Χημικά προφίλ και μελέτη μεταβολίτη ακατέργαστου και επεξεργασμένου Cistanche Deserticola σε αρουραίους από UPLC-Q-TOF-MSE

Email επικοινωνίαςtina.xiang@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη

Ιστορικό: Η κινεζική επεξεργασία materia medica είναι μια διακεκριμένη και μοναδική φαρμακευτική τεχνική στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική (TCM) που χρησιμοποιείται για τη μείωση των παρενεργειών και την αύξηση ή ακόμα και την αλλαγή της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των ακατέργαστων βοτάνων. Οι αλλαγές στα βασικά συστατικά που προκαλούνται από μια βελτιστοποιημένη διαδικασία επεξεργασίας είναι κυρίως υπεύθυνες για την αυξημένη αποτελεσματικότητα των φαρμακευτικών φυτών. Η αναζωογονητική επίδραση του ρυζιού στον ατμό με κρασίCistanche deserticolaΤο (C.deserticola) ήταν ισχυρότερο από το ακατέργαστο C.deserticola (CD).

Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση χρησιμοποιώντας το UPLC-Q-TOF-MS' με την πλατφόρμα πληροφορικής UNIFl για να προσδιοριστεί η επίδραση της επεξεργασίας. Πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες για τον χαρακτηρισμό των συστατικών καθώς καιμεταβολίτεςin vivo. Τα χημικά συστατικά προσδιορίστηκαν στο CD και στα επεξεργασμένα προϊόντα του. Οι πολυμεταβλητές στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν για να αξιολογηθούν οι διακυμάνσεις μεταξύ τους ενώ το OPLS-DA χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση κατά ζεύγη.

Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης αποκάλυψαν σημαντικές παραλλαγές στους φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhG) καιιριδοειδήμετά την επεξεργασία. Συνολικά 97 ενώσεις ανιχνεύθηκαν στα εκχυλίσματα του CD και του επεξεργασμένου προϊόντος του. PhG που έχουν την 4-ομάδα Ο-καφεοϋλίου στο τμήμα 8-Ο{- -D-γλυκοπυρανοσυλίου, όπως ακτεοσίδη, κιστανοσίδη C, καμπνεοσίδη Il, οσμανθουσίδη μειώθηκαν μετά την επεξεργασία, ενώ τα PhG με 6' -Η ομάδα Ο-καφεοϋλίου στο τμήμα 8-Ο{- -D-γλυκοπυρανοσυλίου, όπως ισοακετοσίδη, ισοστανοσίδη C, ισοκαμπνεοσίδη l, ισομαρτυνοσίδη αυξήθηκε, ειδικά στην ομάδα CD-NP. Αυξήθηκε επίσης η ένταση του εχινακοσίδη και του κιστανοζίτη Β των οποίων η δομή έχει 6'-O- -D-γλυκοπυρανοσύλιο. Σε in vivo μελέτη, ανιχνεύθηκαν 10 πρωτότυπα συστατικά και 44 μεταβολίτες σε πλάσμα, κόπρανα και ούρα αρουραίου. Τα ληφθέντα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η επεξεργασία οδηγεί σε σημαντική διακύμανση στα χημικά συστατικά του CD και επηρέασε τη διάθεση των ενώσεων in vivo, και οι μεταβολικές διεργασίες φάσης Ⅱ είναι οι βασικοί καταρράκτες κάθε ένωσης και οι περισσότεροι μεταβολίτες σχετίζονται με την εχινακοσίδη ή ακτεοσίδη.

συμπεράσματα: Αυτή είναι η πρώτη παγκόσμια έρευνα σύγκρισης ακατέργαστου και επεξεργασμένου CD. Αυτά τα ευρήματα προσθέτουν στην κατανόησή μας για τον αντίκτυπο της επεξεργασίας CD και παρέχουν σημαντικά δεδομένα για μελλοντικές έρευνες αποτελεσματικότητας.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche deserticola, Επεξεργασία, UPLC-Q-TOF-MS5, Χημικά προφίλ, Μεταβολίτες in vivo

Εισαγωγή

Η επεξεργασία του κινεζικού materia medica (CMM) έχει επιδείξει σημαντική εφαρμογή στην κλινική πρακτική της Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής (TCM) και θεωρείται βιώσιμη θεραπεία για αρκετούς αιώνες. Αυτή είναι μια μοναδική φαρμακευτική τεχνολογία που έχει προέλθει από τη θεωρία της TCM. Μετά την επεξεργασία, έχουν εντοπιστεί σημαντικές διαφορές στην εμφάνιση, τα χημικά συστατικά, τα χαρακτηριστικά και τη φαρμακευτική σημασία όλων των τύπων TCM, γεγονός που οδηγεί στην υπόθεση ότι η επεξεργασία θα μπορούσε να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα ή να μειώσει τις τοξικές επιδράσεις του TCM.

Για εκατοντάδες χρόνια,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong στα κινέζικα, CD) χρησιμοποιείται συνήθως στην κλινική πρακτική της TCM για τη συμπλήρωση των λειτουργιών του νεφρού. Βοηθά επίσης στην ενυδάτωση του εντέρου που οδηγεί σε χαλάρωση του εντέρου [1].Cistancheηχογραφήθηκε για πρώτη φορά στο ShenNongBencaoJing. Βρίσκεται συνήθως σε άνυδρους και ημίξηρους οικοτόπους σε όλη την Ευρασία και τη Βόρεια Αφρική, συμπεριλαμβανομένου του Ιράν, της Κίνας, της Ινδίας και της Μογγολίας [2]. Η επεξεργασία του CD έχει πραγματοποιηθεί με ατμό με ρύζι-κρασί υπό κανονική πίεση, η οποία είναι μια μέθοδος παρασκευής που τεκμηριώνεται στην κινεζική φαρμακοποιία (Jiucongrong στα κινέζικα, στο εξής καλούμενη "CD-NP"). Και το μαγείρεμα CD στον ατμό με ρύζι-κρασί υπό υψηλή πίεση είναι μια πιο αποτελεσματική μέθοδος παρασκευής (εφεξής καλούμενη "CD-HP") [3, 4]. Αρκετές μελέτες έχουν αποκαλυφθεί ότι οι φαρμακολογικές επιδράσεις του CD διαφέρουν από τα επεξεργασμένα προϊόντα του [5]. Το CD μπορεί να τονώσει το νεφρικό-yang και να χαλαρώσει το έντερο, ενώ μετά τον ατμό με ρύζι-κρασί, το αποτέλεσμα της αναπλήρωσης του νεφρού-yang θα ενισχυόταν. Στην προηγούμενη μελέτη μας, βρέθηκε ότι το CD-NP θα μπορούσε να ενισχύσει την τόνωση του νεφρού και να υποστηρίξει το yang και να ανακουφίσει την επίδραση της υγρασίας των εντέρων και της αφόδευσης [6-8]. Στην κλινική πράξη, τα επεξεργασμένα προϊόντα είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μορφή.

Μέχρι σήμερα, αρκετές μελέτες έχουν αναλύσει τα χημικά συστατικά του CD, ακολουθούμενη από απομόνωση και ταυτοποίηση περισσότερων από 100 ενώσεων [9–11], όπως οι γλυκοσίδες της φαινυλαιθανόλης (PhGs),ιριδοειδή, λιγνάνες και ολιγοσακχαρίτες ως κύρια χημικά συστατικά του. Έχει επίσης αναφερθεί ότι υπάρχουν πολλές φαρμακολογικές δραστηριότητες των PhGs, συμπεριλαμβανομένων ανοσοτροποποιητικών, νευροπροστατευτικών, ηπατοπροστατευτικών, αντιφλεγμονωδών, αντιοξειδωτικών κ.λπ.[12-14]. Τα ιριδοειδή έχουν αντιφλεγμονώδη δράση [15, 16]. Έχει επίσης αποκαλυφθεί από προηγούμενες μελέτες ότι ορισμένα χημικά συστατικά παρουσίασαν παραλλαγές κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας [17-20]. Με βάση αυτές τις αναφορές, μπορεί να υποτεθεί ότι μετά την επεξεργασία, οι διακυμάνσεις στη χημική σύνθεση οδηγούν σε διάφορες φαρμακολογικές επιδράσεις, οι οποίες πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω.

