Χαρακτηρισμός Δεκαεπτά Συστατικών σε Καλλιεργημένα Κιστάνα Herba From The Tarim Desert μέσω HPLC-MS

[Περίληψη]Στόχος: Η αναγνώριση των χρωματογραφικών συστατικών του εκχυλίσματος μεθανόλης 60% σεCistanches deserticola Herbaκαλλιεργείται στην έρημο Tarim με HPLC-MS.

Μέθοδος: Η ανάλυση HPLC-MS πραγματοποιήθηκε σε στήλη Agilent ZOＲBAX Eclipse Plus C18 (6 mm × 250 mm, 5 μm). Η κινητή φάση ήταν υδατικό διάλυμα ακετονιτριλίου-0. 1% μυρμηκικού οξέος με βαθμιδωτή έκλουση με ρυθμό ροής 1 mL· min-1, και το μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν 254 nm. Η θερμοκρασία της στήλης ορίστηκε στους 25 βαθμούς και ο όγκος έγχυσης ήταν 10 μL. Αποτέλεσμα: Δεκαέξι χρωματογραφικές κορυφές / δεκαεπτά συστατικά ταυτοποιήθηκαν με ακρίβεια συγκρίνοντας τον χρόνο κατακράτησης, το μοριακό βάρος και τα ιόντα θραυσμάτων των ενώσεων που απομονώσαμε και αναγνωρίσαμε. Αυτά τα χρωματογραφικά συστατικά προσδιορίστηκαν ως κωνοφόρα, δεμεθυλ συριγκίνη, συριγίνη, εχινακοσίδη, κιστανοζίτη Α, βερμπασκοσίδη (τουμπουλοσίδη Α), κιστανοζίτη Β, ισοβερβασκοσίδη, 2'-ακετυλοκιστανοσίδη Α, κιστανοσίδη C, ισοκυστανοσίδη C, 2'-ακετυλοπιστανοσιδη Α, 2'-ακετυλοπιστανοσιδηνοσίδη Κ, και κιστανοσίδη J.

Σύναψη: Η μέθοδος HPLC-MS είναι κατάλληλη για την ταυτοποίηση των χρωματογραφικών συστατικών του εκχυλίσματος μεθανόλης 60% στο Cistanches Herba. Αυτή η μελέτη θα παρέχει τα επιστημονικά στοιχεία για την ολοκληρωμένη ανάλυση των χημικών συστατικών αυτού του φαρμακευτικού βοτάνου.

［Λέξεις-κλειδιά. Cistanches deserticolaHerba; Cistanche; HPLC-MS; εκχύλισμα μεθανόλης

Cistanche deserticola YCMa

Cistanche deserticola, επίσης γνωστό ως "τζίνσενγκ της ερήμου",είναι ένα διάσημο τονωτικό κινέζικο φάρμακο, το οποίο διανέμεται στην Εσωτερική Μογγολία, τη Ningxia, το Gansu και το Xinjiang της Κίνας [1].Έχει το αποτέλεσμα να τονώνει τα νεφρά-γιανγκ, να ωφελεί την ουσία του αίματος, να υγραίνει τα έντερα και να αφοδεύει. Χρησιμοποιείται συνήθως σε κλινικές για τη θεραπεία της ανδρικής ανικανότητας, της γυναικείας υπογονιμότητας, του κρύου πόνου στη μέση και στο γόνατο, τη δυσκοιλιότητα με στάση αίματος, κλπ. [2-3].Cistanche deserticola, που είναιπου περιλαμβάνεται στο πρώτο μέρος της Κινεζικής Φαρμακοποιίας (έκδοση 2015), είναι ο αποξηραμένος σαρκώδης μίσχος του Cistanche deserticola και του Cistanche tubulosa (4). Η ερευνητική μας ομάδα έχει πραγματοποιήσει συστηματική και σε βάθος έρευνα για τα φυτά Cistanche για πολλά χρόνια.Τα χημικά συστατικά των φυτών Cistanche είναι κυρίως φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, εκτός από τα ιριδοειδή και τα γλυκοσίδια τους, οι λιγνάνες και οι γλυκοσίδες τους, οι γλυκοσίδες της βενζυλικής αλκοόλης κ.λπ.[5]. Οι σύγχρονες φαρμακολογικές μελέτες δείχνουν ότι οι γλυκοσίδες φαινυλαιθανόλης, τα κύρια συστατικά του γένους, έχουν νευροπροστατευτικά, αντιοξειδωτικά, ηπατική προστασία, αντιβακτηριδιακή, αντιική, αντικαρκινική, αντιφλεγμονώδη και άλλα αποτελέσματα [6-11].

