσματος Cistanche για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας, που χαρακτηρίζεται από το ότι περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

συντριπτικόςCistanche tubulosaγια να ληφθεί ακατέργαστη σκόνη τουCistanche tubulosa;

προσθέτοντας απεσταγμένο νερό στην ακατέργαστη σκόνη τουCistanche tubulosaγια εκχύλιση, διήθηση, φυγοκέντρηση του διηθήματος και συμπύκνωση για να ληφθεί ένα συμπυκνωμένο διάλυμαCistanche tubulosa;

εκχύλιση του συμπυκνωμένου διαλύματος τουCistanche tubulosa, συμπύκνωση της κατώτερης φάσης εκχύλισης για την απομάκρυνση των ακαθαρσιών και αραίωση για να ληφθεί ένα διάλυμα φόρτωσης.

μεταγενέστερη επεξεργασία του διαλύματος φόρτωσης, ακολουθούμενη από συμπύκνωση και ξήρανση για να ληφθεί το εκχύλισμα Cistanche.

2. Αναλογία Υλικού προς Νερό

2. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου η αναλογία μάζας προς όγκο της ακατέργαστης σκόνηςCistanche tubulosaσε απεσταγμένο νερό είναι1 : (15–25).

3. Θερμοκρασία εξαγωγής

2. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου η θερμοκρασία εκχύλισης απεσταγμένου νερού είναι60-100 μοίρες.

4. Αναλογία κατά την εκχύλιση υγρού-υγρού

2. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου κατά την εκχύλιση του συμπυκνωμένου διαλύματος, η αναλογία όγκου του συμπυκνωμένου διαλύματοςCistanche tubulosaγια την εκχύλιση διαλύτης είναι1 : (1–5).

5. Διαλύτης εκχύλισης

5. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 4, όπου ο διαλύτης εκχύλισης περιλαμβάνει τουλάχιστον ένα απόπετρελαϊκός αιθέρας, οξικός αιθυλεστέρας, η-εξάνιο ή κυκλοεξάνιο.

6. Μετα-θεραπευτική διαδικασία

2. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου η μετεπεξεργασία του διαλύματος φόρτωσης περιλαμβάνει: διέλευση του διαλύματος φόρτωσης μέσωμακροπορώδης ρητίνη, και στη συνέχεια έκλουση διαδοχικά μεαπεσταγμένο νερόκαι μιαδιάλυμα αιθανόλης.

7. Όγκοι έκλουσης

7. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 6, όπου η αναλογία όγκου του απεσταγμένου νερού προς τη μακροπορώδη ρητίνη είναι(5–10) : 1και η αναλογία όγκου του διαλύματος αιθανόλης προς τη μακροπορώδη ρητίνη είναι(3–9) : 1.

8. Το Απόσπασμα

8. Εκχύλισμα Cistanche για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας, που χαρακτηρίζεται από το ότι παρασκευάζεται σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις Αξιώσεις 1-7.

9. Περιεχόμενο ενεργού δείκτη

9. Το εκχύλισμα Cistanche σύμφωνα με την αξίωση 8, όπου η συνολική περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη είναι25–30% κ.β., χωρίς 25% κ.β..

10. Εφαρμογή

10. Χρήση του εκχυλίσματος Cistanche σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις Αξιώσεις 8-9 για την παρασκευή ενός προϊόντος για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας, όπου η συγκέντρωση του εκχυλίσματος Cistanche στο προϊόν είναι12,5–25 ug/mL.

 

Τεχνικό Πεδίο

[0001] Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται στον τομέα τουιατρικά σκευάσματα, και αφορά συγκεκριμένα αΕκχύλισμα Cistanche για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας, τουμέθοδος παρασκευής, καιεφαρμογές.

Φόντο

[0002] Το Cistanche αναφέρεται στο αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος με λέπια των φυτών OrobanchaceaeCistanche deserticola YC MaήCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Το Cistanche έχει πολλαπλές δραστηριότητες όπως π.χανοσολογική ρύθμιση, αντιφλεγμονώδη, κατά της κούρασης, αντιοξειδωτικό, νευροπροστατευτικό, καιυποστήριξη του αναπαραγωγικού συστήματος.

Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs)-μεεχινακοσίδηκαιακτεοσίδη (βερμπασκοσίδη)Όντας τα κύρια PhG στο Cistanche-είναι σημαντικά συστατικά.Εχινακοσίδηέχει αποδειχθεί ότι έχει επίδραση στηνβελτίωση της οστικής πυκνότητας. Ωστόσο, διαπιστώσαμε ότι η επίδραση της βελτίωσης της οστικής πυκνότητας των εκχυλισμάτων Cistanche είναιδεν συσχετίζεται αποκλειστικά με την περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη. Απλώς έλεγχος της περιεκτικότητας σε εχινακοσίδηδεν μπορεί να εξασφαλίσειότι το απόσπασμα θασταθερώςασκούν δράση βελτίωσης της οστικής πυκνότητας. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να αναπτυχθεί ένα εκχύλισμα Cistanche και μια μέθοδος παρασκευής που μπορείσταθερώςπροσφέρει το επιθυμητό αποτέλεσμα υποστήριξης της οστικής πυκνότητας.

[0003] Αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας κινεζικής εφεύρεσηςCN102441040Aαποκαλύπτει μια μέθοδο παρασκευής για ολικούς φαινυλαιθανοειδείς γλυκοζίτες από την Cistanche μέσω κονιοποίησης, εκχύλισης, προσρόφησης μακροπορώδους ρητίνης, έκλουσης, συμπύκνωσης, κ.λπ. Ωστόσο, δεν επαληθεύει εάν το προϊόν μπορείσταθερώςβελτίωση της οστικής πυκνότητας.

Αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας κινεζικής εφεύρεσηςCN105111255Aαποκαλύπτει μια μέθοδο εκχύλισης και διαχωρισμού εχινακοσίδης και ακτεοσίδης από το Cistanche, χρησιμοποιώντας 75% αιθανόλη ως διαλύτη εκχύλισης, AB-8 μακροπορώδη ρητίνη ως υλικό πλήρωσης και 55% έκλουση αιθανόλης, δίνοντας ένα εκχύλισμα Cistanche με εχινακοσίδη > 25%, ολική πλευρά > 0s0% Acte > 25%. Ωστόσο, μπορεί να μην εγγυάται ασταθερόςαποτέλεσμα βελτίωσης της οστικής πυκνότητας.

 

Περίληψη της εφεύρεσης

[0004] Για την ανάπτυξη ενός εκχυλίσματος και μεθόδου παρασκευής Cistanche που μπορείσταθερώςυποστηρίζει τη βελτιωμένη οστική πυκνότητα, η εφεύρεση παρέχει:

Πρώτη πτυχή: Μέθοδος προετοιμασίας

Μια μέθοδος παρασκευής εκχυλίσματος Cistanche για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας, που περιλαμβάνει:

συντριπτικόςCistanche tubulosaγια να ληφθεί ακατέργαστη σκόνη.

εκχύλιση της ακατέργαστης σκόνης με απεσταγμένο νερό, διήθηση, φυγοκέντρηση και συμπύκνωση για να ληφθεί ένα συμπυκνωμένο διάλυμα.

Εκτέλεση εξαγωγής? συμπύκνωση της κατώτερης φάσης για την αφαίρεση ακαθαρσιών. αραίωση για να ληφθεί διάλυμα φόρτωσης.

μεταγενέστερη επεξεργασία του διαλύματος φόρτωσης, συμπύκνωση και ξήρανση για να ληφθεί το εκχύλισμα Cistanche.

[0005] Σε μία υλοποίηση, η ακατέργαστη σκόνη διέρχεται μέσω α40-meshκόσκινο.

[0006] Σε μία υλοποίηση, η αναλογία μάζας προς όγκο ακατέργαστης σκόνης προς απεσταγμένο νερό είναι1 : (15–25).

[0007] Σε μία υλοποίηση, ο λόγος μάζας προς όγκο είναι1 : 20.

[0008] Σε μία υλοποίηση, η θερμοκρασία εκχύλισης είναι60-100 μοίρες.

[0009] Σε μία υλοποίηση, η θερμοκρασία εκχύλισης είναι80 μοίρες.

[0010] Σε μία υλοποίηση, πραγματοποιείται εκχύλιση1-2 φορές, 1 ώρα κάθε φορά.

[0011] Σε μία υλοποίηση, η διήθηση πραγματοποιείται μέσω ενός80-meshφίλτρο.

[0012] Σε μία υλοποίηση, η ταχύτητα φυγοκέντρησης είναι3000–4000 r/minκαι ο χρόνος είναι3–9 λεπτά.

[0013] Σε μία υλοποίηση, η ταχύτητα φυγοκέντρησης είναι3500 r/minκαι ο χρόνος είναι5 min.

[0014] Σε μία υλοποίηση, μετά τη φυγοκέντρηση, το διήθημα συμπυκνώνεται σε70 μοίρεςνα18%–28%του αρχικού όγκου.

[0015] Σε μία υλοποίηση, κατά την εκχύλιση του συμπυκνωμένου διαλύματος, η αναλογία όγκου του συμπυκνωμένου διαλύματος προς τον διαλύτη εκχύλισης είναι1 : (1–5).

[0016] Σε μία υλοποίηση, η αναλογία είναι1 : 3.

[0017] Σε μία υλοποίηση, ο διαλύτης εκχύλισης περιλαμβάνει τουλάχιστον ένα από ταπετρελαϊκός αιθέρας, οξικός αιθυλεστέρας, η-εξάνιο ή κυκλοεξάνιο.

[0018] Σε μία υλοποίηση, η εκχύλιση πραγματοποιείται διαδοχικά χρησιμοποιώνταςπετρελαϊκός αιθέραςακολουθούμενη απόοξεικός αιθυλεστέρας.

[0019] Σε μία υλοποίηση, "συγκέντρωση με αφαίρεση ακαθαρσιών" σημαίνει συμπύκνωση της κατώτερης φάσης εκχύλισης σε πάστα, διάλυσή της σε300 mL υδατικής αιθανόλης 50 wt%.για την αφαίρεση ακαθαρσιών και προσαρμογή σε1,0–1,5 g ακατέργαστου βοτάνου ανά mLως λύση φόρτωσης.

[0020] Σε μία υλοποίηση, η συγκέντρωση διαλύματος φόρτωσης είναι1,0–1,5 g ακατέργαστου βοτάνου/mL νερού.

[0021] Σε μία υλοποίηση, η μετεπεξεργασία περιλαμβάνει τη διέλευση του διαλύματος φόρτωσης μέσωμακροπορώδης ρητίνη, και στη συνέχεια έκλουση διαδοχικά μεαπεσταγμένο νερόκαι μιαδιάλυμα αιθανόλης.

[0022] Σε μία υλοποίηση, ο ρυθμός ροής φόρτωσης μέσω της μακροπορώδους ρητίνης είναι1–5 mL/min.