Στην τρέχουσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε μια ευαίσθητη και αποτελεσματική μέθοδος, π.χ., υγρή χρωματογραφία εξαιρετικά υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) για συγκριτική ανάλυση και πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες για την ποιοτική ανάλυση των εκχυλισμάτων. CD, CD-NP και CD-HP για την αποσαφήνιση των χημικών τους προφίλ. Γενικά, οι εξωγενείς χημικές ουσίες με υψηλή έκθεση στα όργανα-στόχους θεωρήθηκαν ως αποτελεσματικά συστατικά. Ως εκ τούτου, σε αρουραίους, το CD και τα επεξεργασμένα προϊόντα του χορηγήθηκαν από το στόμα αντίστοιχα, ακολουθούμενο από τον χαρακτηρισμό τους. Η υπάρχουσα μελέτη αποκαλύπτει μια συγκριτική μελέτη (τόσο in vitro όσο και in vivo) ακατέργαστου και επεξεργασμένου CD για πρώτη φορά. Τα ληφθέντα αποτελέσματα θα διεύρυναν την κατανόησή μας σχετικά με την επίδραση της επεξεργασίας CD, κάτι που μπορεί να είναι χρήσιμο για περαιτέρω μελέτες.

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

Πρότυπες ενώσεις ajugol (180120) και 2'-ακετυλο-ακετοσίδης (M0601AS) παρέχονται από την Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Κίνα). Το Cistanoside F(MUST-17022620), το echinacoside (D1105AS), το cistano-side A(M0906AS) και το isoacteoside(M0106AS) παρασχέθηκαν από την εταιρεία Must (Sichuan China), το ακτεοσίδιο (O0618AS), το salidroside(J0526AS), catal (S0728AS), το geniposide (A0407AS) και το geniposidic acid (MB{6001-}S) αποκτήθηκαν από την Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd (Dalian, Κίνα).8-το οξυλογανικό οξύ (B31123) λαμβάνεται από την Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Κίνα. Η μεθανόλη και το ακετονιτρίλιο ήταν βαθμού MS και ελήφθησαν από την Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία. Μεθανοϊκό οξύ (CH, O,) βαθμού HPLC παρασχέθηκε από την Merck KGaA (Darmstadt, Γερμανία). Το νερό που χρησιμοποιήθηκε στην υπάρχουσα μελέτη υποβλήθηκε σε επεξεργασία μέσω του συστήματος Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, ΗΠΑ). Το κρασί από ρύζι παρεχόταν από την Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Κίνα).

Το Cistanch deserticola συλλέχθηκε από την Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Τα δείγματα ταυτοποιήθηκαν από τον καθηγητή Yanjun Zhai (σχολή φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Liaoning του TCM). Τα δείγματα υποβλήθηκαν στο Πανεπιστήμιο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής Liaoning.

Των ζώων

Αρσενικοί αρουραίοι Sprague–Dawley (βαθμός SPF) με 180–220 g συνολικού σωματικού βάρους παρασχέθηκαν από τη Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, αριθμός άδειας: SCXK-2015–0001). Αυτοί οι αρουραίοι στεγάστηκαν σε δωμάτιο αναπαραγωγής με καλά διατηρημένη θερμοκρασία και υγρασία, δηλαδή 20–26 βαθμούς, 50–70 τοις εκατό για μία εβδομάδα. Οι αρουραίοι τράφηκαν με συνήθη εργαστηριακή τροφή και νερό πριν από τον πειραματισμό. Τα ζώα νήστευαν όλη τη νύχτα, ωστόσο, το νερό κατά βούληση παρασχέθηκε πριν από τον πειραματισμό. Οι αρουραίοι εκτελέστηκαν με αναισθητικό 10 τοις εκατό ένυδρης χλωράλης. Η Θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Επαρχιακού Νοσοκομείου Κινεζικής Ιατρικής της Λιαονίν ενέκρινε όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα (25.3.2019, 2019015).

Παρασκευή εκχυλίσματος CD, CD‑NP και CD‑HP

Τα CD-NP, CD-HP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από την ίδια παρτίδα Cistanch deserticola. Για την παρασκευή του CD-NP, ξηρά τεμάχια CD (πάχος 5 mm, 100 g) ενυδατώθηκαν με ρύζι-κρασί (30 mL) και μαγειρεύτηκαν στον ατμό στους 100 βαθμούς για 16 ώρες, ακολουθούμενο από ξήρανση στους 55 βαθμούς μέσω φούρνου ξήρανσης. Ενώ το CD-HP παρασκευάστηκε μέσω διήθησης ξηρών τεμαχίων CD (πάχους 5 mm, 100 g) με κρασί ρυζιού (30 mL), ακολουθούμενο από ατμό σε ατμοσφαιρική πίεση 1,25 για 4 ώρες. και μετά στεγνώνουμε σε φούρνο στεγνώματος στους 55 βαθμούς .

Σε μια δοσομετρική φιάλη των 100 ml, ένα γραμμάριο σκόνης κοσκινίστηκε μέσω κόσκινου #4, ακολουθούμενο από προσθήκη 50 τοις εκατό μεθανόλης (50 mL) και στη συνέχεια καλύφθηκε σφιχτά και αναμίχθηκε. Αυτό το μίγμα ζυγίστηκε, ακολουθούμενο από μισή ώρα. διάλυση. Μετά τη διαβροχή, το μίγμα υποβλήθηκε σε υπερήχους (ισχύς 250 W, συχνότητα 35 kHz) για 40 λεπτά, ακολουθούμενο από ψύξη και ζύγιση ξανά. Η απώλεια βάρους αναπληρώθηκε με 50 τοις εκατό μεθανόλη, αναμίχθηκε κατάλληλα, και αφέθηκε να παραμείνει, ακολουθούμενη από διήθηση του υπερκειμένου και στη συνέχεια χρήση του ληφθέντος διηθήματος ως το διάλυμα δοκιμής.

Ανάλυση MSE ενεργών συστατικών

Παρασκευή τυπικών ουσιών: τουμπουλοσίδη-Α (3.02 mg), εχινακοσίδη (3.00 mg), 2'-ακετυλακτεοσίδη (2,34 mg), ακτεοσίδη (2,45 mg), ισοακτεοσίδη (0,61 mg), cistanoside-F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geni poside (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), γενιποσιδικό οξύ (2,56 mg) και 8-επιδεοξυλογανικό οξύ (2,34 mg) προστέθηκαν σε ογκομετρικό fask 10 mL, προστέθηκε σταθερός όγκος μεθανόλης σε κλίμακα, διαμορφώθηκε σε ένα αντίστοιχο διάλυμα αναφοράς συγκέντρωσης. Καθένα από τα 100 μL διαμορφώθηκε σε ένα μικτό διάλυμα αναφοράς.

Συνθήκη ανάλυσης MS: Η τιμή μάζας διορθώθηκε πριν από το πείραμα και χρησιμοποιήθηκε η λειτουργία αρνητικού ιόντος. Το εύρος μάζας ήταν 50–1200 Da και το δείγμα εγχύθηκε μέσω αντλίας έγχυσης ροής. Η ταχύτητα του κώνου ήταν 100 L/hrs, ο ρυθμός ροής του διαλύτη ορίστηκε στα 800 L/h. Οι τάσεις τριχοειδούς και κώνου καθορίστηκαν στα 2500 και 40 V, αντίστοιχα. Η θερμοκρασία της πηγής ιόντων και του αερίου διαλύτη ήταν 100 μοίρες και 400 μοίρες αντίστοιχα, και η συχνότητα λήψης σήματος ήταν 0,5 S−1.

