Το εκχύλισμα Cistanche Deserticola αυξάνει τον σχηματισμό οστών στους οστεοβλάστες
Mar 05, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Τε-Μάο Λιa, Hsin-Chih Huangb, Τσεν-Μινγκ Σουc, Tin-Yun Hoa, Τσι-Μινγκ Γουa, Wen-Chi Chend, Γι-Τσιν Φονγκa,eκαι Chih-Hsin Tangf,c
Αφηρημένη
Στόχοι:Ερευνήσαμε την επίδραση τουCistanche deserticola Ma. (CD) στον σχηματισμό οστού από καλλιεργημένους οστεοβλάστες.ΜέθοδοιΗ ανοργανοποιημένη δοκιμασία σχηματισμού όζων χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστούν οι in-vitro επιδράσεις του CD στον σχηματισμό οστού. Η αλκαλική φωσφατάση (ALP), οι μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMP)-2 και η έκφραση mRNA της οστεοποντίνης (OPN) αναλύθηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο. Ο μηχανισμός δράσης του εκχυλίσματος CD διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας Western blotting. Η in-vivo αντι-οστεοπορωτική δράση του εκχυλίσματος CD αξιολογήθηκε σε ποντίκια με ωοθηκεκτομή.Σημαντικά ευρήματαΤο εκχύλισμα CD δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή την επούλωση τραυμάτων καλλιεργημένων οστεοβλαστών, αλλά αύξησε το ALP, το BMP-2 και το OPN mRNA και την ανοργανοποίηση των οστών. Η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (MAPK) ή οι αναστολείς του πυρηνικού παράγοντα (NF)-kB μείωσαν τον επαγόμενο από το εκχύλισμα CD σχηματισμό οστών και την έκφραση ALP, BMP-2 και OPN. Ωστόσο, το εκχύλισμα CD δεν επηρέασε την οστεοκλαστογένεση. Επιπλέον, το εκχύλισμα CD απέτρεψε την οστική απώλεια που προκλήθηκε από την ωοθηκεκτομή in vivo.συμπεράσματαΤο CD μπορεί να είναι ένας νέος παράγοντας σχηματισμού οστών για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης.
Εισαγωγή
Το οστό είναι ένας πολύπλοκος ιστός που αποτελείται από διάφορους τύπους κυττάρων που υφίστανται μια συνεχή διαδικασία ανανέωσης και επιδιόρθωσης που ονομάζεται «αναδιαμόρφωση των οστών». Δύο κύριοι τύποι κυττάρων που είναι υπεύθυνοι για την αναδιαμόρφωση των οστών είναι οι οστεοκλάστες, οι οποίοι απορροφούν τα οστά και οι οστεοβλάστες, οι οποίοι σχηματίζουν νέο οστό. Η αναδόμηση των οστών ρυθμίζεται από διάφορες συστηματικές ορμόνες (π.χ. παραθυρεοειδική ορμόνη, 1, 25-υδροξυβιταμίνη D3, ορμόνες φύλου και καλσιτονίνη) και τοπικούς παράγοντες (π.χ. μονοξείδιο του αζώτου, προσταγλανδίνες, αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες).[1]
Η οστεοπόρωση προκύπτει όταν η απορρόφηση και ο σχηματισμός των οστών είναι ασυντόνιστα και η υπερβολική διάσπαση των οστών υπερβαίνει την οικοδόμηση των οστών.[2] Οι τρέχουσες θεραπείες για την οστεοπόρωση περιλαμβάνουν διφωσφονικά, καλσιτονίνη και οιστρογόνα, τα οποία είναι αναστολείς της οστικής απορρόφησης που διατηρούν την οστική μάζα αναστέλλοντας τη δραστηριότητα των οστεοκλαστών.[3] Ωστόσο, η επίδραση αυτών των φαρμάκων στην αύξηση ή την ανάκτηση της οστικής μάζας είναι σχετικά μικρή, σίγουρα όχι περισσότερο από 2 τοις εκατό ετησίως.[3] Υπάρχει, επομένως, ανάγκη για παράγοντες οικοδόμησης οστών, όπως η τεριπαρατίδη, που διεγείρουν το σχηματισμό νέου οστού και διορθώνουν την αλλαγή στη μικροαρχιτεκτονική της δοκιδωτής που είναι χαρακτηριστική της εγκατεστημένης οστεοπόρωσης. ο οστεοβλάστης, παράγοντες που δρουν είτε αυξάνοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της οστεοβλαστικής γενεαλογίας είτε επάγοντας διαφοροποίηση των οστεοβλαστών μπορούν να ενισχύσουν τον σχηματισμό οστού.[5,6]