[0023] Σε μία υλοποίηση, η ρητίνη είναιAB-8 μακροπορώδης ρητίνημε όγκο ρητίνης από0.93 L.

[0024] Σε μία υλοποίηση, η αναλογία όγκου απεσταγμένου νερού προς ρητίνη είναι(5–10) : 1και η αναλογία όγκου διαλύματος αιθανόλης προς ρητίνη είναι(3–9) : 1.

[0025] Σε μία υλοποίηση, η αναλογία όγκου απεσταγμένου νερού προς ρητίνη είναι7 : 1και η αναλογία διαλύματος αιθανόλης προς ρητίνη είναι6 : 1.

[0026] Σε μία υλοποίηση, το διάλυμα αιθανόλης είναι80% (β/β) υδατική αιθανόλη.

Δεύτερη όψη: Το απόσπασμα

[0027] Η εφεύρεση παρέχει περαιτέρω ένα εκχύλισμα Cistanche που παρασκευάζεται με την παραπάνω μέθοδο.

[0028] Σε μία υλοποίηση, η συνολική περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη είναι25–30% κ.β., εξαιρουμένου του 25 wt%.

Τρίτη πτυχή: Χρήση

[0029] Η εφεύρεση παρέχει περαιτέρω χρήση του εκχυλίσματος Cistanche στην παρασκευή προϊόντων για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας, όπου η συγκέντρωση εκχυλίσματος στο προϊόν είναι12,5–25 ug/mL.

 

Πλεονεκτήματα / Ευεργετικά αποτελέσματα

Σε σύγκριση με την προηγούμενη τεχνική, η εφεύρεση έχει τα ακόλουθα ευεργετικά αποτελέσματα:

Το εκχύλισμα Cistanche περιέχει25–30% κ.β.ολική εχινακοσίδη και ακτεοσίδη, και είναι πλούσια σεσικιμικό οξύ, συστατικά τύπου φαινυλοπροπιονικού οξέος, αλκαλοειδή, καιλιπαρά οξέα, δίνοντάς του τη δυνατότητα νασταθερώςυποστηρίζουν τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας.

Εντός του12,5–25 ug/mLεύρος συγκέντρωσης, το εκχύλισμα προάγει τον πολλαπλασιασμό τουMC3T3-E1κύτταρα με εξαιρετική πολλαπλασιαστική δράση.

Το εκχύλισμα δείχνει την ίδια δοσοεξαρτώμενη τάση στην προώθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καιδραστηριότητα ALPκαι μπορεί να προωθήσει σταθερά τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση. Στην προώθηση της ανοργανοποίησης των οστεοβλαστών, παρουσιάζει καλύτερη επίδραση από τον θετικό έλεγχο17 -οιστραδιόλη.

Το εκχύλισμα διεγείρει τους ειδικούς για τους οστεοβλάστες μεταγραφικούς παράγοντεςRunx2καιOsx, ενισχύει τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και προάγει την έκφραση οστεογονικών δεικτώνOPNκαιOCN, προάγοντας έτσι τον σχηματισμό οστών. Αυξάνεται επίσηςBmp2 mRNAέκφραση για την ενίσχυση της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών και του σχηματισμού νέου οστού με την ενεργοποίηση τουΔιαδρομή BMP/Smad; επιπλέον, με τη ρύθμισηLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, καιWnt3 mRNA, ενεργοποιείταιWnt/ -catenin σηματοδότηση, επηρεάζει την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα κατάντη και προάγει τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και τον σχηματισμό οστού.

Η μέθοδος παρασκευής αποδίδει ένα εκχύλισμα που περιέχει φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίτες (εχινακοσίδη και ακτεοσίδη), σικιμικό οξύ και φαινυλοπροπιονικά οξέα, αλκαλοειδή και λιπαρά οξέα. Αυτά τα συστατικά μαζί επιτρέπουν στο εκχύλισμα να εμφανίζει σταθερή δοσοεξαρτησία στον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την ανοργανοποίηση, επιτρέποντας σταθερά αποτελέσματα υποστήριξης της οστικής πυκνότητας.

 

Σύντομη περιγραφή των σχεδίων

[0035] Εικ. 1: Επίδραση του εκχυλίσματος (Παράδειγμα 1) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MC3T3-E1
Εικ. 2: Επίδραση του εκχυλίσματος (Παράδειγμα 2) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MC3T3-E1
Εικ. 3: Επίδραση του εκχυλίσματος (Παράδειγμα 3) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MC3T3-E1
Εικ. 4: Επίδραση του εκχυλίσματος (Παράδειγμα 1) στη δραστηριότητα ALP
Εικ. 5: Επίδραση του εκχυλίσματος (Παράδειγμα 2) στη δραστηριότητα ALP
Εικ. 6: Επίδραση του εκχυλίσματος (Παράδειγμα 3) στη δραστηριότητα ALP
Εικ. 7: Φωτογραφίες από χρώση Alizarin Red της ανοργανοποίησης των οστεοβλαστών (Παράδειγμα 2)
Εικ. 8: Ποσοτικά αποτελέσματα ανοργανοποίησης οστεοβλαστών (Παράδειγμα 2)
Εικ. 9–12: Επιδράσεις του Παραδείγματος 2 στην έκφραση mRNA Runx2, Osx, Opn, Ocn
Εικ. 13: Επίδραση του Παραδείγματος 2 στην έκφραση mRNA Bmp2 (BMP/Smad)
Εικ. 14–16: Επιδράσεις του Παραδείγματος 2 στην έκφραση mRNA Lrp5, Wnt3, Lrp6 (Wnt/-κατενίνη)
Εικ. 17–18: Επιδράσεις του Παραδείγματος 2 στην έκφραση πρωτεϊνών Osx και RUNX2

 

Λεπτομερής Περιγραφή / Ενσωματώσεις

Παράδειγμα 1

[0036] Μια μέθοδος παρασκευής περιλαμβάνει:

συντριπτικόςCistanche tubulosa, περνώντας από κόσκινο 40 mesh για να ληφθεί200 gακατέργαστη σκόνη?

