Κινεζική ιατρική Cistanche Χημική σύνθεση και ανάλυση των συστατικών στο σώμα Ⅲ

Κεφάλαιο 3 Ποσοτική ανάλυση συστατικών πολλαπλών συστατικών του Cistanche deserticola με βάση το RPLC-HILIC-MS/MS

Η χημική σύνθεση της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής είναι πολύπλοκη και περιέχει μια ποικιλία ενώσεων όπως πρωτογενείς και δευτερογενείς μεταβολίτες [55-561. Η επίτευξη ολοκληρωμένης και αξιόπιστης ανάλυσης των χημικών συστατικών της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής (συμπεριλαμβανομένων των υδρόφιλων και υδρόφοβων συστατικών) εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό τεχνικό πρόβλημα. Επιπλέον, το περιεχόμενο κάθε συστατικού στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική ποικίλλει πολύ και οι συμβατικές μέθοδοι φασματομετρίας μάζας υγρών είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθούν με ακρίβεια τόσο τα κύρια όσο και τα ιχνοστοιχεία ταυτόχρονα. 1571 Ο παραδοσιακός διαχωρισμός μιας στήλης δεν είναι αρκετός και η ανάλυση των ιχνών ενώσεων στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική θα περιοριστεί από σταθερές. Λόγω της παρεμβολής των ενώσεων, το φαινόμενο της επικάλυψης κορυφής είναι σοβαρό. Παρόλο που έχει χρησιμοποιηθεί μια ποικιλία προηγμένων τεχνικών χρωματογραφίας για τη βελτίωση του διαχωρισμού σύνθετων μητρών, όπως στήλες χρωματογραφίας πυρήνα-κελύφους και σωματιδίων υπομικρού, στήλες χρωματογραφίας υδρόφιλης αλληλεπίδρασης κ.λπ., εξακολουθεί να είναι δύσκολο να επιτευχθεί πλήρης διαχωρισμός διαφορετικών ενώσεων χρησιμοποιώντας μονή στήλη [58 -59. Η χρωματογραφία πολλαπλών στηλών που συνδυάζει τουλάχιστον δύο ορθογώνιους χρωματογραφικούς μηχανισμούς, όπως το δισδιάστατο LC, το LC εναλλαγής στήλης και το LC δύο στηλών, έχει θεωρηθεί εφικτό εργαλείο που μπορεί να επεκτείνει σημαντικά την κάλυψη του μεταβολίτη. Δεν υπάρχει αμφιβολία ότι τόσο το δισδιάστατο LC όσο και το LC μεταγωγής στήλης μπορούν να αυξήσουν σημαντικά τη μέγιστη χωρητικότητα 160). Ωστόσο, και οι δύο μέθοδοι εξαρτώνται από τη βαλβίδα, τα όργανα είναι πολύπλοκα και χρονοβόρα και οι σωλήνες σύνδεσης και οι ρυθμιστές είναι εύκολο να εγκατασταθούν. Υπάρχουν υπολείμματα και αυτές οι δύο μέθοδοι είναι επιρρεπείς στην εισαγωγή μιας σειράς παραγόντων αβεβαιότητας που οδηγούν σε ποσοτική μη αναπαραγωγιμότητα1571. Παρόλο που η χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλεπίδρασης αντίστροφης φάσης (RPLC-HILIC) δεν μπορεί να αυξήσει σημαντικά τη μέγιστη χωρητικότητα, ο εξοπλισμός του οργάνου είναι απλός, δεν υπάρχουν υπολείμματα στους σωλήνες σύνδεσης και τους ρυθμιστές και μπορεί ακόμα να συνειδητοποιήσει την αλλαγή από υδρόφιλο σε υδρόφοβο. Ολοκληρωμένη διατήρηση ενός μεγάλου αριθμού ευρέως πολικών ενώσεων [61-66. Επιπλέον, η λειτουργία παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM) που είναι μοναδική για το φασματόμετρο μάζας τριπλού τετραπολικού (QgQ) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως άλλη διάσταση διαχωρισμού για περαιτέρω βελτίωση της ικανότητας διαχωρισμού του RPLC-HILIC. Εν ολίγοις, το RPLC-HILIC-MRM ενσωματώνει τα εγγενή πλεονεκτήματα των RPLC, HILIC και MRM και αναμένεται να γίνει μια αξιόπιστη αναλυτική μέθοδος.