Αν και οι μηχανισμοί της οστεοπόρωσης παραμένουν ασαφείς, πιθανότατα σχετίζονται με τη μειωμένη διαθεσιμότητα ή τις επιδράσεις των παραγόντων ανάπτυξης των οστών, όπως οι μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMPs). Τα BMPs, τα οποία σχετίζονται δομικά με την υπεροικογένεια του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-b, αναγνωρίστηκαν αρχικά από την ικανότητά τους να προκαλούν έκτοπο σχηματισμό οστού σε τρωκτικά.[8] Οι BMPs παίζουν σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό οστών και στη διαφοροποίηση των οστικών κυττάρων διεγείροντας τη δραστηριότητα της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) καθώς και τη σύνθεση πρωτεογλυκάνης, κολλαγόνου και οστεοποντίνης (OPN). Μια πρόσφατη μελέτη βρήκε μια σύνδεση μεταξύ της οστεοπόρωσης και συγκεκριμένων πολυμορφισμών στα γονίδια BMP-2, ALP και OPN, υποδηλώνοντας ότι σχετίζονται με την ανάπτυξη οστεοπόρωσης.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae, συντομογραφία ως CD) είναι ένα αυτοφυές βότανο στην Κίνα και χρησιμοποιείται ευρέως στην παραδοσιακή ιατρική ως θεραπευτικός παράγοντας λόγω των ηρεμιστικών, αναλγητικών και ανοσοδιεγερτικών ιδιοτήτων του.[11] Σύγχρονες φαρμακολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα εκχυλίσματα CD μπορούν να διεγείρουν την ανοσία,[12] να καθαρίσουν τις ελεύθερες ρίζες[13] και να αυξήσουν τη δραστηριότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης[14]. Οι αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να θεραπεύουν την οστεοπόρωση αυξάνοντας τον σχηματισμό οστού και/ή καταστέλλοντας την οστική απορρόφηση. Εδώ, αναφέρουμε ότι το εκχύλισμα CD δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή τη δραστηριότητα επούλωσης τραυμάτων των καλλιεργημένων οστεοβλαστών, αλλά αύξησε την έκφραση ALP, BMP-2 και OPN και την ανοργανοποίηση των οστών. Επιπλέον, δείχνουμε ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από μιτογόνο (MAPK) και πυρηνικού παράγοντα (NF)-kB μπορεί να εμπλέκονται στην αύξηση της γονιδιακής έκφρασης και της ανοργανοποίησης των οστών με τη μεσολάβηση CD. Αντίθετα, το εκχύλισμα CD δεν κατέστειλε την οστεοκλαστογένεση in vitro. Συγκεκριμένα, η θεραπεία ποντικών με εκχύλισμα CD απέτρεψε την οστική απώλεια που προκλήθηκε από την ωοθηκεκτομή in vivo. Τα δεδομένα μας, επομένως, υποδηλώνουν ότι το CD μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την τόνωση του σχηματισμού οστών για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης.
Cistanche deserticola
Υλικά και μέθοδοι
Εκχύλισμα και υλικά Cistanche deserticola
Το εκχύλισμα CD αγοράστηκε από την Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Ταϊβάν). Η εκχύλιση και η απομόνωση του CD ακολούθησε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (με βάση φασματικά δεδομένα έχουν ταυτοποιήσει τη χημική σύνθεση συμπεριλαμβανομένης της βήτα-σιτοστερόλης, της δαυκοστερόλης, του ηλεκτρικού οξέος, της τριακοντανόλης, της ακτεοσίδης, της βεταΐνης και του πολυσακχαρίτη).[17] Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού ειδικά για κινάσες ρ-εξωκυτταρικού σήματος (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-τερματικές κινάσες (JNK), JNK, p-p65 και p65 αγοράστηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology ( Σάντα Κρουζ, ΗΠΑ). Το κιτ ELISA οστεοκαλσίνης αγοράστηκε από την Biosource Technology (Nivelles, Βέλγιο). Τα Ο-τελικά τελοπεπτίδια του κιτ ELISA κολλαγόνου τύπου Ι ελήφθησαν από Cross Laps (Herlev, Δανία). Το ρ38 κυρίαρχο-αρνητικό μετάλλαγμα παρασχέθηκε από τον Δρ. J. Han (South-Western Medical Center, Ντάλλας, ΗΠΑ). Το JNK κυρίαρχο-αρνητικό μεταλλαγμένο παρασχέθηκε από τον Dr. M. Karin (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ). Το ERK2 κυρίαρχο-αρνητικό μετάλλαγμα παρασχέθηκε από τον Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St Louis, ΗΠΑ).