εξαγωγή μεαπεσταγμένο νερό σε μάζα 5×(όπως περιγράφεται), εξαγωγή στο75 μοίρεςγια2 φορές, 1 ώρα το καθένα, συγκεντρώνοντας στο70 μοίρεςσε αναλογία συγκέντρωσης1 : 2.2για να ληφθεί ένα συμπυκνωμένο διάλυμα.

προσθήκη απόλυτης αιθανόλης στο συμπυκνωμένο διάλυμα για βαθμονομημένη καθίζηση αιθανόλης με τελικές συγκεντρώσεις μάζας αιθανόλης20%, 40%, 60%, 80%, κατακρημνίζοντας σε5 βαθμούς για 24 ώρες, συλλέγοντας το υπερκείμενο μετά80 wt%καθίζηση αιθανόλης;

συμπύκνωση και ξήρανση σε70 μοίρεςγια να ληφθεί το εκχύλισμα Cistanche, με απόδοση20.75%.

Παράδειγμα 2

[0037] Μια μέθοδος παρασκευής περιλαμβάνει:

συντριπτικόςCistanche tubulosaνα αποκτήσει240 gακατέργαστη σκόνη?

εκχύλιση με απεσταγμένο νερό, διήθηση, φυγοκέντρηση και συμπύκνωση για τη λήψη συμπυκνωμένου διαλύματος.

εκχύλιση του συμπυκνωμένου διαλύματος. συμπύκνωση της κατώτερης φάσης για την αφαίρεση ακαθαρσιών. αραίωση για να ληφθεί διάλυμα φόρτωσης.

μετεπεξεργασία του διαλύματος φόρτωσης. συμπύκνωση και ξήρανση σε70 μοίρεςγια να ληφθεί το εκχύλισμα, με απόδοση του19.69%.

[0038] Η ακατέργαστη σκόνη διέρχεται από κόσκινο 40 mesh.
[0039] Η αναλογία μάζας προς όγκο ακατέργαστης σκόνης προς απεσταγμένο νερό είναι1 : 20.
[0040] Η θερμοκρασία εξαγωγής είναι80 μοίρες.
Πραγματοποιείται εκχύλιση1-2 φορές, 1 ώρα το καθένα.
[0042] Το φιλτράρισμα γίνεται μέσω ενός80-meshφίλτρο.
Η φυγοκέντρηση είναι3500 r/min για 5 λεπτά.
[0044] Συγκέντρωση μετά τη φυγοκέντρηση: συμπύκνωση σε70 μοίρεςνα20%αρχικού όγκου.
Κατά την εκχύλιση, η αναλογία όγκου συμπυκνωμένου διαλύματος προς διαλύτη είναι1 : 3.
[0046] Η εξαγωγή εκτελείται διαδοχικά μεπετρελαϊκός αιθέραςκαιοξεικός αιθυλεστέρας.
[0047] Η κατώτερη φάση συμπυκνώνεται σε πάστα και διαλύεται μέσα300 mL υδατικής αιθανόλης 50 wt%.για την απομάκρυνση των ακαθαρσιών.
[0048] Συγκέντρωση διαλύματος φόρτωσης:1,0 g ακατέργαστου βοτάνου/mL νερού.
[0049] Μετά την επεξεργασία: περάστε από μακροπορώδη ρητίνη, έκλουση με απεσταγμένο νερό και μετά διάλυμα αιθανόλης.
[0050] Ρυθμός ροής μέσω ρητίνης:3 mL/min.
[0051] Ρητίνη:AB-8, όγκος ρητίνης0.93 L.
[0052] Αναλογία όγκου απεσταγμένου νερού προς ρητίνη:7 : 1. Αναλογία αιθανόλης διαλύματος προς ρητίνη:6 : 1.
[0053] Διάλυμα αιθανόλης:80% (w/w)υδατική αιθανόλη.

 

Κάντε κλικ για να μάθετε περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το εργοστάσιο cistanche

Παράδειγμα 3

[0053] Μια μέθοδος παρασκευής περιλαμβάνει:

συντριπτικόςCistanche tubulosa, περνώντας από κόσκινο 40 mesh για να ληφθεί120 gακατέργαστη σκόνη?

εξαγωγή με12× μάζατου50% κ.β. υδατική αιθανόλη, εξαγωγή στο70 μοίρες, 2 φορές, 1 ώρα το καθένα, συγκεντρώνοντας στο70 μοίρεςσε αναλογία1 : 2.5για να ληφθεί ένα συμπυκνωμένο διάλυμα.

προσθέτοντας νερό για να ρυθμίσετε τη συγκέντρωση0,2 g ακατέργαστου βοτάνου/mL νερού, φυγοκέντρηση στο3500 r/min για 5 λεπτάλαμβάνοντας το υπερκείμενο ως διάλυμα φόρτωσης.