Τζίνσενγκ της ερήμου

Στην Κίνα, το Cistanche deserticola διανέμεται στη δυτική Εσωτερική Μογγολία, στη βόρεια Xinjiang και στη λεκάνη Qaidam στο Qinghai, αλλά όχι στη λεκάνη Tarim στο νότιο Xinjiang. Στα τέλη της δεκαετίας του 1990, για να προστατεύσει το πετρελαιοφόρο Tazhong και να ελέγξει την έρημο, τα κεντρικά πεδία πετρελαίου εισήγαγαν μεγάλο αριθμό αμμόδενδρων Haloxylon γύρω από το πετρελαιοφόρο Tazhong και στις δύο πλευρές του αυτοκινητόδρομου της ερήμου και εμβολιάσαμε το Haloxylon ammodendron με cistanche, που έχει περάσει πάνω από 10 χρόνια. Λόγω του θερμού κλίματος στη Νότια Σιντζιάνγκ και των καλών συνθηκών άρδευσης με σταγόνες στη βάση του πετρελαίου, η απόδοση του cistanche deserticola είναι πολύ υψηλή και η απόδοση φρέσκου cistanche deserticola ανά mu φθάνει πάνω από 500 kg [8]. Πολλά χημικά συστατικά στο Cistanche deserticola έχουν παραγάγει μεγάλο αριθμό ισομερών λόγω των διαφορετικών θέσεων σύνδεσης των υποκαταστατών. Αυτό φέρνει μεγάλες δυσκολίες στην αναγνώριση της χρωματογραφικής κορυφής αυτού του φαρμακευτικού υλικού. Είναι δύσκολο να προσδιοριστούν με ακρίβεια τα συστατικά της χρωματογραφικής κορυφής εάν βασίζονται μόνο σε LC-MS χωρίς μονομερείς ενώσεις ως έλεγχος. Ως εκ τούτου, υπάρχουν ελάχιστες βιβλιογραφικές αναφορές για αυτήν την εργασία στο αρχικό στάδιο. Ο συγγραφέας απομόνωσε πολλές μονομερείς ενώσεις [9-11] από το Cistanche deserticola που καλλιεργήθηκε στην έρημο Tazhong στο αρχικό στάδιο. Μέσω αυτών των μονομερών ενώσεων που ελήφθησαν στο πρώιμο στάδιο, αναγνωρίστηκαν με ακρίβεια οι μερικές χρωματογραφικές κορυφές HPLC του εκχυλίσματος μεθανόλης 60% του Cistanche deserticola. Αυτό όχι μόνο θα αποφύγει την επαναλαμβανόμενη ταυτοποίηση ορισμένων γνωστών ενώσεων στα χημικά συστατικά του Cistanche deserticola, αλλά θα παρέχει επίσης κάποια αναφορά για περαιτέρω έρευνα σχετικά με τον ποιοτικό έλεγχο του φαρμακευτικού υλικού. Σε αυτό το έγγραφο, 17 συστατικά του 6 του 0% μεθανολικού εκχυλίσματος του Cistanche deserticola ταυτοποιήθηκαν με HPLC-MS.

Φέτα Cistanche deserticola

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche

【Ζητήστε περισσότερα】 Email: xue122522@foxmail.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.Υλικό

Όργανο πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού Inova-500 (Varian, ΗΠΑ). Φασματόμετρο μάζας 6320IonTrap LC-MS, στήλη EclipseXDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μ m) (Agilent, ΗΠΑ); QUINTIX313-1CN τύπου 1/10000 ηλεκτρονικό ισοζύγιο (τμήμα Sedaris); KQ-500DV καθαριστικό υπερήχων (Jiangsu Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); KMUP - Ⅰ Trace Analytical Ultra Pure Generation System (Chengdu Haochun Instrument Equipment Co., Ltd.).