ΠΟΣΟ ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΝΑ ΔΟΥΛΕΨΕΙ ΤΟ CISTANCHE;

Το περιεχόμενο κάθε συστατικού της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής ποικίλλει πολύ. Σε σύγκριση με τα κύρια συστατικά, οι άνθρωποι δίνουν μεγαλύτερη προσοχή στην ανάπτυξη πιο ευαίσθητων μεθόδων για την ολοκλήρωση της ανίχνευσης αυτών των ιχνών ή ακόμη και των εξαιρετικά ιχνών ενώσεων. Η λειτουργία MRM συνιστάται συχνά λόγω της εξαιρετικής ευαισθησίας και του καλού γραμμικού δυναμικού εύρους167. Ωστόσο, και λόγω του κορεσμού του τερματικού πολλαπλασιασμού ηλεκτρονίων του θαλάμου Q3 του φασματόμετρου μάζας QqQ, το γραμμικό εύρος συνήθως περιορίζεται και το ανώτερο όριο ποσοτικοποίησης (ULOQ) δεν μπορεί να καλύψει πλήρως το περιεχόμενο ορισμένων κύριων ενώσεων χωρίς αξιόπιστη παρακολούθηση αυτά τα ιχνοστοιχεία. Επομένως, η καταστολή της παραγωγής ιόντων προϊόντων μπορεί να επεκτείνει το ULOO. Χρησιμοποιώντας εξασθενημένες παραμέτρους ένωσης όπως ζεύγη ιόντων,αποθήκη(DP) καιενέργεια σύγκρουσης(CE) μπορεί να μειώσει τον αριθμό των ιόντων προϊόντων-στόχων και έτσι να διευρύνει το ULOQ[68-69]

Η παραδοσιακή κινέζικη ιατρικήCistanches Herbaείναι το αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος με φολιδωτά φύλλα τουΦυτό Κιστάνι. Είναι ένα από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα και είναι γνωστό ως «τζίνσενγκ της ερήμου». Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες ήταν πάντα ένα καυτό ερευνητικό θέμα στο Cistanche deserticola, αλλά τα τελευταία χρόνια, οι φαρμακολογικές επιδράσεις άλλων υδρόφιλων συστατικών όπως η μαννιτόλη έχουν επίσης αναγνωριστεί καλά! 70-721. Ωστόσο, στην καθημερινή μας ποσοτική ανάλυση CH, τα περιεχόμενα των κύριων συστατικών όπως π.χechinaceaside,βερμπασκοσίδηκαι η μαννιτόλη ήταν μερικές φορές πολύ υψηλή για να υπερβεί το εύρος μέτρησης του ανιχνευτή UV ή του ανιχνευτή σκέδασης εξατμιστικού φωτός (ELSD). Ως εκ τούτου, από τη σκοπιά της συνολικής αξιολόγησης ποιότητας, είναι σημαντικό να καθιερωθεί μια αναλυτική μέθοδος που θα μπορεί να παρακολουθεί ταυτόχρονα τα υδρόφιλα και τα υδρόφοβα συστατικά και να ποσοτικοποιεί με ακρίβεια τόσο τα κύρια όσο και τα ίχνη.

Το πείραμα σε αυτό το κεφάλαιο καθιέρωσε μια αξιόπιστη μέθοδο κατάλληλη για την ανάλυση πολύπλοκων μητρών - φασματομετρία υγρής μάζας RPLC-HILIC-MS/MS (σειριακά συζευγμένη χρωματογραφία ανάστροφης φάσης-υδροφιλικής αλληλεπίδρασης-διαδοχική φασματομετρία μάζας), η οποία πέτυχε την ανίχνευση 23 πολικοτήτων στο Cistanche deserticola . Ταυτόχρονος διαχωρισμός, ανάλυση και προσδιορισμός της περιεκτικότητας ενός ευρέος φάσματος ενώσεων (που καλύπτουν υδρόφιλα και υδρόφοβα συστατικά). ενώ χρησιμοποιείται η λειτουργία SMRM για τη διασφάλιση της επαναληψιμότητας αυτής της μεθόδου, χρησιμοποιώντας κατάλληλες τιμές CE και διαφορετικά ζεύγη ιόντων για την επέκταση του κώνου πεύκου. εφικτό εργαλείο για τη βελτίωση του ποιοτικού ελέγχου του Cistanche deserticola και τη συμβολή στην επίτευξη ευρέως διαδεδομένου στοχευμένου μεταβολισμού των φυτών. Γονιδιωματική.