διέλευση μέσω μακροπορώδους ρητίνης. διαδοχική έκλουση με απεσταγμένο νερό και διάλυμα αιθανόλης. συλλογή της έκλουσης αιθανόλης και συμπύκνωση/ξήρανση σε70 μοίρεςγια να ληφθεί το εκχύλισμα με απόδοση του24.30%.

[0054] Ρητίνη:HPD750, όγκος ρητίνης0.93 L.
[0055] Αναλογία απεσταγμένου νερού προς ρητίνη:3 : 1. Αναλογία αιθανόλης διαλύματος προς ρητίνη:4 : 1.
[0056] Διάλυμα αιθανόλης:30% (w/w)υδατική αιθανόλη.

 

Δοκιμή απόδοσης

1.1 Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού Κυττάρου

Οι οστεοβλάστες είναι τα κύρια λειτουργικά κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τον σχηματισμό οστού, που περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό των προ-οστεοβλαστών, την παραγωγή οστικής θεμέλιας ουσίας και την τελική διαφοροποίηση. ΟMC3T3-E1Η κυτταρική σειρά χρησιμοποιείται συνήθως για τη μελέτη της οστεογονικής δραστηριότητας. Η διαφοροποίηση των οστεοβλαστών περιλαμβάνει πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και ανοργανοποίηση που εκδηλώνεται ως αυξημένος αριθμός προ-οστεοβλαστών, ωρίμανση σε οστεοβλάστες και σχηματισμός νέας οστικής μήτρας.

Αλκαλική φωσφατάση (ALP)είναι μια πρωτεΐνη που σχετίζεται με τον φαινότυπο των οστεοβλαστών που ανιχνεύεται κατά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ωρίμανση της μήτρας και είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος πρώιμος δείκτης διαφοροποίησης των οστεοβλαστών.

Επομένως, αξιολογώντας τον πολλαπλασιασμό MC3T3-E1 και τη δραστηριότητα ALP, συγκρίθηκε η δράση προαγωγής της οστεογένεσης των εκχυλισμάτων που παρασκευάστηκαν στα Παραδείγματα 1-3.

Τα κύτταρα MC3T3-E1 αναζωογονήθηκαν και διαβιβάστηκαν. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα χωνεύτηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και συλλέχθηκαν. Η κυτταρική πυκνότητα ρυθμίστηκε έτσι ώστε κάθε 100 μL να περιέχει 5×1035 \\ φορές 10^35×103 κύτταρα και σπάρθηκε σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο που περιείχε εκχυλίσματα του Παραδείγματος 1-3 σε συγκεντρώσεις6,25, 12,5, 25 και 50 ug/mL, ή που περιέχει0,1 Μ οιστραδιόλη(θετικός έλεγχος), ή μόνο μέσο (τυφλός έλεγχος) και καλλιεργήθηκε για48 h. Κάτω από συνθήκες προστασίας από το φως, προστέθηκε μητρικό διάλυμα ΜΤΤ (10%–20% του όγκου του φρεατίου), επωάστηκε για4 hσε επωαστήρα CO2, το μέσο αφαιρέθηκε και200 μL DMSOπροστίθεται για να διαλυθεί η φορμαζάνη. Οι τιμές OD μετρήθηκαν στο490 nm.

Αποτελέσματα: Εικ. 1 (Παράδειγμα 1), Εικ. 2 (Παράδειγμα 2), Εικ. 3 (Παράδειγμα 3).

[0058] Ρυθμός πολλαπλασιασμού κυττάρων (%)=OD(Παράδειγμα 1–3)−OD(Κενό)OD(κενό)×100%\\frac{OD(\\text{Παράδειγμα 1–3}) - OD(\\text{Κενό})}{OD(\\text{Κενό})(Blank)(Blank)} \\s 1–3)−OD(Κενό)​×100%

[0059] Όπως φαίνεται στο Σχήμα. 1-3, ο θετικός έλεγχος προώθησε τον πολλαπλασιασμό του MC3T3-E1. Το Παράδειγμα 1 προήγαγε τον πολλαπλασιασμό στα 6,25, 12,5 και 25 μg/mL. ο ρυθμός πολλαπλασιασμού στα 12,5 ug/mL ήταν 1,4 φορές αυτός του θετικού μάρτυρα, αλλά χωρίς σημαντική διαφορά (P > 0,05). Το Παράδειγμα 2 προήγαγε τον πολλαπλασιασμό στα 6,25, 12,5, 25 και 50 μg/mL. στα 12,5, 25 και 50 ug/mL τα αποτελέσματά του ήταν ανώτερα από τον θετικό μάρτυρα (P < 0,01 ή P < 0,001), με ρυθμούς πολλαπλασιασμού 2,55×, 3,46× και 2,59× του θετικού ελέγχου. Το Παράδειγμα 3 προήγαγε τον πολλαπλασιασμό στα 6,25, 12,5, 25 και 50 μg/mL. στα 12,5, 25 και 50 ug/mL ήταν ανώτερο από τον θετικό έλεγχο (P < 0,01 ή P < 0,001), με ρυθμούς πολλαπλασιασμού 1,40×, 1,76× και 0,93× του θετικού μάρτυρα. Αυτό δείχνει ότι το Παράδειγμα 2 είχε την καλύτερη επίδραση στην προώθηση του πολλαπλασιασμού MC3T3-E1.

1.2 Δοκιμασία δραστηριότητας ALP

Η δραστικότητα ALP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας ALP. Η αποθεματική συγκέντρωση της ρ-νιτροφαινόλης ήταν 10 mM και οι τυπικές συγκεντρώσεις καμπύλης ήταν 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 και 0,25 mM, που παρασκευάστηκαν με βαθμιδωτή αραίωση με ρυθμιστικό ανίχνευσης.