Κυτταρικής καλλιέργειας
Η κυτταρική σειρά οστεοβλαστών ποντικού MC3T3-E1 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, ΗΠΑ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 95 τοις εκατό αέρα, 5 τοις εκατό CO2 με a-MEM που συμπληρώθηκε με 20 mm HEPES και 10 τοις εκατό εμβρυϊκό ορό μόσχου απενεργοποιημένο με θερμότητα, 2 mm-γλουταμίνη, πενικιλίνη (100 U/ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /ml).
Μέτρηση σχηματισμού μεταλλοποιημένου οζιδίου
Ο σχηματισμός μεταλλοποιημένου οζιδίου αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται.[18] Εν συντομία, οι οστεοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο που περιείχε βιταμίνη C (50 mg/ml) και β-γλυκεροφωσφορικό (10 mm) για δύο εβδομάδες και το μέσο άλλαζε κάθε τρεις ημέρες. Μετά από επώαση με εκχύλισμα CD για 12 ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 20 mm ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιείχε
0.15 m NaCl (pH 7,4), σταθεροποιήθηκε σε παγωμένη 75 τοις εκατό (v/v) αιθανόλης για 30 λεπτά και ξηράνθηκε στον αέρα. Η εναπόθεση ασβεστίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας χρώση αλιζαρίνης red-S. Εν συντομία, τα σταθεροποιημένα με αιθανόλη κύτταρα και η μήτρα χρωματίστηκαν για 1 ώρα με 40 mm alizarin red-S (ρΗ 4,2) και ξεπλύθηκαν εκτενώς με νερό. Η δεσμευμένη χρώση εκλούστηκε με 10 τοις εκατό (β/ο) χλωριούχο κετυλοπυριδίνιο και η αλιζαρίνη red-S στα δείγματα ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 550 nm και συγκρίθηκε με μια τυπική καμπύλη. Ένα mole alizarin red-S δεσμεύει επιλεκτικά περίπου δύο mole ασβεστίου.
Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο
Ολικό RNA εκχυλίστηκε από οστεοβλάστες χρησιμοποιώντας κιτ TRIZol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 2 mg ολικού RNA και έναν εκκινητή ολιγο(dT).[19,20] Πραγματοποιήθηκε ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR) χρησιμοποιώντας TaqMan® ενός σταδίου PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, ΗΠΑ). Προστέθηκε ολικό cDNA (100 ng ανά 25-ml αντίδρασης) με ειδικούς για την αλληλουχία εκκινητές και Taqman® ανιχνευτές. Όλοι οι εκκινητές και οι ανιχνευτές γονιδίου στόχου αγοράστηκαν εμπορικά, συμπεριλαμβανομένης της β-ακτίνης ως εσωτερικού ελέγχου (Applied Biosystems). Οι δοκιμές qPCR πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας Ste-pOnePlus (Applied Biosystems). Οι συνθήκες ανακύκλωσης ήταν 10-ελάχιστη ενεργοποίηση πολυμεράσης στους 95 μοίρες ακολουθούμενες από 40 κύκλους 95 μοιρών για 15 δευτερόλεπτα και 60 μοιρών για 60 δευτερόλεπτα. Το κατώφλι ορίστηκε πάνω από το υπόβαθρο ελέγχου εκτός προτύπου και εντός της γραμμικής φάσης της ενίσχυσης του γονιδίου στόχου για να υπολογιστεί ο αριθμός κύκλου στον οποίο ανιχνεύθηκε το αντίγραφο (σημειώνεται CT).
Ανάλυση Western blot
Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως.[21,22] Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλίου Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Τα στυπώματα αποκλείστηκαν με 4 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα κουνελιού κατά του ρ-65 ή ρ-ρ65 (1: 1000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις, τα στυπώματα επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερεύον αντίσωμα γαϊδουριού κατά κουνελιού (1: 1000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας φιλμ X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, ΗΠΑ).
