Κυκλοφορούν MiRNA σε διαβητικούς ασθενείς τύπου 2 με και χωρίς λευκωματουρία στη Μαλαισία

ΑφηρημένηΕισαγωγή: Διαβητική νεφρική νόσο(DKD) παραμένει η κύρια αιτία χρόνιας νεφρικής νόσου. Έχει αναφερθεί δυσρύθμιση των κυκλοφορούντων miRNA, υποδηλώνοντας τον παθολογικό τους ρόλο στην DKD. Αυτή η μελέτη στόχευε στη διερεύνηση των διαφορικά εκφραζόμενων miRNAs στους ορούς ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2) με και χωρίς λευκωματουρία σε επιλεγμένο πληθυσμό της Μαλαισίας.Μέθοδος:Σαράντα ένας ασθενείς με ΣΔ2 σε παρακολούθηση σε κοινοτική κλινική χωρίστηκαν σε ομάδες φυσιολογικής-(NA), μικρο-(MIC) και μακρολευκωματινουρίας (MAC). Τα διαφορικά επίπεδα των miRNAs σε 12 δείγματα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συστοιχία miScript qPCR miRNA που εστιάζεται στο μονοπάτι (human fibrosis) και επικυρώθηκε σε 33 δείγματα, χρησιμοποιώντας την προσαρμοσμένη συστοιχία qPCR miScript (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hilden, Γερμανία).Αποτελέσματα:Τάσεις ανοδικής ρύθμισης 3 miRNA στον ορό, συγκεκριμένα, miR-874-3p, miR{-101-3p και miR-145-5p ασθενών με ΣΔ2 με MAC σε σύγκριση με αυτούς με ΝΑ. Στατιστικά σημαντική ανοδική ρύθμιση του miR- 874-3p (p= 0.04) και miR-101-3p (pΤο=0.01) εμφανίστηκε στην κοόρτη επικύρωσης. Σημαντικές αρνητικές συσχετίσεις μεταξύ του εκτιμώμενου ρυθμού σπειραματικής διήθησης (eGFR) και του miR-874-3p (p= 0.05), miR-101-3p (p= 0.03) και miR-145-5p (p= 0.05) καθώς και θετική συσχέτιση μεταξύ miR-874-3p και ηλικίας (p= 0.03) φάνηκαν με την ανάλυση συντελεστών συσχέτισης Pearson.Συμπέρασμα:Η ανοδική ρύθμιση του προηγουμένως γνωστού miRNA, συγκεκριμένα του miR-145-5p, και πιθανώς των νέων, συγκεκριμένα του miR-874-3p και του miR-101-3p στον ορό ασθενών με ΣΔ2, βρέθηκε σε αυτή τη μελέτη . Υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του eGFR και αυτών των miRNA. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης παρείχαν ενθαρρυντικά στοιχεία για την περαιτέρω διερεύνηση των πιθανών ρόλων αυτών των διαφορικά εκφραζόμενων miRNAs σεDKD.

Κάντε κλικ στο cistanche herba για νεφρική νόσο

Εισαγωγή

Η διαβητική νεφρική νόσος (DKD) ευθύνεται για το 39% των περιστατικών νεφρικής νόσου τελικού σταδίου στις ΗΠΑ [1]. Ομοίως, η DKD συνεχίζει να είναι η κύρια αιτία χρόνιας νεφρικής νόσου (ΧΝΝ) στη Μαλαισία, συμβάλλοντας στο 69% των νέων ασθενών σε αιμοκάθαρση το 2018 [2]. Η παθολογία της DKD πιστεύεται ότι οφείλεται κυρίως στην υπεργλυκαιμία, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών οδών σηματοδότησης και τελικά τη νεφρική ίνωση [3]. Παρά την πρόοδο στη διαχείριση, οι τρέχοντες βιοδείκτες και οι θεραπείες αποτυγχάνουν να αποτρέψουν την εξέλιξη της σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου [3]. Ως εκ τούτου, απαιτείται επειγόντως μια καλύτερη κατανόηση των μεσολαβητών και των μηχανισμών της DKD.