Για κάθε φρεάτιο δείγματος σε πλάκα 96 φρεατίων, προστέθηκαν 49 μL ρυθμιστικού διαλύματος ανίχνευσης, 1 μL πρωτεΐνης που εκχυλίστηκε από τα επεξεργασμένα κύτταρα MC3T3-E1 (από την ενότητα 1.1) και 50 μL χρωμογόνου υποστρώματος (προστέθηκε τελευταίο). Η αντίδραση συνεχίστηκε για 30 λεπτά στον επωαστήρα προστατευμένο από το φως, τερματίστηκε με την προσθήκη 100 μL διαλύματος τερματισμού και η απορρόφηση μετρήθηκε σε405 nm. Η δραστηριότητα ALP υπολογίστηκε από την τυπική καμπύλη.

Αποτελέσματα: Εικ. 4 (Παράδειγμα 1), Εικ. 5 (Παράδειγμα 2), Εικ. 6 (Παράδειγμα 3).

[0061] Δραστηριότητα ALP (U/L)=(σχετική μοριακή συγκέντρωση πρωτεΐνης) × 1000 × 100 / 30
(1000 για γραμμομοριακή μετατροπή μονάδων, 100 για συνολικό όγκο αντίδρασης, 30 για 30 λεπτά χρόνο αντίδρασης)

Το ALP είναι ένας πρώιμος δείκτης διαφοροποίησης MC3T3-E1. Το Σχήμα . 4–6 δείχνει ότι ο θετικός έλεγχος αύξησε τη δραστηριότητα ALP. Το Παράδειγμα 1 δεν προώθησε τη δραστηριότητα ALP. Το Παράδειγμα 2 αύξησε τη δραστικότητα ALP στα 12,5, 25 και 50 μg/mL. στα 25 και 50 ug/mL οι διαφορές έναντι του τυφλού ήταν σημαντικές (P < 0,01). Το Παράδειγμα 3 αύξησε τη δραστικότητα ALP στα 12,5 και 25 ug/mL (Ρ < 0,001), αλλά με την αύξηση της συγκέντρωσης, η ενίσχυση μειώθηκε. Αυτό δείχνει ότι μόνο τα Παραδείγματα 2 και 3 αύξησαν τη δραστηριότητα ALP και υποστήριξαν τη διαφοροποίηση.

Συνολικά, μόνο το Παράδειγμα 2 έδειξε θετική ως προς τη δόση συσχέτιση τόσο στον πολλαπλασιασμό MC3T3-E1 όσο και στη δραστηριότητα ALP στα 12,5 και 25 ug/mL. Το Παράδειγμα 3 έδειξε θετική δόση συσχέτισης για πολλαπλασιασμό αλλά αρνητική δόση συσχέτιση για ALP. Συγκριτικά, το Παράδειγμα 2 είναι πιο κατάλληλο για τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας.

1.3 Μεταλλοποίηση (Κόκκινη Χρώση Αλιζαρίνης) του Παραδείγματος 2

Επειδή το Παράδειγμα 2 έδειξε την καλύτερη συσχέτιση δραστικότητας και δόσης σε σύγκριση με τα Παραδείγματα 1 και 3, διεξήχθησαν πειράματα ανοργανοποίησης για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδρασή του.

[0064] Τα κύτταρα MC3T3-E1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μετά από 72 ώρες καλλιέργειας με εκχύλισμα του Παραδείγματος 2 σε12,5, 25 και 50 ug/mL, επωάστηκε στους 37 βαθμούς για14 days(με βάση το σχηματισμό όζων ασβεστίου), με ενδιάμεσες αλλαγές κάθε 2 ημέρες. Πραγματοποιήθηκε χρώση Alizarin Red: το μέσο αφαιρέθηκε, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 10% ουδέτερη φορμαλίνη (300 μL/φρεάτιο) για 30 λεπτά, ξεπλύθηκαν, χρωματίστηκαν με 0,1% Alizarin Red (300 μL/φρεάτιο) για 30 λεπτά (θερμοκρασία δωματίου, προστατευμένο από το φως) και πλύθηκαν μέχρι να μην παραμείνει κόκκινο χρώμα. Τραβήχτηκαν εικόνες. Στη συνέχεια προστέθηκε διάλυμα χλωριούχου κετυλοπυριδινίου 10% (400 μL/φρεάτιο) και ανακινήθηκε για 1 ώρα για να διαλυθούν ασβεστοποιημένα οζίδια. Το διαλυμένο διάλυμα μεταφέρθηκε σε πλάκα 96 φρεατίων (100 μL/φρεάτιο) και η OD μετρήθηκε σε562 nmγια τον υπολογισμό του ποσοστού ανοργανοποίησης. Φωτογραφίες: Εικ. 7; ποσοτικά αποτελέσματα: Εικ. 8.