Οι 39 ουσίες ελέγχου που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα απομονώθηκαν όλες από το Cistanche deserticola που καλλιεργήθηκε στην έρημο στο Tazhong από τον συγγραφέα στο πρώιμο στάδιο και οι δομές τους προσδιορίστηκαν με NMR και άλλες τεχνικές φασματοσκοπίας. Οι δομές 39 δειγμάτων ελέγχου ταυτοποιήθηκαν ως Cistanche deserticoside J, Cistanche deserticoside K, Cistanche deserticoside L, Cistanche deserticoside M, Cistanche deserticoside N, epimeridinosideA, Isocistancheside C, angiocyanin B, Cistanche deserticoside, Cistanche heterocorophyllinistanche, deserticoside C, Cistanche cymosin, 2 '- ακετυλο Cistanche deserticoside A, 2' - ακετυλο Cistanche deserticoside A, Cistanche deserticola B, Cistanche deserticola A, Echinoside A, Cistanche deserticola γλυκοσίδιο E, Salidroside, 6 saldroli deserticola syside, ιουνιπερίνη, (2Ε, 6Ε) - 3, 7-διμεθυλ-8-υδροξυκταδιεν-1-Ο- - D-γλυκοζίτη, (+) - συριγίνη, (+) - συριγκιν-4'- Ο- - ϋ-γλυκοπυρανοσίδη, (+) -ισοευυκομίνη, μονοαιθυλο-αμίνη, αιθέρας- - D-γλυκοζίτης, προνυμφοκτόνος-4 '- O- - D-γλυκοζίτης, προνυμφοκτόνος-4-Ο- - D-γλυκοζίτης- - D γλυκοπυρανοσίδης, εσπεριδίνη Α, περιοχή κατά μέρος Α, 6-δεοξυκαταπόλη. Η καθαρότητα όλων των παραπάνω ουσιών αναφοράς είναι μεγαλύτερη από 98,0%. Το ακετονιτρίλιο είναι χρωματογραφικά καθαρό (DikmaPure, ΗΠΑ), το νερό είναι υπερκαθαρό νερό και άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στη διαδικασία δοκιμής είναι καθαρά αναλυτικά αντιδραστήρια, που παράγονται από την Beijing Chemical Plant.

Το φαρμακευτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα, το Cistanche deserticola, συλλέχτηκε από την έρημο περιοχή Tazhong, Xinjiang, τον Νοέμβριο του 2010. Αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Tu Pengfei της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Πεκίνου ως το αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος του φυτού Leobaceae Cistanche deserticola. Το δείγμα αποθηκεύτηκε στο Σύγχρονο Ερευνητικό Κέντρο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής του Πανεπιστημίου του Πεκίνου (αριθμός δείγματος: CD201011).

Φέτα Cistanche deserticola

2.Μέθοδοι και αποτελέσματα

2.1 Παρασκευή διαλύματος αναφοράς

Πάρτε περίπου 1 mg από κάθε ένα από τα 39 δείγματα ελέγχου που λήφθηκαν από το Cistanche deserticola στο αρχικό στάδιο, ζυγίστε τα με ακρίβεια, βάλτε τα σε ογκομετρική φιάλη 5 mL αντίστοιχα, διαλύστε τα με μεθανόλη και όγκο στη ζυγαριά και στη συνέχεια λάβετε το ενιαίο διάλυμα ελέγχου.

2.2 Παρασκευή του διαλύματος δοκιμής

Αναφερόμενοι στην Κινεζική Φαρμακοποιία, έκδοση 2015, πάρτε περίπου 1 g σκόνης προϊόντος (μέσα από το τέταρτο κόσκινο), ζυγίστε το με ακρίβεια, βάλτε το σε καφέ μπουκάλι 100 mL, προσθέστε ακριβώς 50 mL μεθανόλης 60%, χτυπήστε το, ανακινήστε το καλά, ζυγίστε τη μάζα, ζυγίστε το εξαιρετικά 30 λεπτά, ζυγίστε το για 40 λεπτά. τη μάζα και πάλι, προσθέστε 50% μεθανόλη για να συμπληρώσετε τη μειωμένη μάζα, ανακινήστε την καλά, αφήστε την, πάρτε το υπερκείμενο και χρησιμοποιήστε διήθηση με μικροπορώδη μεμβράνη 0,45 μ M, πάρτε το συνεχές διήθημα για να λάβετε το διάλυμα δοκιμής.

2.3 Χρωματογραφικές συνθήκες

AgilentEclipse XDB-C18 χρωματογραφική στήλη (4,6 mm × 250 mm, 5 μ m), μήκος κύματος ανίχνευσης 254 nm, θερμοκρασία στήλης 25 μοίρες ; Χρησιμοποιώντας ακετονιτρίλιο (Α) - 0.1% υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος (Β) ως κινητή φάση, έκλουση βαθμίδωσης (0 - 20min, 5% - 15% A; 20 - 50min, 15% - 30% A; 50 - 60min, 30% - 50%}- 50min, 30% - 50% A; Α); Ρυθμός ροής: 1,0 mL · min-1, όγκος έγχυσης: 10 μ L.