Το μικροριβονουκλεϊκό οξύ (miRNA) είναι μια οικογένεια μικρού μη κωδικοποιητικού RNA που έχει αναδειχθεί ως σημαντικοί μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης [4]. Έχει παρατηρηθεί ανώμαλη έκφραση των miRNAs και η εμπλοκή τους στον κυτταρικό μηχανισμό της DKD [3]. Αυτή η μελέτη είχε στόχο να αναγνωρίσει το πρότυπο έκφρασης επιλεγμένων miRNAs στους ορούς ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2) με και χωρίς λευκωματουρία. Παγκοσμίως, παρόμοιες μελέτες έχουν γίνει σε διάφορους πληθυσμούς, όπως αναθεωρήθηκε προηγουμένως [5-7]. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε το μοτίβο της διαφορικής έκφρασης μιας επιλογής miRNAs που σχετίζονται με ινωτικά μονοπάτια σε ασθενείς με ΣΔ2, μερικά από τα οποία έχουν μελετηθεί προηγουμένως στο DKD. Προηγούμενες μελέτες έχουν προτείνει εθνοτικές διαφορές στην έκφραση του miRNA [8, 9]. Ως εκ τούτου, εκτός από το ότι μπορεί να επιβεβαιώσει προηγούμενα ευρήματα, αυτή η μελέτη μπορεί ενδεχομένως να αποκαλύψει νέα miRNAs, που ίσως εκφράζονται μοναδικά στον πληθυσμό της Μαλαισίας.

Υλικά και μέθοδοι

Πληθυσμός Μελέτης

Αυτή η συγχρονική μελέτη περιελάμβανε 41 υπάρχοντες ασθενείς με ΣΔ2 σε παρακολούθηση σε κοινοτική κλινική, από τον Ιανουάριο έως τον Απρίλιο του 2019. Αυτή η μελέτη περιελάμβανε μια διαδικασία 2-βήματος: (1) miRNAs στον ορό 12 ασθενών (κοόρτη προσυμπτωματικού ελέγχου ) διαμορφώθηκαν προφίλ και (2) τα πιο σχετικά miRNA επικυρώθηκαν με τους ορούς από 33 ασθενείς (αναφέρεται ως η κοόρτη επικύρωσης). Αυτό περιελάμβανε 4 ασθενείς από την κοόρτη προσυμπτωματικού ελέγχου. Ελήφθη γραπτή συγκατάθεση από μεμονωμένους ασθενείς. Η δεοντολογική έγκριση για αυτήν τη μελέτη ελήφθη από την Επιτροπή Ιατρικής Έρευνας και Δεοντολογίας (MREC), Υπουργείο Υγείας της Μαλαισίας. Κριτήρια συμπερίληψης ήταν οι ασθενείς με ΣΔ2 και οι διαθέσιμες κλινικές και εργαστηριακές πληροφορίες. Ασθενείς με ΣΔ τύπου 1. μη DKD? συννοσηρότητες όπως καρκίνος, οξεία εμπύρετη ασθένεια ή πρόσφατες λοιμώξεις. εγκυμοσύνη; και μετά τον τοκετό αποκλείστηκαν.

Πληροφορίες για τα ακόλουθα ανακτήθηκαν από τα ιατρικά αρχεία του ασθενούς: (1) δημογραφικά δεδομένα, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας και του φύλου. (2) κλινικά δεδομένα όπως η αρτηριακή πίεση, το βάρος, η διάρκεια του ΣΔ2, η θεραπεία και άλλες διαβητικές επιπλοκές. (3) εργαστηριακά δεδομένα που περιλαμβάνουν γλυκόζη πλάσματος νηστείας, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη A1c (HbA1c), αναλογία λευκωματίνης προς κρεατινίνη και κρεατινίνη ορού. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε 3 ομάδες ανάλογα με τα επίπεδα λευκωματουρίας τους, τη φυσιολογική αλβουμινουρία (NA), τη μικρολευκωματινουρία (MIC) και τη μακρολευκωματινουρία (MAC).