Ανάλυση UPLC-Q-TOF-MS εκχυλίσματος CD (15-16 λεπτά), 65 τοις εκατό έως 55 τοις εκατό Α (16-18 λεπτά). Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 mL min−1, ενώ η θερμοκρασία του δωματίου και της στήλης αυτόματης δειγματοληψίας ήταν 30 μοίρες και 8 μοίρες ξεχωριστά. Ο όγκος της ένεσης ήταν 1,0 μL.

Η φασματομετρική αξιολόγηση μάζας πραγματοποιήθηκε μέσω Waters XEVO G{{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, ΗΠΑ), που περιλαμβάνει μια πηγή ESI. Ο ρυθμός ροής του αερίου αζώτου καθορίστηκε στα 800 L·hrs−1 με θερμοκρασία 400 μοιρών, η θερμοκρασία πηγής καθορίστηκε στους 100 βαθμούς και το αέριο κώνου ορίστηκε στα 50 Lh−1. Η τάση του κώνου και του τριχοειδούς ρυθμίστηκε στα 40 και 2000 V, αντίστοιχα. Η ενέργεια σύγκρουσης της ράμπας χρησιμοποιήθηκε στο εύρος των 20–30 V. Τα κεντροποιημένα δεδομένα όλων των δειγμάτων ελήφθησαν από 50 έως 1200 Da, με 5-χρόνο σάρωσης 0,5 s σε χρόνο ανάλυσης 10 λεπτών . Το LockSpray TM χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της ακρίβειας μάζας. Ως μάζα κλειδώματος χρησιμοποιήθηκε ιόν [M–H]− εγκεφαλίνης λευκίνης (ταχύτητα ροής έγχυσης 200 pg·μL−1 10 μL min−1) σε m/z 554,2615. Το λογισμικό Te MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ακριβή μάζα, τη σύνθεση των πρόδρομων ιόντων και τον υπολογισμό των ιόντων θραυσμάτων.

Ανάλυση δεδομένων στην πλατφόρμα Masslynx

Επιπλέον, μια εσωτερική βιβλιοθήκη που περιλαμβάνει το όνομα της ένωσης, τη δομή της και τον μοριακό τύπο (σε mol.) δημιουργήθηκε με βάση τη βιβλιογραφία. Όλες οι ενώσεις σημειώθηκαν σε ειδικό πρότυπο, κατασκευασμένο σε Excel. Επιπλέον, τα αρχεία mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, Η.Π.Α.) και τα αρχεία Excel όλων των επιμέρους σύνθετων δομών αποθηκεύτηκαν επίσης στον τοπικό υπολογιστή. Το καθιερωμένο φύλλο Excel με σημαντικά δεδομένα εισήχθη απευθείας στην επιστημονική βιβλιοθήκη του UNIFI

Το UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των δομικών χαρακτηριστικών, ιδιαίτερα για τα χαρακτηριστικά θραύσματα και τον κατακερματισμό του MS. Ορίστηκε μια ελάχιστη περιοχή κορυφής 500 για την ανίχνευση αιχμής 2D. Κατά τη διάρκεια της αποκάλυψης τρισδιάστατων κορυφών, επιλέχθηκε μια ένταση αιχμής χαμηλής ενέργειας με περισσότερες από 300 μετρήσεις και υψηλή ένταση αιχμής ενέργειας άνω των 80 μετρήσεων. Το σφάλμα μάζας βρέθηκε να είναι έως ±10 ppm για γνωστές ενώσεις και η ανοχή χρόνου κατακράτησης ορίστηκε στην περιοχή ±0,1 min. Επιλέξαμε τα αρνητικά πρόσθετα που περιέχουν -Η, συν HCOOH. Η επεξεργασία των ακατέργαστων δεδομένων που ελήφθησαν από το MS πραγματοποιήθηκε μέσω βελτιστοποιημένου λογισμικού UNIFI για τον γρήγορο εντοπισμό των χημικών συστατικών που πληρούσαν τα πρότυπα με τη βάση δεδομένων που είχε κατασκευαστεί από μόνος του και την εσωτερική Βιβλιοθήκη Παραδοσιακής Ιατρικής.

Στη συνέχεια, για να επαληθευτεί η χημική δομή κάθε ένωσης στόχου, τα ισομερή διακρίθηκαν από τα χαρακτηριστικά μοτίβα κατακερματισμού MS που αποκαλύφθηκαν στις αναφερόμενες μελέτες και συγκρίνοντας τους χρόνους κατακράτησης των προτύπων αναφοράς.

Μεταβολομική ανάλυση βασισμένη σε πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση

Πριν από την επεξεργασία των πρωτογενών δεδομένων, ορίστηκαν οι παράμετροι, όπως η μάζα που κυμαίνεται από 150 έως 1200 Da, εύρος χρόνου διατήρησης (0 έως 20 λεπτά), ένταση κατωφλίου ( 2000 μετρήσεις), ανοχή μάζας π.χ. 5 MDA, ενώ το παράθυρο μάζας και χρόνου κατακράτησης ήταν 0,20 λεπτά και 0,05 Da, αντίστοιχα. Στην επόμενη λίστα της βάσης δεδομένων, το αναγνωριστικό των ιόντων ήταν τα ζεύγη RT-m/ σε σχέση με τους χρόνους έκλουσής τους. Οι ίδιες τιμές για RT και m/z σε διάφορες παρτίδες δειγμάτων θεωρήθηκαν ως η ίδια ένωση.

Διεξήχθη πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση για την αξιολόγηση αποτελεσματικών βιοδεικτών που συνέβαλαν σημαντικά σε παραλλαγές μεταξύ διαφορετικών ομάδων. Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) για να υποδείξει τις μέγιστες διαφορές και την αναγνώριση προτύπων για τη λήψη μιας επισκόπησης και ταξινόμησης. Το OPLS-DA είναι ένα εργαλείο μοντελοποίησης που παρέχει οπτικοποίηση της προγνωστικής φόρτωσης στοιχείων OPLS-DA για να βοηθήσει στην αξιολόγηση του μοντέλου. Η μεταβλητή σημασία για την προβολή (VIP) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της αξιολόγησης των διαφόρων συνιστωσών, και ημεταβολίτεςwith VIP values>1.0 και τιμή P<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Πειράματα σε ζώα, οι αρουραίοι κατηγοριοποιήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (n=6 για κάθε ομάδα), ακολουθούμενη από την από του στόματος χορήγηση διαφόρων εκχυλισμάτων: (1) Κενή ομάδα ελέγχου: στους αρουραίους δόθηκε φυσιολογικός ορός (2 mL/100 g) ; (2) Ομάδα CD: στους αρουραίους δόθηκε εκχύλισμα CD (2 mL/100 g). (3) Ομάδα CD-NP: στους αρουραίους δόθηκε εκχύλισμα CD-NP (2 mL/100 g). (4) Ομάδα CD-HP: στους αρουραίους δόθηκε εκχύλισμα CD-HP (2 mL/100 g). Η περαιτέρω κατηγοριοποίηση όλων των ομάδων πραγματοποιήθηκε σε τρεις υποομάδες για το πλάσμα, τα ούρα και τα κόπρανα, αντίστοιχα. Δύο ώρες αργότερα, κάθε αρουραίος χορηγήθηκε από το στόμα με την ίδια και ίση ποσότητα εκχυλισμάτων.