Ενότητα 1 Πειραματικά Υλικά

1. Όργανο

Το φασματόμετρο υγρής μάζας HPLC-Qtap-MS είναι εξοπλισμένο με Shimadzu HPLC (εξοπλισμένο με 2 αντλίες LC-20ADxR, αυτόματο δειγματολήπτη SIL-20ACxR, ανιχνευτή UV SPD-M20A, CTO-20AC θερμοστάτης, DGU-20Α3R online απαέρωση Αποτελείται από μια μηχανή, CBM-20Ένα ελεγκτή, Shimadzu Corporation, Japan) και φασματόμετρο μάζας SCIEX5500 Qtrap (πηγή ιόντων ESI, SCIEX, Foster City, CA, USA) . Η απόκτηση και ο υπολογισμός των δεδομένων ολοκληρώθηκαν από το λογισμικό Analyst Software1.6.2. Σύστημα καθαρισμού υπερκαθαρού νερού Mili-Q (Milipore Company, ΗΠΑ), ηλεκτρονικός αναλυτικός ζυγός Mettler ME204 (Mettler Toledo Company, Ελβετία), εξαγωγέας υπερήχων (230V, Bransonmodel 5510, Danburry, CT, ΗΠΑ).

2. Υλικά και αντιδραστήρια

Στήλη Waters Acquity UPLC HSS T3 (2,1 x 100 mm, 1,8 μm), στήλη Waters XBridge Amide (4,6 mmx150 mm, 3,5 μm).Πολυαιθεραιθερκετόνηαγωγός (PEEK) (Agilent Company, ΗΠΑ). Η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο και το μυρμηκικό οξύ βαθμού χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας αγοράστηκαν από την ThermoFisher (Pittsburgh, PA, USA) και το νερό ήταν υπερκαθαρό νερό Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) που κατασκευάστηκε στο εργαστήριο . Νιασίνη (νικοτινικό οξύ, cLogP, 0.799), ηλεκτρικό οξύ (cLogP, -0.526) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, ΗΠΑ): ουριδίνη (cLogP, -2.219), αδενοειδές αδενοσίνη (cLogP, -2.158), ινοσίνη (cLogP, {{10}}.106) και γουανοσίνη (cLogP , -3.326) αγοράστηκαν από την Beijing Xinjingke Biotechnology Co., Ltd. Salidroside (cLogP -0.296), 6-deoxycatalpol (cLogP, -3.071), φαινυλαλανίνη (cLogP, -1.556), 8-επι-λογανικό οξύ (cLogP, -2.366), μαννιτόλη (cLogP, -2.046), σακχαρόζη (cLogP , -3.087), γλουροζίτη (cLogP, -1.757), αλασχανιοσίδη Α (αλασχανιοσίδη Α, cLogP -0.971 ), εχινακοσίδη (εχινακοσίδη, cLogP, -1 .811), φερουλικό οξύ (cLogP, 1.421), ακτεοσίδη (cLogP, -0.890), ισοακτεοσίδη (cLogP, -0.057) και Πινορεσινόλη- -D-γλυκοπυρανοσίδη (cLogP, Το -0.384) παρασχέθηκε από το Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs of Peking University, cistanoside F (cistanoside F, cLogP, -2.211) Αγορά από την Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd., η κιστανοσίδη Α (σιστανοσίδη Α, cLogP, -1.365), η 2'-ακετυλακτεοσίδη (cLogP, -0.040) και η απιοσίδη λικουριτίνη (cLogP, -0.267) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Η Shidande Biotechnology Co., Ltd., και η tubuloside A (tubulosideA, cLogP, 0,287) αγοράστηκαν από την Chengdu Weiqi Biotechnology Co., Ltd. Η καθαρότητα όλων των ουσιών αναφοράς δοκιμάστηκε με HPLC-DAD-IT-TOF-MS και το η καθαρότητα ήταν μεγαλύτερη από 98%. Όλες οι τιμές cLogP της ουσίας ελέγχου υπολογίστηκαν από το λογισμικό ChemBioDraw Ultra14.0 (CambridgeSoftCambridge, ΜΑ, ΗΠΑ).