[0065] Ποσοστό εξόρυξης (%)=OD(Παράδειγμα 2)−OD(Κενό)OD(Κενό)×100%\\frac{OD(\\text{Παράδειγμα 2}) - OD(\\text{Κενό})}{OD(\\text{Κενό})} \\times 100\\OD(Blank)%OD(Blank) 2)−OD(Κενό)​×100%

[0066] Το Σχήμα. 7 δείχνει ότι ο αριθμός των όζων ασβεστίου αυξήθηκε διαδοχικά με τη συγκέντρωση έναντι του τυφλού. Το Σχήμα . 8 υποδεικνύει ότι το Παράδειγμα 2 προήγαγε την ανοργανοποίηση με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση στα 12,5, 25 και 50 ug/mL, με την ισχυρότερη επίδραση στα 50 ug/mL, σημαντικά καλύτερα από τον θετικό έλεγχο (Ρ < 0,001). Επειδή οι μεταλλοποιημένοι όζοι αντιπροσωπεύουν το τελικό στάδιο της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν περαιτέρω το αποτέλεσμα υποστήριξης της οστικής πυκνότητας του Παραδείγματος 2 και καταδεικνύουν τη σταθερή του δράση. Το Παράδειγμα 2 ήταν ανώτερο από την οιστραδιόλη, υποδεικνύοντας πιθανή αξία για προϊόντα υγείας των οστών.

Γονιδιακή έκφραση και μηχανισμός μονοπατιού (Παράδειγμα 2)

Το εκχύλισμα του παραδείγματος 2 (12,5, 25, 50 ug/mL) εφαρμόστηκε σε κύτταρα MC3T3-E1 για 3 ημέρες. Εκχύλιση RNA, ποσοτικοποίηση, αντίστροφη μεταγραφή (σύστημα 20 μL, είσοδος RNA 800 ng) και qRT-PCR διεξήχθησαν για να ποσοτικοποιηθούν τα σχετικά επίπεδα έκφρασηςRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA και Ocn mRNA. Αποτελέσματα: Εικ. 9–12.

[0068] Το Runx2 και το Osx είναι βασικοί μεταγενέστεροι ρυθμιστές στη σηματοδότηση BMP, προκαλώντας διαφοροποίηση οστεοβλαστών. Το Runx2 είναι σημαντικό στο πρώιμο στάδιο δέσμευσης, ενώ το Osx λειτουργεί στην τερματική διαφοροποίηση. Το OPN και το OCN είναι σημαντικοί δείκτες για τη δραστηριότητα των οστεοβλαστών και την ανοργανοποίηση των ιστών. Το Σχ.. 9-12 δείχνει ότι το Παράδειγμα 2 αύξησε τη σχετική έκφραση αυτών των δεικτών, υποστηρίζοντας ενισχυμένη διαφοροποίηση οστεοβλαστών και σχηματισμό οστού.

[0069] Το Παράδειγμα 2 ρυθμίστηκε προς τα πάνωBmp2 mRNA(Εικ. 13), υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση τουΔιαδρομή BMP/Smad, που υποστηρίζει τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και το σχηματισμό νέου οστού.

[0071] Παράδειγμα 2 αύξησε τη σχετική έκφραση τουLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA και Wnt3 mRNA(Εικ. 14–16), που υποστηρίζει την ενεργοποίηση τουWnt/ -catenin σηματοδότηση, η οποία σχετίζεται στενά με τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών, τη διαφοροποίηση και τον σχηματισμό οστού.

Έκφραση πρωτεΐνης (Παράδειγμα 2)

Η ανάλυση Western blot έδειξε ότι το Παράδειγμα 2 αυξήθηκεOsxκαιRUNX2έκφραση πρωτεΐνης (Εικ. 17-18), που υποδεικνύει ρύθμιση τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μεταφραστικό επίπεδο για την προώθηση της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών.

Αυτές οι δοκιμές δραστηριότητας δείχνουν ότι το Παράδειγμα 2 παρείχε το καλύτερο αποτέλεσμα προαγωγής του πολλαπλασιασμού και ήταν το μόνο με σταθερή συσχέτιση δόσης τόσο για τον πολλαπλασιασμό όσο και για την ALP. Το Παράδειγμα 2 ήταν επίσης ανώτερο από την οιστραδιόλη στην προαγωγή του πολλαπλασιασμού και της ανοργανοποίησης του MC3T3-E1, με συγκρίσιμα αποτελέσματα διαφοροποίησης, υποδηλώνοντας βέλτιστη δυνατότητα υποστήριξης της οστικής πυκνότητας.

 

Δοκιμή Χημικής Σύνθεσης

6.1 Περιεκτικότητα σε φαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδια

[0076] Με αναφορά στη μέθοδο προσδιορισμού "Cistanche" στην Κινεζική Φαρμακοποιία, μετρήθηκαν τα περιεχόμενα εχινακοσίδης και ακτεοσίδης στα Παραδείγματα 1-3 (τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1). Με βάση την εχινακοσίδη, την ακτεοσίδη και τα συνολικά PhGs, η τάση ήταν συνεπής: Παράδειγμα 3 > Παράδειγμα 1 > Παράδειγμα 2, και η ακτεοσίδη στο Παράδειγμα 3 ήταν 3,85× και 4,27× εκείνη των Παραδειγμάτων 1 και 2, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων δραστικότητας και περιεχομένου δείχνει ότι η εχινακοσίδη και η ακτεοσίδη από μόνες τους δεν καθορίζουν άμεσα τις οστεογονικές επιδράσεις.

 

Πίνακας 1. Περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη σε εκχυλίσματα κιστανσέ (%)

Δείγμα (Παράδειγμα)	Εχινακοσίδη (%)	Ακτεοσίδη / Βερμπασκοσίδη (%)	Σύνολο (%)
Παράδειγμα 1	28.68	1.63	30.31
Παράδειγμα 2	26.27	1.47	27.74
Παράδειγμα 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Άλλα εξαρτήματα (UPLC/Q-TOF/MS)

[0078] Το UPLC/Q-TOF/MS χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση χημικών συστατικών μεταξύ των Παραδειγμάτων 1-3. Οι τιμές απόκρισης φαίνονται στον Πίνακα 2.