Μετά τη χορήγηση, η συλλογή δειγμάτων αίματος πραγματοποιήθηκε σε 1.0 h, 2.0 h και 4.0 h σε ηπαρινισμένους σωλήνες πολυαιθυλενίου 1,5 mL (από τροχιακές φλέβες) , ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση (στις 4500 rpm) όλων των δειγμάτων για 15 λεπτά.

Για δείγματα ούρων και κοπράνων, οι αρουραίοι κρατήθηκαν σε κλωβούς μεταβολισμού και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η συλλογή δειγμάτων ούρων και κοπράνων για 24 ώρες μετά τη χορήγηση. Η φυγοκέντρηση των δειγμάτων ούρων πραγματοποιήθηκε στις 4500 rpm για 15 λεπτά, ενώ τα δείγματα κοπράνων ξηράνθηκαν στη σκιά, αλέστηκαν σε σκόνη, στη συνέχεια ελήφθησαν 0,2 g και προστέθηκαν σε 0,5 mL αλατούχου ορού. διάλυμα, υπερηχογράφημα για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στις 12,000 rpm για 15 λεπτά. Όλα τα βιοδείγματα διατηρήθηκαν στους -80 βαθμούς μέχρι την ανάλυση.

Προετοιμασία βιολογικών δειγμάτων. Η προσθήκη δειγμάτων πλάσματος, ούρων και κοπράνων πραγματοποιήθηκε με 3 όγκους μεθανόλης, ακολουθούμενη από στροβιλισμό για 3 λεπτά. Στη συνέχεια, η φυγοκέντρηση (στις 12,000 rpm) των μιγμάτων διεξήχθη για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από μεταφορά του υπερκειμένου εντός του σωλήνα ΕΡ και στη συνέχεια ξηράνθηκε με άζωτο στους 37 βαθμούς. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε η προσθήκη 200 μL διαλύματος HCN–H2O (50 τοις εκατό). Δέκα, η δίνη χρησιμοποιήθηκε για ανάμιξη (1 λεπτό), ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση (στις 12,000 rpm) για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο υγρό (5 μL) των επεξεργασμένων δειγμάτων εγχύθηκε στο σύστημα UPLC-Q-TOF-MSE.

Υγρή χρωματογραφική και φασματομετρική κατάσταση μάζας Η ανάλυση γιαμεταβολίτεςεκτελέστηκε επίσης από το όργανο Waters UPLC μέσω διεπαφής ESI. Οι διαχωρισμοί πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια στήλη Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2,1 mm, 1,8 μm), η κινητή φάση ήταν 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (Α): Ακετονιτρίλιο (Β), το Η συνθήκη έκλουσης βαθμίδωσης ήταν 0-3 min (99,8 τοις εκατό → 98 τοις εκατό A). {18}} min (90 τοις εκατό → 85 τοις εκατό A),12-17 min (85 τοις εκατό → 70 τοις εκατό A), 17-22 min (70 τοις εκατό → 60 τοις εκατό A), 22-23 ελάχ (60 τοις εκατό → 58 τοις εκατό A), 23-25 min (58 τοις εκατό A),25-32 min (58 τοις εκατό → 45 τοις εκατό A) και 32-37 min (45 τοις εκατό → 35 τοις εκατό A ), 0,4 mL min-1 ήταν ο ρυθμός ροής. Η θερμοκρασία για τη στήλη και το δωμάτιο δείγματος ορίστηκε στους 40 βαθμούς και 8 βαθμούς αντίστοιχα. Χρησιμοποιήθηκαν οι συνθήκες φασματομετρίας μάζας που αναφέρθηκαν παραπάνω.

Για την επεξεργασία δεδομένων χρησιμοποιήθηκε στρατηγική για συστηματική ανάλυση μεταβολιτών σε βιολογικά δείγματα λογισμικούUNIFI (1.8.2). Η συνάρτηση Binary Compare χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση αποτελεσματικών μεταβολιτών. Οι αξιολογημένοι μεταβολίτες δεν υπήρχαν στο ισοδύναμο δείγμα ελέγχου ή υπάρχουν σε χαμηλές εντάσεις ιόντων. Το όριο σχετικής έντασης ορίστηκε στο 3 ή 5 και οι μεταβολίτες που πληρούσαν τα υπογραμμισμένα κριτήρια μπορούσαν να αξιολογηθούν. Οι κοινοί και προβλέψιμοι μεταβολίτες στη συνέχεια προσδιορίστηκαν με EIC. Για την αναζήτηση μεταβολιτών δύο φάσεων, εφαρμόστηκε η συνάρτηση NLF. Για παράδειγμα, στο λογισμικό UNIFI, οι παράμετροι θα μπορούσαν να οριστούν σε 176,0321 για αναζήτηση πιθανών συζυγών γλυκουρονικού οξέος. Μετά την επεξεργασία, μπορεί να οριστεί ουδέτερη απώλεια στη μέθοδο ή να προσδιοριστεί. Το MassFragment χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό ή τον χαρακτηρισμό των δομών των ανιχνευόμενων μεταβολιτών, η συνάρτηση φασματικής ερμηνείας του UNIFI είναι η κύρια λειτουργία που χρησιμοποιείται για την ανάλυση του δευτερογενούς κατακερματισμού των μητρικών συστατικών. Αυτή η συνάρτηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για γρήγορη επαλήθευση της διαδρομής κατακερματισμού εάν είναι λογικό.

Αποτελέσματα

Κανόνας μαζικού κατακερματισμού φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών και ιριδοειδών

Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες είναι τα κύρια χημικά συστατικά του CD. Τα πρότυπα διαλύματα ισοακτεοζίτη,

Ελήφθησαν κιστανοζίτης F, τουμπουλοσίδης Α, εχινακοσίδης, ακτεοσίδης και 2'-ακετυλ-ακτεοζίτης, ακολουθούμενα από την παροχή διαφορετικού επιπέδου ενεργειών σύγκρουσης (Πίνακας 1), και στη συνέχεια ελήφθησαν οι αντίστοιχοι χάρτες MS2 (Εικ. 1).

Η φασματομετρική ανάλυση μάζας αποκάλυψε ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες έχουν παρόμοια μοτίβα κατακερματισμού φάσματος μάζας, οι οδοί διάσπασης στη λειτουργία αρνητικών ιόντων περιλαμβάνουν κυρίως (1) Διάσπαση δεσμού εστέρα: απώλεια ουδέτερης καφεοϋλ ομάδας (C, H, O162.03) και ουδέτερο ακετύλιο ομάδα (C, Η, Ο, 42.00); (2) Γλυκοζιδική διάσπαση: απώλεια υπολειμμάτων ουδέτερης ραμνόζης (C.HIO, 146.05) και ουδέτερου υπολείμματος γλυκόζης (CgHO, 162.05). Από τη φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης, το καφεοϋλ (162,03) και το υπόλειμμα γλυκόζης (162,05) μπορούσαν να διακριθούν.

Λήφθηκαν πρότυπα διαλύματα Iridoids ajugol, catalpol, geniposidic acid, geniposide και 8-epide oxyloganic acid, ακολουθούμενα από την παροχή διαφορετικών ενεργειών σύγκρουσης και ελήφθησαν αντίστοιχοι MS' χάρτες (Εικ. 2).

Οι ιριδοειδείς γλυκοσίδες έχουν παρόμοια μοτίβα κατακερματισμού φάσματος μάζας, οι οδοί διάσπασης στη λειτουργία αρνητικών ιόντων περιλαμβάνουν κυρίως (1) Γλυκοζιδική διάσπαση: Απώλεια ουδέτερου υπολείμματος γλυκόζης (CHoO, 162.05), (2) Απώλεια ουδέτερου CO, (43,99) και Η , Ο(18.01).