2.4 Συνθήκες φάσματος μάζας

Τριχοειδής θερμοκρασία 350 μοίρες ; Τριχοειδής τάση 3500V; Ρυθμός ροής αερίου χιτώνιο (άζωτο) 12,0L · min-1; Πίεση βοηθητικού αερίου (άζωτο) 206,8 kPa; Το πλήρες εύρος σάρωσης της φασματομετρίας μάζας είναι m/z 50~1000. Αέριο σύγκρουσης ήλιο, η ενέργεια σύγκρουσης επιλέγεται αυτόματα κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Συλλέξτε 1 βελόνα για κάθε λειτουργία θετικού και αρνητικού ιόντος.

2.5 Δοκιμή ουσίας αναφοράς

Τα 39 διαλύματα αναφοράς που παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το 2.1 δοκιμάστηκαν υπό 2.3 χρωματογραφικές συνθήκες και 2.4 φασματομετρικές συνθήκες μάζας και καταγράφηκαν ο χρόνος κατακράτησης και το σχετικό μοριακό τους βάρος (Πίνακας 1).

2.6 Προσδιορισμός του διαλύματος δοκιμής

Πάρτε το φαρμακευτικό υλικό Cistanche deserticola που συλλέχθηκε από την έρημο περιοχή Tazhong, Xinjiang, και παρασκευάστε το διάλυμα δοκιμής σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στο 2.2. Στη συνέχεια, εκτελέστε τον προσδιορισμό σύμφωνα με τις χρωματογραφικές συνθήκες που περιγράφονται στο 2.3 και τις συνθήκες φασματομετρίας μάζας που περιγράφονται στο 2.4, και προσδιορίστε το χρωματογράφημα HPLC και τη φασματομετρία μάζας στη λειτουργία θετικού και αρνητικού ιόντος (Εικόνες 1-3).

Σύκο. 1 χρωματογράφημα HPLC εκχυλίσματος μεθανόλης 60% του Cistanches Herba

Σύκο. 2 Θετικό χρωματογράφημα TIC MS από 60% μεθανολικό εκχύλισμα Cistanches Herba

Σύκο. 3 Αρνητικό TIC χρωματογράφημα MS από 60% μεθανολικό εκχύλισμα Cistanches Herba

2.7 Ταυτοποίηση χρωματογράμματος HPLC φαρμακευτικών υλικών

Υπό τις ίδιες συνθήκες (2,3 χρωματογραφικές συνθήκες και 2,4 συνθήκες φασματομετρίας μάζας), τα συστατικά ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση του χρόνου κατακράτησης και του σχετικού μοριακού βάρους του δείγματος δοκιμής και του δείγματος ελέγχου. Η ειδική διαδικασία αναγνώρισης της κορυφής του χρωματογράμματος του δείγματος δοκιμής (Εικόνα 1) έχει ως εξής.

2.7.1 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 1

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 1 είναι 16,67 λεπτά. Στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος, η κορυφή ιόντων διεγέρτη m/z365 δίνεται ως [M+Na]+, ενώ στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος, δίνεται η κορυφή ιόντων διεγέρτη m/z387 [M+COOH] -. Το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 1 προσδιορίζεται ότι είναι 342. Δίνεται επίσης το ιόν θραύσματος m/z179, το οποίο προέρχεται από την απώλεια 1 μορίου γλυκόζης, 163 D, λόγω της διάσπασης του γλυκοζιτικού δεσμού. Σύμφωνα με τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική κορυφή 1 αναγνωρίστηκε ως κωνοφόρα.

2.7.2 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 2

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 2 είναι 17,36 λεπτά. Κάτω από τον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος, δίνονται οι κορυφές ιόντων διεγέρτη m/z357 [M – H] -, 393 [M+Cl] - και το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 2 προσδιορίζεται σε 358. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z195 προέρχεται από την απώλεια 1 μορίου, λόγω της διάσπασης της γλυκόζης 163, λόγω της διάσπασης της γλυκόζης 163. Η χρωματογραφική κορυφή 2 αναγνωρίστηκε ως απομεθυλσυριγγίνη σύμφωνα με το χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς.