Οστεοπόρωση που προκαλείται από ωοθηκεκτομή
Θηλυκά ποντίκια ICR, ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων, 22~28 g, χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αμφίπλευρη εκτομή ωοθηκών υπό αναισθησία με τριχλωροακεταλδεΰδη (100 mg/kg) και τα ποντίκια ελέγχου υποβλήθηκαν σε εικονική επέμβαση (Sham) για σύγκριση. Η οστική πυκνότητα και η περιεκτικότητα σε μεταλλικά οστά μετρήθηκαν μετά από από του στόματος χορήγηση διαφόρων συγκεντρώσεων εκχυλισμάτων CD κάθε δύο ημέρες για τέσσερις εβδομάδες. Η συνολική οστική πυκνότητα του σώματος και η περιεκτικότητα σε ανόργανα άλατα προσδιορίστηκαν με ένα απορροφητικό μετρητή ακτίνων Χ διπλής ενέργειας (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας μια λειτουργία για μικρά άτομα όπως περιγράφηκε προηγουμένως.[18, 23] Όλα τα πρωτόκολλα συμμορφώθηκαν με τις κατευθυντήριες οδηγίες του ιδρύματος και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Κίνας.
Στατιστική ανάλυση
Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Prism 4.01λογισμικό. (GraphPad Software Inc., Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ). Οι τιμές που δίνονται είναι οι μέσες τιμές ± SEM. Η στατιστική ανάλυση μεταξύ δύο δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student's t-test. Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές συγκρίσεις περισσότερων από δύο ομάδων χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης με το posthoc test Bonfer-Roni. Σε όλες τις περιπτώσεις, P < 0,05="" θεωρήθηκε="">
Εκχύλισμα Cistanche deserticola
Αποτελέσματα
Το εκχύλισμα Cistanche deserticola αυξάνει την ανοργανοποίηση των οστών από τους οστεοβλάστες
Η προσθήκη του εκχυλίσματος CD για 24 ή 48 ώρες δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων οστεοβλάστης MC3T3-Ε1 ποντικού σε μια δοκιμασία ΜΤΤ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή η διαφοροποίηση των οστεοβλαστών είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση, δοκιμάσαμε επίσης τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων MC3T3-Ε1 μετά από θεραπεία με εκχύλισμα CD. Χρησιμοποιώντας δοκιμές Transwell και επούλωσης τραυμάτων, διαπιστώσαμε ότι το εκχύλισμα CD δεν επηρέασε τη μετανάστευση των οστεοβλαστών (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Ο σχηματισμός μεταλλοποιημένων οζιδίων είναι ένας από τους δείκτες ωρίμανσης οστεοβλαστών. Η χρώση Alizarin red S έδειξε ότι σχηματίστηκαν ανοργανοποιημένα οζίδια όταν οι οστεοβλάστες καλλιεργήθηκαν για δύο εβδομάδες σε ένα μέσο που περιείχε βιταμίνη C (50 mg/ml) και β-γλυκεροφωσφορικό (10 mm), και αυτό αυξήθηκε κατά τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση με την προσθήκη του CD (Εικόνα 1α). Ως εκ τούτου, το εκχύλισμα CD προκάλεσε σχηματισμό οζιδίων οστού από καλλιεργημένους οστεοβλάστες, αλλά όχι τον πολλαπλασιασμό ή τη μετανάστευση τους. Εξετάσαμε επίσης τον ρόλο του εκχυλίσματος CD στην επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστογένεση αλλά δεν βρήκαμε καμία επίδραση (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).
Το εκχύλισμα Cistanche deserticola αυξάνει την αλκαλική φωσφατάση, τη μορφογενετική πρωτεΐνη των οστών-2 και την έκφραση οστεοποντίνης σε καλλιεργημένους οστεοβλάστες
Οι διαφοροποιημένοι οστεοβλάστες εμφανίζουν αυξημένη δραστηριότητα ALP, η οποία συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα ενζυμικής έκφρασης.[18] Βρήκαμε ότι η θεραπεία με εκχύλισμα CD για 72 ώρες αύξησε σημαντικά τη δραστηριότητα ALP των οστεοβλαστών (Εικόνα 1β). Δεδομένου του κρίσιμου ρόλου των BMP-2, ALP και OPN στη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών, δοκιμάσαμε εάν το εκχύλισμα CD ασκεί την επίδρασή του στη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών ρυθμίζοντας την έκφραση BMP-2, ALP και OPN. Η επεξεργασία των κυττάρων με εκχύλισμα CD αύξησε την έκφραση mRNA των ALP, BMP-2 και OPN με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Εικόνα 1c), δείχνοντας ότι το εκχύλισμα CD προκάλεσε διαφοροποίηση των οστεοβλαστών ρυθμίζοντας προς τα πάνω τα ALP, BMP-2 , και έκφραση OPN.