Ταυτοποίηση των ενώσεων σε εκχυλίσματα CD, CD-NP και CD-HP

Ανάλυση UPLC-QTOF-MSE

Πραγματοποιήθηκε η βελτιστοποίηση των χρωματογραφικών συνθηκών. Στη συνέχεια, οι ενώσεις του CistancheHerba αξιολογήθηκαν τόσο σε αρνητικούς όσο και σε θετικούς τρόπους ιόντων με υψηλή όσο και χαμηλή CEs. Τα ληφθέντα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η συμβατότητα του αρνητικού τρόπου λειτουργίας ήταν υψηλότερη σε σχέση με τον θετικό τρόπο για αυτές τις ενώσεις. Το Σχήμα 3 έδειξε χρωματογραμμάριο βασικού ιόντος κορυφής MS (ΒΡΙ) που ιχνηλατήθηκε με αριθμημένες κορυφές. Η ένταση κάθε ανιχνευόμενου ιόντος στην ανάλυση UPLC-Q-TOF-MS' κανονικοποιήθηκε σε σχέση με το σύνολο των ιόντων για τη δημιουργία μιας μήτρας δεδομένων που αποτελείται από την τιμή m/z, την κανονικοποιημένη περιοχή κορυφής και τον χρόνο κατακράτησης.

Η αξιολόγηση εξαρτημάτων από CD και τα επεξεργασμένα προϊόντα του στην πλατφόρμα UNIFl

Συνολικά 97 ενώσεις ταυτοποιήθηκαν με τρόπο -SEM (n=6) από το CD και το επεξεργασμένο προϊόν του (Πίνακας 2), συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων (PhGs), ιριδοειδή, λιγνάνες και ολιγοσακχαρίτες. Τα 95, 91 και 94 στοιχεία ανιχνεύθηκαν σε CD, CD-NP και CD-HP αντίστοιχα. Μεταξύ αυτών, 64 ήταν φαινυλαιθανοειδή, 13 ήταν ιριδοειδή και προσδιορίστηκαν 20 άλλα είδη ενώσεων. Υπήρχε ομοιότητα στη χημική σύνθεση του CD και του επεξεργασμένου προϊόντος του, ωστόσο, η ποσότητα των συστατικών βρέθηκε να είναι διαφορετική μεταξύ του CD και του επεξεργασμένου προϊόντος του.

Παραλλαγές στα χημικά συστατικά των επεξεργασμένων προϊόντων Το λογισμικό Simca-P 13.0 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του πολυμεταβλητού πίνακα δεδομένων. Πριν από την PCA, όλες οι μεταβλητές είχαν τη μέση τιμή και την κλίμακα Pareto, ακολουθούμενη από τον προσδιορισμό των πιθανών διακριτικών μεταβλητών. Σε μια γραφική παράσταση βαθμολογίας PCA, κάθε σημείο έδειξε ένα μεμονωμένο δείγμα. Τα δείγματα που εμφάνιζαν ομοιότητα στα χημικά τους συστατικά ήταν διασκορπισμένα το ένα δίπλα στο άλλο, ενώ αυτά που παρουσίαζαν διαφοροποιήσεις στα συστατικά τους χωρίστηκαν. Όπως φαίνεται στο PCA (Εικ. 4), η ομάδα CD-HP διαχωρίστηκε από τις ομάδες CD και CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 και Π<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Από το Σχήμα 8, βρήκαμε την ένταση της ακτεοσίδης (54), της κιστανοσίδης C (74), της καμπνεοσίδης Ι (43), της οσμανθουσίδης (75) και της 2'-ακτυλακτεοζίδης (80) που έχουν την ομάδα 4'-Ο-καφεοϋλίου σε το 8-O- -D-γλυκοπυρανοσύλιο μέρος (βλ. Εικ. 9) μειώθηκε μετά την επεξεργασία με ρύζι-κρασί, ενώ η ένταση της ισοακετοσίδης (60), είναι καστανοσίδη (71), ισο-καμπνεοσίδη I (69), ισομαρτυνοσίδη (86) που έχει την ομάδα 6'-Ο-καφεοϋλίου (βλ. Εικ. 9) αυξήθηκε, ειδικά για την ομάδα CD-NP. Αν και ο τουμπουλοσίδης Β (72) έχει μια ομάδα 6'-Ο-καφεοϋλίου, ίδια με την ισοακτεοζίτη, η ένταση μειώθηκε λόγω της 2'-ακετυλομάδας του. Η ένταση της εχινακοσίδης (38) και της κιστανοσίδης Β που έχουν ομάδες χαρακτηριστικού 6'-Ο- -D-γλυκοπυρανοζυλίου αυξήθηκε, αλλά η ένταση της τουμπουλοσίδης Α (55) μειώθηκε επίσης λόγω της 2'-ακετυλικής της ομάδας.

Η ερευνητική μας ομάδα μελέτησε επίσης τη θερμική σταθερότητα του ακτεοζίτη και του ισοακτεοσιδίου και διαπίστωσε ότι η ακτεο-πλευρά ήταν ασταθής στο νερό, τη μεθανόλη και το διάλυμα κρασιού κίτρινου ρυζιού και μπορούσε να μετατραπεί σε ισοακτεοσίδη εν μέρει υπό συνθήκες θέρμανσης. Αλλά η θερμοσταθερότητα του ισοακτεοσιδίου ήταν καλύτερη, ειδικά στο διάλυμα κρασιού κίτρινου ρυζιού. Το Σχήμα 10 έδειξε τις πιθανές αλλαγές των PhGs στο CD κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας:

Αναγνώριση των μεταβολιτών σε αρουραίους Από δεδομένα φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης, το ακριβές μοριακό βάρος και η στοιχειακή σύνθεση για μεταβολίτες και πρωτομοριακές ενώσεις αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν. Καθώς τα ίδια είδη ενώσεων στο TCM έδειξαν ομοιότητα στις μεταβολικές τροποποιήσεις, οι συσχετισμοί των φυτοχημικών συστατικών in vitro μπορούν να επεκταθούν στους μεταβολίτες τους in vivo. Εν τω μεταξύ, με βάση τις συμβατικές οδούς βιομετατροπής, συνήχθη μια λογική αλλαγή του μοριακού βάρους. Τέλος, οι μεταβολίτες αναγνωρίστηκαν αναλύοντας τα φάσματα μάζας MSE των μεταβολιτών και της οδού κατακερματισμού των πρωτο-ενώσεων στο φάσμα μάζας [21, 22]. Σε σύγκριση με το τυφλό δείγμα, τα συστατικά του ταυτοποιήθηκαν in vivo με βάση τις πληροφορίες που παρέχονται από το χρωματογράφημα-φάσμα μάζας, την πιθανότητα μεταβολικής αντίδρασης, τα χαρακτηριστικά της δομής της ένωσης και τον κανόνα κατακερματισμού του φάσματος μάζας της. Δείτε τον Πίνακα 3.

Ταυτοποίηση μεταβολιτών που σχετίζονται με γλυκοσίδες φαινυλαιθανόλης

Η πλατφόρμα UNIFI χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία. Το Σχήμα 11 έδειξε τον χρωματογράφο TIC ούρων, κοπράνων και πλάσματος για το CD και τα επεξεργασμένα προϊόντα του. Σε σύγκριση με τυφλά δείγματα, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 54 μεταβολίτες σε αρουραίους, συμπεριλαμβανομένων 10 πρωτότυπων συστατικών και 44 μεταβολιτών, στους οποίους 24, 49 και 6 ήταν σε κόπρανα, ούρα και πλάσμα, αντίστοιχα.