Ορισμός

Σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ,

Τα NA, MIC και MAC ορίστηκαν ως αναλογία λευκωματίνης προς κρεατινίνη του<30, between 30 and 300 and >300 mg/g κρεατινίνης, αντίστοιχα, σε τουλάχιστον 2 από τις 3 συλλογές κηλίδων ούρων [10]. Ο εκτιμώμενος ρυθμός σπειραματικής διήθησης (eGFR) υπολογίστηκε με βάση την εξίσωση κρεατινίνης Χρόνια Νεφρική Νόσο-Επιδημιολογία.

Παρασκευή ορού

Vacutainer Τα δείγματα νηστείας (λιγότερο από ή ίσο με 8 ώρες) ολικού αίματος σε σωλήνες 10-mL BD ®SSTTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ΗΠΑ) αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30-λεπτά πήξη πριν από 10- λεπτά φυγοκέντρησης στα 1,900 g. Η ανώτερη φάση συλλέχτηκε, διηθήθηκε με φίλτρο Minisart®PES 0.22-μm (Sartorius, Gottingen, Γερμανία) και κατανεμήθηκε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης για αποθήκευση στους -80 βαθμούς μέχρι την ανάλυση.

Ολικό miRNA

Απομόνωση Το συνολικό miRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ορού/πλάσμα miRNeasy (Qiagen GmbH) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το αντιδραστήριο λύσης Qiazol προστέθηκε σε δείγμα 200 μL ορού για μετουσίωση, ακολουθούμενο από miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNA miRNA (Qiagen GmbH) για την παρακολούθηση της ανάκτησης RNA και την αντιστροφή αποτελεσματικότητα μεταγραφής. Προστέθηκε χλωροφόρμιο για διαχωρισμό φάσεων ακολουθούμενο από προσθήκη 100% αιθανόλης στην ανώτερη υδατική φάση. Τα βήματα έκπλυσης επιτεύχθηκαν με Buffer RWT, Buffer RPE και 80% αιθανόλη. Το RNA εκλούστηκε προσθέτοντας 14 μL νερού χωρίς RNase στη μεμβράνη στήλης περιστροφής RNeasy MinElute. Η ποσότητα και η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκαν με ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA), πριν από την αποθήκευση στους -80 βαθμούς μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) του miRNA σε cDNA και η προενίσχυση πραγματοποιήθηκαν με το κιτ miScript RTII (Qiagen GmbH) και το κιτ miScript PreAMP PCR (Qiagen GmbH), αντίστοιχα, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας 6 μL πρότυπο RNA και 5 μL αραιωμένου cDNA, αντίστοιχα

Ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο

Τα κυκλοφορούντα miRNA στον ορό της κοόρτης διαλογής ταυτοποιήθηκαν από τη συστοιχία miRNA qPCR miScript (Qiagen GmbH) που εστιάζεται στο μονοπάτι (ανθρώπινη ίνωση) και τα επιλεγμένα miRNA επικυρώθηκαν αργότερα στην κοόρτη επικύρωσης με μια προσαρμοσμένη διάταξη miRNA qPCR miScript (CMIHS02742) Qiagen GmbH) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε αντίδραση περιελάμβανε ένα πρότυπο cDNA, 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay και νερό χωρίς RNase και αραιωμένο cDNA προτύπου για να σχηματιστεί συνολικός όγκος 25 μL. Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο στο Eppendorf Mastercycler ep realplex 4, το οποίο προγραμματίστηκε ως εξής: 15 λεπτά σε 95 μοίρες, 15 δευτερόλεπτα σε 94 μοίρες, 30 δευτερόλεπτα σε 55 μοίρες και 30 δευτερόλεπτα σε 70 μοίρες με 40 κύκλους.