2.7.3 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 3

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 3 είναι 19,04 λεπτά, η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z395 [M+Na] δίνεται στη λειτουργία θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z417 [M+HCOO] - δίνεται στον τρόπο αρνητικού ιόντος και το σχετικό μοριακό βάρος του θραύσματος 3 προσδιορίζεται στον ίδιο χρόνο 37. Το m/z209 προέρχεται από την απώλεια 1 μορίου γλυκόζης, 163 Da, λόγω της θραύσης του γλυκοσιδικού δεσμού. Η χρωματογραφική κορυφή 3 ταυτοποιήθηκε ως συριγκίνη σύμφωνα με τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς.

2.7.4 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 4

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 4 είναι 27,66 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z804 [M+NH4] δίνεται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z785 [M–H] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 4 προσδιορίζεται ότι είναι 786. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z623 προέρχεται από την απώλεια κατά τη διάσπαση του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da. Σε συνδυασμό με τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική κορυφή 4 αναγνωρίστηκε ως εχινάκεια.

2.7.5 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 5

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 5 είναι 31,48 λεπτά, η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z818 [M+NH4 δίνεται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z799 [M–H] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος, και το σχετικό μοριακό βάρος του θραύσματος 80 προσδιορίζεται στο ίδιο χρονικό διάστημα 5. Το m/z637 προέρχεται από την απώλεια εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163Da. Συνδυάζοντας τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, επιβεβαιώθηκε ότι η χρωματογραφική αιχμή 5 ήταν ο γλυκοσίδης Α της κιστάνχης.

Πίνακας 1 Μοριακό βάρος και χρόνος κατακράτησης (tＲ) 39 τυπικών ενώσεων

2.7.6 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 6

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 6 είναι 34,17 λεπτά. Δύο κορυφές ιόντων διεγέρτη m/z846642 [M+NH4] + δίνονται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος και δύο κορυφές ιόντων διεγέρτη m/z827623 [M–H] - δίνονται επίσης στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Εικάζεται ότι η κορυφή 6 μπορεί να περιέχει δύο ενώσεις με σχετικό μοριακό βάρος 828624. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z665461 προέρχεται από την απώλεια διακοπής του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da, και το θραύσμα ιόντος m/z622 προέρχεται από το σπάσιμο βοοειδών. Αυτές οι δύο ενώσεις απομονώθηκαν και συνδυάστηκαν με το χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς. η χρωματογραφική κορυφή 6 ήταν ένα μείγμα Cimicifugarin και ανθοκυανίνης Α.

2.7.7 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 7

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 7 είναι 35,34 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z832 [M+NH4]+, 837 [M+Na]+ δίνεται στη λειτουργία θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z813 [M–H] - δίνεται στη λειτουργία αρνητικού ιόντος και το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 7 είναι 814. Ταυτόχρονα, το θραύσμα e7 προέρχεται από το 3 m/z, απώλεια δεσμού 1 μορίου φερουλικού οξέος, 177Da. Σε συνδυασμό με τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική αιχμή 7 αναγνωρίστηκε ως γλυκοζίτης Β.

2.7.8 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 8

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής αιχμής 8 είναι 36,17 λεπτά, η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z647 [M+Na] δίνεται στη λειτουργία θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z623 [M–H] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος, και το σχετικό μοριακό βάρος του θραύσματος 6 την ίδια στιγμή 8, προσδιορίζεται ως το 8. Δίνεται m/z461, το οποίο προέρχεται από το σπάσιμο του εστερικού δεσμού και την απώλεια 1 μορίου της ομάδας καφεΐνης, 163 Da. Σε συνδυασμό με το χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική κορυφή 8 ταυτοποιήθηκε ως ετεροκοενοσίδη.

2.7.9 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 9

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 9 είναι 38,20 λεπτά. Οι κορυφές ιόντων διεγέρτη m/z860 [M+NH4]+, 865 [M+Na] δίνονται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος και οι κορυφές ιόντων διεγέρτη m/z841 [M–H] -, 877 [M+Cl] - δίνονται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 9 προσδιορίζεται ότι είναι 842. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z679636 προέρχεται από την απώλεια κατά τη διάσπαση του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da, και 1 μορίου ακετυλίου, 43 Da. Ο χρόνος κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς είναι συνεπή και η κορυφή αναγνώρισης 9 είναι ο 2- 2'-ακετυλοκιστάνχης γλυκοσίδης Α.