Με βάση την ακριβή μάζα, τον καταρράκτη κατακερματισμού και τις προβλέψιμες ουδέτερες απώλειες από βιομετασχηματισμό, αξιολογήθηκαν δοκιμαστικά συνολικά 35 μεταβολίτες που σχετίζονται με φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες. Οι σχετικοί μεταβολίτες των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών έχουν παρόμοια μοτίβα κατακερματισμού φάσματος μάζας, όπως το τυπικό θραύσμα ντεκαφεοϋλίου m/z 461,1605, στη συνέχεια υδρολύονται περαιτέρω από γλυκοσιδικούς και εστερικούς δεσμούς in vivo και μεταβολίζονται σε υδροξυτυροσόλη (HT) (m/ z153.0504, C.HO.4.73 min) και καφεϊκό οξύ(CA) (m/z179.0389, CH, O0.77 min), βλέπε Σχήμα 12Α.

Το M11 έδειξε [MH]~ at m/ 153.0504 με τύπο π.χ. C.HO, και ταυτοποιήθηκε ως HT. Το Μ16 παρουσίασε [ΜΗ]- σε m/z 329,0851, το οποίο ήταν 176 Da αυξημένο από αυτό της ΗΤ, αποκαλύπτοντας ότι μπορεί να είναι ένας γλυκουρονιδωμένος μεταβολίτης της ΗΤ. Το [ΜΗ]-του Μ26 ήταν σε m/z 343,1037,14 Da υψηλότερο από αυτό του ΗΤ-γλυκουρονιδίου. Επομένως, το Μ26 ταυτοποιήθηκε ως ΗΤ-μεθυλιωμένο γλυκουρονίδιο. Το M17 αναγνωρίστηκε ως θειικό ΗΤ με βάση το [MH]-at m/z 233.0112,80 Da πάνω από το HT, το οποίο θα μπορούσε περαιτέρω να μεθυλιωθεί, στη συνέχεια να παραχθεί M22, το οποίο έδειξε το m/z 247.0278, υποδεικνύοντας ότι ήταν HT- μεθυλιωμένος θειικός μεταβολίτης. Τα Μ7 (m/167,0335) και M5 (m/z 167,0762) θεωρήθηκαν ως προϊόντα οξείδωσης και μεθυλιωμένο ΗΤ, αντίστοιχα (Εικ. 12Β).

Το Μ1 έδειξε [ΜΗ]- σε m/z 179,0389, ο διευκρινισμένος μοριακός τύπος ήταν CH-O και ταυτοποιήθηκε ως καφεϊκό οξύ (CA). Το Μ25 αποκάλυψε [ΜΗ]- σε m/355,0704, που ήταν 176 Da αυξημένα από αυτό του CA, δείχνει ότι μπορεί να είναι ένας γλυκουρονιδωμένος μεταβολίτης της CA. Το M27 είχε m/z 258.994, το οποίο ήταν 80 Da υψηλότερο από αυτό του CA, επομένως το διασαφηνίσαμε ως θειικό CA και μπορούσε να παράγει M35 (m/z 273.0064). Καθώς το Μ4 δίνει το [MH]7 σε m/z 193,0524,14 Da υψηλότερο από το CA, ταυτοποιήθηκε ως μεθυλιωμένος μεταβολίτης CA. Το M39 ήταν μεταβολίτης αφυδροξυλίωσης CA, με m/z 163,04 και μπορούσε να θειωθεί σε M32 (m/z 242,9951).

Το M33(m/z 181.0491, C.HO, 9,06 λεπτά) ήταν το προϊόν αναγωγής του CA, δηλαδή 3,4-διυδροξυ-βενζολοπροπιονικό οξύ, το οποίο μπορούσε να μεθυλιωθεί σε M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). Το M33 θα μπορούσε να αφυδατωθεί σε M43, δηλαδή 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 λεπτά) και M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 λεπτά) και M29 (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 λεπτά) 8,52 λεπτά) ήταν τα γλυκουρονιωμένα και θειωμένα προϊόντα (Εικ. 12C).

Για τους μεταβολίτες που σχετίζονται με φαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδες, οι βασικοί μεταβολικοί καταρράκτες ήταν οι μεταβολικές αντιδράσεις φάσης ΙΙ, δηλαδή η γλυκουρονίωση, η μεθυλίωση και η θείωση. Οι προτεινόμενοι μεταβολικοί καταρράκτες φαινυλαιθανοειδών απεικονίζονται στο Σχ. 13.

Προσδιορισμός μεταβολιτών που σχετίζονται με ιριδοειδή

Αναλύοντας τη στοιχειακή σύνθεση των μεταβολιτών, τον κατακερματισμό του MSE και τη σχετική βιβλιογραφία, αξιολογήθηκαν δοκιμαστικά συνολικά 19 μεταβολίτες που σχετίζονται με το ιριδοειδή. Οι ιριδοειδείς γλυκοσίδες υδρολύθηκαν με γλυκοσιδικούς δεσμούς για να σχηματίσουν τις αντίστοιχες αγλυκόνες τους. Το m/z 185,117 ήταν για το M8, 162 Da λιγότερο από το ajugol, το οποίο προέκυψε από την απώλεια υπολειμμάτων γλυκόζης.

Το Μ40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 λεπτά) ήταν το απογλυκοσυλιωμένο προϊόν της catalpol. Το M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 λεπτά) ήταν μικρότερο από 30 Da εκείνο του απογλυκοσυλιωμένου μεταβολίτη catalpol και ταυτοποιήθηκε ως απομάκρυνση ενός μορίου μεταβολίτη CH, O. Το Μ34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 λεπτά), ήταν περαιτέρω απώλεια του μεταβολίτη Η, Ο.

Το M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 λεπτά) ήταν ένας απογλυκοσυλιωμένος μεταβολίτης του geniposide και το M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) ήταν απογλυκοζυλίωση του 8-επιδεοξυλογανικού οξέος. Οι μεταβολικές αντιδράσεις για τα ιριδοειδή θα μπορούσαν να αποκαλυφθούν ως μεταβολισμός φάσης Ι της απογλυκοζυλίωσης (Εικ. 12D).

Σύγκριση του μεταβολικού προφίλ στο πλάσμα, τα ούρα και τα κόπρανα μεταξύ του CD και των επεξεργασμένων προϊόντων του

Συγκρίθηκαν 2 πρωτότυπα στο πλάσμα, 7 στα ούρα και 3 στα κόπρανα. Υπήρχαν 7 πρωτότυπα που απορροφήθηκαν σε CD, 7 πρωτότυπα απορροφήθηκαν σε CD-NP και 8 πρωτότυπα σε CD-HP. Το M21 ανιχνεύθηκε μόνο στην ομάδα κοπράνων του CD-NP και τα M38 και M51 ανιχνεύθηκαν μόνο σε ομάδες ούρων του CD-HP. Σε σύγκριση με τους μεταβολίτες, οι ίδιοι μεταβολίτες στο πλάσμα, τα ούρα και τα κόπρανα ήταν 4, 42 και 21, αντίστοιχα. Υπήρχαν 34 μεταβολίτες που απορροφήθηκαν στην ομάδα CD, 39 στην CD-NP και 40 στην ομάδα CD-HP. Τα M5, M7, M40 και M52 ανιχνεύθηκαν μόνο σε ομάδες CD-NP, ενώ τα M24, M4l και M48 μόλις ανιχνεύθηκαν σε ομάδες CD-HP.