Σχετική ποσοτικοποίηση του miRNA

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση δεδομένων PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας το λογισμικό Qiagen Gene Globe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Η σχετική έκφραση (RE) προήλθε με τη μέθοδο 2−∆Ct, όπου η έκφραση κάθε miRNA κανονικοποιήθηκε σε αυτήν του γονιδίου housekeeping SNORD95 ή Global Ct Mean. Η αλλαγή πτυχής υπολογίστηκε από την κανονικοποιημένη έκφραση miRNA σε κάθε ομάδα (MIC ή MAC) διαιρεμένη με την κανονικοποιημένη έκφραση miRNA στην ομάδα ελέγχου (NA). Οι τιμές p υπολογίστηκαν με βάση μια ανεξάρτητη δοκιμή δειγμάτων t-test των αντίγραφων τιμών RE (2−∆Ct) για κάθε γονίδιο στην ομάδα ελέγχου και στις ομάδες δοκιμής. Περαιτέρω επαλήθευση της ανάλυσης δεδομένων qPCR έγινε με μη αυτόματο τρόπο χρησιμοποιώντας το Microsoft Excel και το IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp, Ar monk, NY, USA) έκδοση 25 για το λογισμικό Microsoft Windows.

Επιλογή miRNAs στην κοόρτη διαλογής για επικύρωση

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 θεωρήθηκε ως αρνητική έκφραση, όπως προτείνεται από το Κέντρο Ανάλυσης Δεδομένων Qiagen GeneGlobe (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Ο διαδικτυακός συμπληρωματικός Πίνακας 1 (για όλο το διαδικτυακό συμπληρωματικό υλικό, βλ. www.karger.com/doi/10.1159/000518866) δείχνει ένα RE 84 miRNA στην κοόρτη διαλογής κανονικοποιημένο στην παγκόσμια μέση τιμή Ct. Επιλέχθηκαν για επικύρωση MiRNAs με σημαντικές ±2.0-πλήρες αλλαγές και καλής ποιότητας, όπως ορίζονται από το λογισμικό. Επιπλέον, άλλα miRNA επιλέχθηκαν με βάση την κατάταξη των τιμών τους p και τη συμμετοχή τους σε προηγούμενες μελέτες σε μονοπάτια που σχετίζονται με DKD και DKD, όπου επιλέχθηκαν miRNA με τον υψηλότερο αριθμό υποτιθέμενων στόχων αγγελιαφόρου RNA. Ο διαδικτυακός συμπληρωματικός Πίνακας 2 δείχνει τα πρόσθετα κριτήρια που χρησιμοποιούνται για την επιλογή των miRNAs για επικύρωση. Στην ανάλυση επικύρωσης, η έκφραση του miRNA κανονικοποιήθηκε σε SNORD95, καθώς η συνολική μέση μέθοδος Ct δεν ήταν κατάλληλη και η Ct > 35 θεωρήθηκε αρνητική έκφραση. Για τυποποίηση, αναλύσαμε ξανά το RE του επιλεγμένου miRNA στην κοόρτη διαλογής με βάση την κανονικοποίηση του SNORD95 και αυτό χρησιμοποιήθηκε για επακόλουθη ανάλυση σε σύγκριση με την κοόρτη επικύρωσης.

Στατιστική ανάλυση

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >Έγιναν 2 ανεξάρτητες ομάδες χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal-Wallis ανεξάρτητων δειγμάτων (Πίνακας 1). Η σύγκριση των κατηγορικών μεταβλητών έγινε με τη χρήση είτε του χ2 τεστ απρόβλεπτων είτε του ακριβούς τεστ Fisher (Πίνακας 1). Η συσχέτιση μεταξύ επιλεγμένων miRNA RE και συνεχών μεταβλητών (δημογραφικά και κλινικά δεδομένα) έγινε με χρήση του συντελεστή συσχέτισης Pearson. Η δοκιμή πολλαπλής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της γραμμικής σχέσης μεταξύ επιλεγμένου miRNA RE και των σημαντικών προγνωστικών παραγόντων του. Οι στατιστικοί υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας το IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp) έκδοση 25 για τα Microsoft Windows και το στατιστικό πακέτο προγράμματος λογισμικού Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, USA). Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p < 0.05.

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 25% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 9% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ ΓΙΑ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