Το εκχύλισμα Cistanche deserticola αυξάνει τον σχηματισμό οζιδίων των οστών μέσω της οδού πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από μιτογόνο
Έχει αναφερθεί ότι η MAPK παίζει σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό οστού[24,25], επομένως εξετάσαμε στη συνέχεια εάν αυτή η οδός σηματοδότησης εμπλέκεται στην επαγόμενη από το εκχύλισμα CD ανοργανοποίηση των οστών. Η προεπεξεργασία των κυττάρων με αναστολέα ERK U0126, αναστολέα p38 SB203580 ή αναστολέα JNK SP600125 μείωσε την ανοργανοποίηση των οστών με εκχύλισμα CD (Εικόνες 2α, 3α και 4α). Επιπλέον, οι αναστολείς απέκλεισαν επίσης την επαγόμενη από εκχύλισμα CD έκφραση ALP, BMP-2 και OPN (Εικόνες 2b–4c). Η επιμόλυνση κυττάρων με μετάλλαγμα ERK2, p38 ή JNK μείωσε την αύξηση του εκχυλίσματος CD στην έκφραση ALP, BMP-2 και OPN mRNA (Εικόνες 2c, 3c και 4c). Στη συνέχεια, εξετάσαμε απευθείας την ενεργοποίηση ERK, p38 και JNK μετά από θεραπεία με εκχύλισμα CD. Η επώαση κυττάρων με εκχύλισμα CD προκάλεσε φωσφορυλίωση ERK, p38 και JNK (Εικόνες 2d, 3d, και 4d). Επομένως, τα ERK, p38 και JNK μεσολαβούν στον αυξημένο σχηματισμό οστού που προκαλείται από τη θεραπεία CD των οστεοβλαστών.
Το εκχύλισμα Cistanche deserticola αυξάνει τον σχηματισμό οστικών οστών μέσω της οδού πυρηνικού παράγοντα-kB
Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η ενεργοποίηση του NF-kB είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό οστού.[26,27] Στη συνέχεια αντιμετωπίσαμε τους οστεοβλάστες με τους αναστολείς NF-kB διθειοκαρβαμιδική πυρρολιδίνη (PDTC) και χλωρομεθυλκετόνη Ν-τοσυλ-L-φαινυλαλανίνης (TPCK) που αγοράστηκαν από Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία) για να προσδιοριστεί εάν η ενεργοποίηση NF-kB εμπλέκεται στην επαγόμενη από εκχύλισμα CD ανοργανοποίησης των οστών. Το Σχήμα 5α δείχνει ότι η προεπεξεργασία των οστεοβλαστών με PDTC ή TPCK ανέστειλε τον επαγόμενο από εκχύλισμα CD σχηματισμό οζιδίων οστών και επίσης μείωσε την αύξηση στην έκφραση ALP, BMP-2 και OPN (Εικόνα 5b και 5c). Η φωσφορυλίωση της υπομονάδας NF-kB p65 είναι ένας δείκτης της ενεργοποίησης του NF-kB. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση NF-kB είναι σημαντική για την επαγόμενη από εκχύλισμα CD ALP, BMP-2 και έκφραση OPN και σχηματισμό οζιδίων οστού.