Παρατηρήθηκαν διακυμάνσεις στην απορρόφηση καθώς και στον μεταβολισμό των δραστικών ενώσεων σε διάφορα επεξεργασμένα προϊόντα CD. Από το Σχήμα 14, βρήκαμε ότι η ένταση της σύζευξης HT-θειικού (M17) ήταν η υψηλότερη στα ούρα, ακολουθούμενη από 3-σύζευξη θειικού HPP (M29), σύζευξη μεθυλιωμένου θειικού HT (M22), αφυδροξυλιωμένο θειικό CA σύζευξη (Μ32) και 3,4-σύζευξη θειικού διυδροξυβενζολοπροπιονικού οξέος (Μ19). Η περιεκτικότητα σε μεταβολικά προϊόντα στην επεξεργασμένη ομάδα ήταν υψηλότερη από την ομάδα CD, ειδικά για τα M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Η πρόδρομη ομάδα τους 6'-Ο-καφεοϋλίου στο τμήμα 8-Ο{- -D-γλυκοπυρανοσυλίου, οι ενώσεις, όπως η υδροξυτυροσόλη, έχουν αντικαρκινικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιβακτηριακές, αντιικές και αντιμυκητιακές ιδιότητες [ 23]. Το καφεϊκό οξύ έχει αντιφλεγμονώδη, αντικαρκινική και αντιική δράση [24]. Ήταν συνεπής με την κλινική χρήση του CD και των επεξεργασμένων προϊόντων του.

Συζήτηση

Το CD είναι ένα TCM και τα κύρια βιοενεργά συστατικά του, συμπεριλαμβανομένων των PhG, των ιριδοειδή, των πολυσακχαριτών έχουν τεκμηριωθεί από διάφορες ερευνητικές μελέτες. Στην κλινική πρακτική της TCM, τα επεξεργασμένα προϊόντα του CD έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε σχέση με τα ακατέργαστα. Η χημική σύνθεση θα αλλάξει κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στα φαρμακευτικά αποτελέσματα (Εικ. 14).

Τα PhGs είναι ένας τύπος φαινολικής ένωσης που χαρακτηρίζεται από μια δομή -γλυκοπυρανοσίδη που φέρει ένα τμήμα υδροξυ-φαινυλαιθυλίου ως αγλυκόνη. Αυτές οι ενώσεις συχνά περιλαμβάνουν καφεϊκό οξύ και ραμνόζη συνδεδεμένα με το υπόλειμμα γλυκόζης μέσω εστερικών ή γλυκοσιδικών δεσμών αντίστοιχα. Στην παρούσα μελέτη, οι ποιοτικές αναλύσεις των CD, CD-NP. και CD-HP πραγματοποιήθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 97 ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων (PhGs), ιριδοειδή, κ.λπ. Τα ληφθέντα αποτελέσματα έδειξαν διακυμάνσεις στη χημική σύνθεση πριν και μετά την επεξεργασία. Η ένταση των PhGs που έχουν την ομάδα 4'-O-καφεοϋλίου στο τμήμα 8-Ο{- -D-γλυκοπυρανοσυλίου, όπως η ακτεοσίδη, η κιστανοσίδη C, η καμπνεοσίδη II, η πλευρά του οσμανθού μειώθηκε μετά την επεξεργασία, ενώ τα PhGs με

όπως ισοακετοσίδη, ισοστανοσίδη, ισοκαμπνεοσίδη Ι, ισομαρτυνοσίδη αυξήθηκε, ιδιαίτερα στην ομάδα CD-NP. Αυξήθηκε επίσης η ένταση του εχινακοσίδη και του κιστανοζίτη Β των οποίων η δομή έχει 6'-Ο- -D-γλυκοπυρανοσύλιο. Τα PhG που έχουν μια 2'-ακετυλομάδα συχνά μειώθηκαν λόγω της αντίδρασης υδρόλυσης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, όπως το τουμπουλοσίδη Β, 2-ακετυλολακτεοσίδη.

Διεξήχθη διερεύνηση των μεταβολιτών που απορροφήθηκαν in vivo μετά την από του στόματος χορήγηση του CD και των επεξεργασμένων προϊόντων του. Οι μεταβολικές διεργασίες της φάσης II ήταν οι βασικοί καταρράκτες και οι περισσότεροι από τους μεταβολίτες ήταν θειικά, γλυκουρονίδια και μεθυλιωμένα συζυγή. Οι γλυκοσίδες φαινυλαιθανόλης έχουν χαμηλή απορρόφηση και χρήση από το στόμα. Είναι δύσκολο να απορροφηθούν στο αίμα και λειτουργούν ως πρόγονοι για να παίξουν τους ρόλους τους μετά τη μεταβολική ενεργοποίηση in vivo. Τα φαινυλαιθανοειδή που παράγονται σε φαινυλαιθα-νολαγλυκόνη, όπως η υδροξυτυροσόλη (HT) και το καφεϊκό οξύ (CA) και το παράγωγό του 3-υδροξυφαινυλοπροπιονικό οξύ (3-HPP), αυτοί οι μεταβολίτες μπορεί να απορροφηθούν πιο εύκολα στο πλάσμα και να έχουν καλύτερο φαρμακευτικό αποτέλεσμα.

CD και τα μεταποιημένα προϊόντα του. Η σύζευξη θειικού HT (M17) έχει την υψηλότερη ένταση στα ούρα, ακολουθούμενη από 3-σύζευξη θειικού HPP (M29), σύζευξη μεθυλιωμένου θειικού HT (M22), σύζευξη αφυδροξυλιωμένης θειικής CA (M32) και 3,{{{ 7}}σύζευξη θειικού διυδροξυ βενζολοπροπιονικού οξέος (Μ19). Η περιεκτικότητα σε μεταβολικά προϊόντα στην επεξεργασμένη ομάδα ήταν υψηλότερη από την ομάδα CD, ειδικά για τα M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Γενικά, τα συστατικά που έχουν υψηλή έκθεση στα όργανα-στόχους θα μπορούσαν να είναι αποτελεσματικά. Μια επαρκής ποσότητα φαινυλαιθανοειδών και των παραγώγων τους έχει αξιολογηθεί και προσδιοριστεί in vitro. Η ακτεοσίδη είναι η χαρακτηριστική ένωση, της οποίας η περιεκτικότητα μειώθηκε μετά την επεξεργασία με ρύζι-κρασί, και αντίστοιχα αυξήθηκε η περιεκτικότητα σε ισοακτεοσίδη, ισοστανοσίδη C, ισοκαμπνεοσίδη Ι. Τα προϊόντα αποικοδόμησης των PhGs, όπως τα παράγωγα CA και HT, θα μπορούσαν να αξιολογηθούν στα βιολογικά δείγματα και η επεξεργασία ρυζιού-κρασί μπορεί να ενισχύσει την απορρόφηση των μεταβολιτών in vivo.

συμπέρασμα

Σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύθηκαν 97 ενώσεις στα εκχυλίσματα του CD και του επεξεργασμένου προϊόντος του. Η αποικοδόμηση μερικών γλυκοσιδών συνέβη σε αυξημένη θερμοκρασία και ως αποτέλεσμα, συντέθηκαν μερικά νέα ισομερή και σύμπλοκα. Σε in vivo μελέτη, τα πρωτότυπα συστατικά (10) και οι μεταβολίτες (44) προσδιορίστηκαν ή αξιολογήθηκαν δοκιμαστικά σε πλάσμα, κόπρανα και ούρα αρουραίου. Οι μεταβολικές διεργασίες φάσης ΙΙ ήταν οι βασικοί καταρράκτες, οι περισσότεροι από τους μεταβολίτες συσχετίστηκαν με εχινακοσίδη ή ακτεοσίδη, όπως HT, CA και τα παράγωγά τους 3-υδροξυφαινυλοπροπιονικό οξύ 3-HPP. Αυτοί οι μεταβολίτες μπορεί να απορροφηθούν ευκολότερα στο πλάσμα και να έχουν καλύτερη φαρμακευτική δράση. Τα ληφθέντα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χημική σύνθεση του CD ήταν διαφορετική και επηρέασε τη διάθεση της ένωσης in vitro και in vivo.