Εκτός από την εχινακοσίδη και την ακτεοσίδη, το Παράδειγμα 2 περιείχε επιπλέονΣικιμικό οξύ και συστατικά τύπου φαινυλοπροπιονικού οξέος, και επίσηςαλκαλοειδή. Σε σύγκριση με τα Παραδείγματα 1 και 3, το Παράδειγμα 2 είχε 11 συστατικά που σχετίζονται με φαινυλοπροπιονικό/σικιμικό οξύ με τις υψηλότερες αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένων:

Πίνακας 2. Τιμές απόκρισης UPLC/Q-TOF/MS βασικών στοιχείων σε εκχυλίσματα Cistanche (Παραδείγματα 1–3)

注:原表为"响应值(τιμή απόκρισης)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2.Σικιμικό οξύ & παράγωγα φαινυλοπροπιονικού οξέος(莽草酸及苯丙酸类)与 Αλκαλοειδή(生物碱).

Α. Σικιμικό οξύ & παράγωγα φαινυλοπροπιονικού οξέος

Χημική ένωση	Παράδειγμα 1	Παράδειγμα 2	Παράδειγμα 3
Ισοδανφαινολικό οξύ Β (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-Υδροξυφαινυλοπροπιονικό οξύ (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Σικιμικό οξύ (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-καρβοξυ-2-(3,4-διυδροξυφαινυλ)αιθοξυ]καρβονυλ-2-(3,4-διυδροξυφα) νυλ)-7-υδροξυ-2,3-διυδροβενζοφουραν-4-υλ]προπ-2-ενοϋλ]οξυ-3-(3,4-διυδροξυφαινυλ)προπανοϊκό οξύ	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Βενζοϋλακετόνη (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Επιπινορεσινόλη 4'-O- -D-γλυκοσίδη (表丁香树脂酚 4'-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Γλυκοζίτη Yangmei Changshan* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-Διμεθυλοβενζοϊκό οξύ (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-τριυδροξυ-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-τριυδροξυτετραϋδροπυραν-2-υλ]οξυμεθυλ]τετραϋδροπυραν-2-υλ]οξυχρωμεν-2-όνη	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

Β. Αλκαλοειδή

Χημική ένωση	Παράδειγμα 1	Παράδειγμα 2	Παράδειγμα 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Διυδροκοπτισίνη (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Θυμίνη (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Ζελσεμίνη (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

ισοδανφαινολικό οξύ Β,

π-υδροξυφαινυλοπροπιονικό οξύ,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-καρβοξυ-2-(3,4-διυδροξυφαινυλ)αιθοξυ]καρβονυλ-2-(3,4-διυδροξυφα) νυλ)-7-υδροξυ-2,3-διυδροβενζοφουραν-4-υλ]προπ-2-ενοϋλ]οξυ-3-(3,4-διυδροξυφαινυλ)προπανοϊκό οξύ,

βενζοϋλακετόνη,

επιπινορεσινόλη 4'-O- -D-γλυκοσίδη,

γλυκοσίδη που σχετίζεται με τη μυρικετίνη (όπως αναφέρεται),

jionoside A1,

3,4-διμεθυλοβενζοϊκό οξύ,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-τριυδροξυ-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-τριυδροξυτετραϋδροπυραν-2-υλ]οξυμεθυλ]τετραϋδροπυραν-2-υλ]οξυχρωμεν-2-όνη.

Περιείχε επίσης 5 αλκαλοειδή, μεταξύ των οποίων:

verticine,

διυδροκοπτισίνη (όπως αναφέρεται),

θυμίνη,

αλκαλοειδές που σχετίζεται με τη ζελσεμίνη (όπως αναφέρεται),

γιοχιμβίνη.

[0080] Με βάση συγκριτικά αποτελέσματα πολλαπλασιασμού/δραστικότητας ALP, δοκιμών γλυκοζίτη φαινυλαιθανοειδών και χημικό προφίλ, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (εχινακοσίδη και ακτεοσίδη), τα σικιμικά/φαινυλοπροπιονικά οξέα, τα αλκαλοειδή και τα τερπενοειδή συνιστούν ειδικά τη σύνθεση του εκχυλίσματος τερπενοειδή εξάρτηση από τη δόση (12,5–25 ug/mL) κατά τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την ανοργανοποίηση, επιτρέποντας σταθερά αποτελέσματα υποστήριξης της οστικής πυκνότητας.

[0081] Πίνακας 2: τιμές απόκρισης εξαρτημάτων.
[0082] Η εφεύρεση, μέσω της διαδικασίας του Παραδείγματος 2, παρέχει ένα εκχύλισμα Cistanche με ολικό εχινακοσίδη + ακτεοσίδη > 25% και εμπλουτισμένα σικιμικά/φαινυλοπροπιονικά οξέα και αλκαλοειδή, επιτρέποντας σταθερά αποτελέσματα υποστήριξης της οστικής πυκνότητας. Εντός 12,5–25 ug/mL, προάγει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την ανοργανοποίηση του MC3T3-E1 με τρόπο που ενισχύει τη δόση με σταθερό συσχετισμό δόσης, υποστηρίζοντας καλύτερα και πιο σταθερά αποτελέσματα για την υγεία των οστών και επιτρέποντας τη χρήση σε προϊόντα που σχετίζονται με τη βελτίωση της οστικής πυκνότητας.