Αναστολή της οστικής απώλειας από εκχύλισμα Cistanche deserticola σε ποντίκια με ωοθηκεκτομή
Για να εξεταστεί η επίδραση του εκχυλίσματος CD στην απώλεια οστού, προκλήθηκε οστεοπόρωση σε θηλυκά ποντίκια με ωοθηκεκτομή. Όπως αναμενόταν, τα ποντίκια που είχαν υποβληθεί σε ωοθηκεκτομή εμφάνισαν μειωμένη συνολική οστική πυκνότητα και περιεκτικότητα σε ανόργανα οστά (Εικόνα 6α και 6β). Η θεραπεία με εκχύλισμα CD για τέσσερις εβδομάδες ανέστειλε την απώλεια της οστικής πυκνότητας και της περιεκτικότητας σε ανόργανα άλατα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 6α και 6β). Οι συγκεντρώσεις της ALP στο αίμα μπορεί να αντανακλούν την οστεοβλαστική δραστηριότητα.[29] Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6γ, το εκχύλισμα CD ανέστειλε τη μείωση της δραστικότητας ALP ορού που προκαλείται από την ωοθηκεκτομή. Επιπλέον, το εκχύλισμα CD αύξησε επίσης το επίπεδο της οστεοκαλσίνης, ενός δείκτη σχηματισμού οστού, και μείωσε το επίπεδο των Ο-τελικών τελοπεπτιδίων του κολλαγόνου τύπου Ι, ενός δείκτη οστικής απορρόφησης (Εικόνα 6d και 6e). Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν έτσι την ισχύ και την αποτελεσματικότητα του εκχυλίσματος CD στην πρόληψη της οστικής απώλειας in vivo.
Συζήτηση
Cistanche deserticolaΤο Ma, ένα εγγενές βότανο στην Κίνα, χρησιμοποιείται ευρέως στην παραδοσιακή ιατρική για διάφορες θεραπευτικές θεραπείες λόγω της ηρεμιστικής, αναλγητικής και ανοσοδιεγερτικής του δράσης. δεν επηρεάζουν τη μετανάστευση ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων τους. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι οι ALP, BMP-2 και OPN είναι πρωτεΐνες-στόχοι της σηματοδότησης που προκαλείται από το εκχύλισμα CD, η οποία απαιτεί ενεργοποίηση των ERK, p38, JNK και NF-kB.
Τα οστά είναι ένας πολύπλοκος ιστός που αποτελείται από διάφορους τύπους κυττάρων που υπόκεινται συνεχώς σε διαδικασία ανανέωσης και επιδιόρθωσης.[30] Όταν η απορρόφηση και ο σχηματισμός των οστών είναι ανισορροπημένη, η διάσπαση των οστών υπερισχύει του σχηματισμού οστών και προκύπτει οστεοπόρωση.[30] Χρησιμοποιήσαμε ποντίκια με ωοθηκεκτομή για να εξετάσουμε την αντι-οστεοπορωτική δράση του εκχυλίσματος CD. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε εκτομή ωοθηκών είχαν μειωμένη ολική οστική πυκνότητα και περιεκτικότητα σε μεταλλικά οστά, η οποία ανακουφίστηκε από τη θεραπεία με εκχύλισμα CD. Το εκχύλισμα CD αύξησε επίσης τα επίπεδα του οστεογονικού δείκτη ALP και της οστεοκαλσίνης στον ορό. Επομένως, το CD είναι ένας παράγοντας σχηματισμού οστού που αποτρέπει την οστική απώλεια που προκαλείται από την ωοθηκεκτομή in vivo.
Αν και οι μηχανισμοί της οστεοπόρωσης δεν είναι απολύτως σαφείς, πιθανότατα σχετίζονται με τη μειωμένη διαθεσιμότητα ή μειωμένες επιδράσεις παραγόντων ανάπτυξης των οστών, όπως ALP, BMP-2 και OPN. Αυτοί οι τρεις παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία σχηματισμού και αναδιαμόρφωσης των οστών,[31] και έχει τεκμηριωθεί καλά ότι η διέγερση της διαφοροποίησης των οστεοβλαστικών κυττάρων χαρακτηρίζεται κυρίως από αυξημένη έκφραση ALP, BMP-2 και OPN. ] Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το εκχύλισμα CD αύξησε την έκφραση ALP, BMP-2 και OPN και ενίσχυσε την ανοργανοποίηση των οστών. Επομένως, το εκχύλισμα CD μεσολαβεί στον σχηματισμό οστού εν μέρει ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση των ALP, BMP-2 και OPN.