Συντομογραφίες

PhGs: Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες. CD: Cistanche deserticola; CMM: Κινεζική Materia Medica; TCM: Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική. CD-NP: Gistanche deserticola Επεξεργάζεται στον ατμό με ρύζι-κρασί υπό κανονική πίεση. CD-HP: Cistanche deserticola Επεξεργάζεται στον ατμό με ρύζι-κρασί υπό υψηλή πίεση. UPLC-Q-TOF-MS: Υγρή χρωματογραφία εξαιρετικά υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με TOF-MS. PCA: Ανάλυση κύριου συστατικού. VIP: Μεταβλητή σημασία για την προβολή; CA: Καφεϊκό οξύ. ΗΑ: Υδροξυτυροσόλη.

Ευχαριστίες

Δεν εφαρμόζεται.

Συνεισφορές συγγραφέων

Οι LZ, LBN, SJ συμμετείχαν στη σύνταξη, γράφοντας το χειρόγραφο. Οι RJ, LPP βοήθησαν με τα πειράματα σε ζώα και συνέταξαν και οριστικοποίησαν όλα τα σχήματα και τους πίνακες. ZC, HY. Η ITZ βοήθησε στο σχεδιασμό και την εκτέλεση αυτής της μελέτης και εξέτασε το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αριθμός επιχορήγησης:81874345) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Λιαονίνγκ (Αριθμός επιχορήγησης: 2020-MS-223).

Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών

Τα σύνολα δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν ή/και αναλύθηκαν κατά την τρέχουσα μελέτη είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν εύλογου αιτήματος.

Δηλώσεις

Έγκριση δεοντολογίας και συναίνεση συμμετοχής

Η ηθική έγκριση για τη χρήση πειραματόζωων για αυτήν τη μελέτη είχε ληφθεί από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής Liaoning (Αριθμός έγκρισης: 2018YS(DW)-044-01), Όλες οι πειραματικές διαδικασίες σε αυτήν τη μελέτη ήταν σύμφωνα με τα ηθικά πρότυπα του την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής Liaoning.

Συγκατάθεση για δημοσίευση

Δεν εφαρμόζεται.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων να αποκαλύψουν.

Στοιχεία συγγραφέα

«Φαρμακευτικό Τμήμα, Πανεπιστήμιο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής Liaoning, Dalian, Liaoning, Κίνα.» Ινστιτούτο Έρευνας Φαρμάκων της Monos Group, Ulaanbaatar 14250, Μογγολία.

Λήψη: 31 Μαΐου 2021 Αποδοχή: 17 Σεπτεμβρίου 2021 Δημοσίευση διαδικτυακά: 28 Σεπτεμβρίου 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 και Tianzhu Jia1

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Επιτροπή Κινεζικής Φαρμακοποιίας. Pharmacopeia of The People's Republic of China, τομ. Ι. Πεκίνο: China Medical Science Press; 2020. Σελ. 140.
2. Li Z, Lin Η, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): ένα από τα καλύτερα φαρμακευτικά δώρα της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής. Front Pharmacol. 2016; 7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Επιδράσεις διαφορετικών μεθόδων επεξεργασίας ξήρανσης για το φρέσκο ​​Cistanche deserticola στο περιεχόμενο των συστατικών του. J Chin Med Mater. 2020; 10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Βελτιστοποίηση της διαδικασίας ατμού υψηλής πίεσης για Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019; 11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Effects of Cistanches herba πριν και μετά την επεξεργασία στην αντιγηραντική λειτουργία και την ανοσολογική λειτουργία των γηρατεμένων αρουραίων που προκαλούνται από D-γαλακτόζη. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Μελέτη για καθαρτικά συστατικά στο Cistanche deserticola YMCA. Modern Chin Med. 2015; 17 (4): 307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Μελέτη σχετικά με τη νευροενδοκρινο-άνοση λειτουργία του Cistanche deserticola και των προϊόντων του στον ατμό με κρασί από ρύζι στο μοντέλο αρουραίου που προκαλείται από γλυκοκορτικοειδή. Evid Based Complement Alternat Med. 2020; 22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Ενίσχυση της αναζωογονητικής λειτουργίας των νεφρών στο μοντέλο ποντικιού από το Cistanches herba που στέγνωσε γρήγορα σε μέτρια-υψηλή θερμοκρασία. J Med Food. 2019; 22 (12): 1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": μια κριτική. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Μια επισκόπηση της χημείας, της φαρμακολογίας και της φαρμακοκινητικής του ιδιότητας. J Ethnopharmacol col. 2018; 219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): μια ανασκόπηση της φυτοχημείας και της φαρμακολογίας του. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Νευροπροστατευτικές επιδράσεις της εχινακοσίδης στο μοντέλο MPTP ποντικού της νόσου του Πάρκινσον. Eur J Pharmacol. 2007; 564:66-74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Προστατευτική επίδραση του tubuloside B στην απόπτωση που προκαλείται από TNF άλφα σε νευρωνικά κύτταρα. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Αντιφλεγμονώδη ιριδοειδή από τους μίσχους του Cistanche deserticola που καλλιεργήθηκαν στην έρημο Tarim. Chin J Nat Med. 2016; 14 (1): 61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες με αντιφλεγμονώδεις δράσεις από τους μίσχους Cistanche deserticola που καλλιεργήθηκαν στην έρημο Tarim. Φυτοθεραπεία. 2013; 89:167–74.
16. Morikawa Τ, Pan Υ, Ninomiya Κ, Imura Κ, Yuan D, Yoshikawa Μ, Hayakawa Τ, Muraoka Ο. Ιριδοειδείς και ακυκλικοί μονοτερπενικοί γλυκοσίδες, κανκανοσίδες L, Μ, Ν, Ο, και Ρ από Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Μια νέα στρατηγική για την ταχεία διερεύνηση πιθανών χημικών δεικτών για τη διάκριση μεταξύ ακατέργαστου και επεξεργασμένου Radix Rehmanniae από το UHPLC-TOF-MS με πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση. J Pharm Biomed Anal. 2010; 51 (4): 812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Αλλαγές στα επίπεδα των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων, αντιοξειδωτική δράση και άλλα ποιοτικά χαρακτηριστικά σε φέτες Cistanche deserticola με επεξεργασία με ατμό. Chem Pharm Bull. 2016; 64:1024–30.
19. Μα ΖΓ, Ταν ΥΧ. Περιέχει αλλαγές σε έξι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες υπό το χρόνο ατμού με κρασί στο Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011; 33 (11): 1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Επίδραση της διαδικασίας στον ατμό στην ποιότητα του cistanche deserticola μετά τη συγκομιδή για ιατρική χρήση κατά την ξήρανση στον ήλιο. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Μεταβολίτες διαιτητικού ακτεοσιδίου: προφίλ, απομόνωση, ταυτοποίηση και ηπατοπροστατευτικές ικανότητες. J Agric Food Chem. 2018; 66 (11): 2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Συστηματικός χαρακτηρισμός των μεταβολιτών της εχινακοσίδης και της ακτεοσίδης από το Cistanche tubulosa σε πλάσμα, χολή, ούρα και κόπρανα αρουραίου με βάση το UPLC-ESI-Q-TOF -ΚΥΡΙΑ. Biomed Chromatogr. 2016; 30 (9): 1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: μια φυσική ένωση με πολλά υποσχόμενες φαρμακολογικές δραστηριότητες. J Biotechnol. 2020; 309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, ένα ευέλικτο pharmaco phore: μια επισκόπηση. Mini Rev Med Chem. 2011; 11(8):695–713.

Σημείωση εκδότη

Το Springer Nature παραμένει ουδέτερο όσον αφορά τις διεκδικήσεις δικαιοδοσίας σε δημοσιευμένους χάρτες και θεσμικές σχέσεις.