Έχει αναφερθεί ότι η ρ38 εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης της ALP κατά τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστικών κυττάρων·[33] ομοίως, το ERK1/2 είναι σημαντικό για τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. .[36] Δείξαμε εδώ ότι το εκχύλισμα CD προκάλεσε φωσφορυλίωση ERK, p38 και JNK και οι αναστολείς αυτών των ενζύμων ανταγωνίστηκαν τη μεσολαβούμενη από το εκχύλισμα CD ενίσχυση της ανοργανοποίησης των οστών, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση των ERK, p38 και JNK παίζουν υποχρεωτικό ρόλο στον σχηματισμό οστού που προκαλείται από το εκχύλισμα CD. οστεοβλάστες. Επιπλέον, οι αναστολείς ενζύμου και τα κυρίαρχα-αρνητικά μεταλλάγματα των ERK, p38 και JNK μείωσαν την έκφραση ALP, BMP-2 και OPN ενισχυμένης με εκχύλισμα CD. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι απαιτείται ενεργοποίηση των οδών ERK, p38 και JNK για την αύξηση της έκφρασης και ωρίμανσης της ALP, της BMP-2 και της OPN που προκαλείται από το εκχύλισμα CD στους οστεοβλάστες. Το ERK έχει αναφερθεί ότι αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών.[34,35] Ωστόσο, δεν εντοπίσαμε επίδραση του εκχυλίσματος CD στον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών. Επομένως, άλλες οδοί μπορεί να έχουν εξουδετερώσει το φαινόμενο ERK μετά τη διέγερση του εκχυλίσματος CD ή να είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασμό. Από την άποψη αυτή, βρήκαμε ότι οι αναστολείς PI3K και Akt μειώνουν επίσης την επαγόμενη από εκχύλισμα CD ανοργανοποίηση των οστών και την έκφραση ALP, BMP-2 ή OPN mRNA (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Επομένως, αυτές οι οδοί μπορεί να απαιτούνται για το σχηματισμό οστού που προκαλείται από το εκχύλισμα CD.
Το NF-kB έχει αποδειχθεί ότι ελέγχει τη λειτουργία των οστεοβλαστών στα οστά. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι η ενεργοποίηση NF-kB συμβάλλει στην επαγόμενη από το εκχύλισμα CD ανοργανοποίηση των οστών και στην έκφραση ALP, BMP-2 και OPN σε καλλιεργημένους οστεοβλάστες και ότι οι αναστολείς της οδού σηματοδότησης που εξαρτάται από το NF-kB (PDTC και TPCK ) ανέστειλε την επαγόμενη από εκχύλισμα CD ανοργανοποίηση των οστών και την έκφραση ALP, BMP-2 και OPN. Η ρ65 φωσφορυλιώνεται στο Ser536 από μια ποικιλία κινασών σε διάφορα μονοπάτια σηματοδότησης, γεγονός που ενισχύει το δυναμικό μετενεργοποίησης της ρ65. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι το εκχύλισμα CD αύξησε τη φωσφορυλίωση του p65. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι απαιτείται ενεργοποίηση NF-kB για σχηματισμό οστού που προκαλείται από εκχύλισμα CD σε καλλιεργημένους οστεοβλάστες. Βρήκαμε επίσης ότι οι αναστολείς ERK, p38 και JNK ανέστρεψαν την επαγόμενη από εκχύλισμα CD δραστηριότητα λουσιφεράσης NF-kB (δεδομένα δεν φαίνονται), σύμφωνα με αυτά τα ένζυμα που είναι προγενέστεροι μεσολαβητές της επαγόμενης από το εκχύλισμα CD ενεργοποίησης NF-kB. Επομένως, το εκχύλισμα CD προκαλεί σχηματισμό οστού μέσω των οδών ERK/p38/JNK/ και NF-kB.
συμπεράσματα
Αυτή η μελέτη έδειξε ότι το εκχύλισμα CD επάγει τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των οστεοβλαστών αλλά όχι τον πολλαπλασιασμό ή τη μετανάστευση. Το εκχύλισμα CD αύξησε επίσης την έκφραση ALP, BMP-2 και OPN και την ανοργανοποίηση των οστών. Δείξαμε ότι τα μονοπάτια ERK, p38, JNK και NF-kB εμπλέκονται στον σχηματισμό οστού που προκαλείται από CD και στην έκφραση ALP, BMP-2 και OPN. Επιπλέον, το εκχύλισμα CD απέτρεψε την in vivo οστική απώλεια που προκλήθηκε από την ωοθηκεκτομή. Επομένως, το CD μπορεί να είναι ευεργετικό για την τόνωση του σχηματισμού οστών στη θεραπεία οστεοπορωτικών ασθενειών.