2.7.10 Αναγνώριση χρωμάτωντογραφικό σελεικ 10

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 10 είναι 39,04 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z656 [M+NH4]+, 661 [M+Na] δίνεται στη λειτουργία θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z637 [M–H] -, 673 [M+Cl] - δίνεται στη λειτουργία αρνητικού ιόντος. Το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 10 προσδιορίζεται ότι είναι 638. Ταυτόχρονα, το ιόν θραύσματος m/z475 προέρχεται από την απώλεια θραύσης εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da. Ο χρόνος κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς είναι συνεπή και η κορυφή αναγνώρισης 10 είναι Cistanche C.

2.7.11 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 11

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 11 είναι 40,82 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z661 [M+Na]+, 677 [M+K+ δίνεται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος, και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z637 [M–H] -, 673 [M+Cl] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Μπορεί να προσδιοριστεί ότι το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 11 είναι 638. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z475 προέρχεται από την απώλεια κατά τη διάσπαση του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da. Συνδυάζοντας το χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική αιχμή 11 αναγνωρίστηκε ως ισοστανική γλυκοσίδη C.

2.7.12 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 12

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 12 είναι 41,48 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z684 [M+NH4]+, 689 [M+Na + δίνεται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z665 [M–H] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Μπορεί να προσδιοριστεί ότι το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 12 είναι 666. Ταυτόχρονα, αποδεικνύεται ότι το θραύσμα ιόντος m/z503460 προέρχεται από την απώλεια θραύσης του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da, και 1 μορίου ακετυλίου, 43 Da. Σύμφωνα με το χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική αιχμή 12 ταυτοποιήθηκε ως α2'-ακετυλυλοκοελιοζίτης.

Πείραμα Cistanche deserticola

2.7.13 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 13

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 13 είναι 44,29 λεπτά, η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z689 [M+Na] δίνεται στη λειτουργία θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z665 [M–H] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος, και το σχετικό μοριακό βάρος του 6 το τμήμα κορυφής είναι 13. Το m/z503460 προέρχεται από την απώλεια διακοπής του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da, και 1 μορίου ακετυλίου, 43 Da. Σε συνδυασμό με τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική κορυφή 13 αναγνωρίστηκε ως ανθοκυανίνη Β.

2.7.14 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 14

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 14 είναι 46,67 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z675 [M+Na] δίνεται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος και η κορυφή ιόντων διεγέρτη m/z651 [M–H] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 14 είναι 652. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z475 προέρχεται από την απώλεια κατά τη διάσπαση του εστερικού δεσμού 1 μορίου της ομάδας φερουλικού οξέος, 177Da. Σε συνδυασμό με το χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική κορυφή 14 αναγνωρίστηκε ως η επιμεριδινοσίδη Α.

2.7.15 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 15

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 15 είναι 49,90 λεπτά. Η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z698 [M+NH4]+, 703 [M+Na + δίνεται στον τρόπο λειτουργίας θετικού ιόντος, και η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z679 [M–H] -, 715 [M+Cl] - δίνεται στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Το σχετικό μοριακό βάρος της κορυφής 15 είναι 680. Ταυτόχρονα, το θραύσμα ιόντος m/z517474 προέρχεται από την απώλεια κατά τη διάσπαση του εστερικού δεσμού 1 μορίου καφεΐνης, 163 Da, και 1 μορίου ακετυλίου, 43 Da. Η χρωματογραφική αιχμή 15 ταυτοποιήθηκε ως γλυκοζίτης της κιστάνχης Κ με βάση τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς.

2.7.16 Αναγνώριση χρωματογραφικής κορυφής 16

Ο χρόνος κατακράτησης της χρωματογραφικής κορυφής 16 είναι 55,36 λεπτά. Στη λειτουργία θετικού ιόντος δίνεται η κορυφή ιόντος διεγέρτη m/z717 [M+N, ενώ στη λειτουργία αρνητικού ιόντος δίνονται οι κορυφές ιόντων διεγέρτη m/z693 [M–H] -, 729 [M+Cl] -, με αποτέλεσμα ένα σχετικό μοριακό βάρος 694 για την κορυφή 16. Την ίδια στιγμή φαίνεται ότι το θραύσμα m41 προέρχεται από το θραύσμα m41. την απώλεια διάσπασης του εστερικού δεσμού 1 μορίου ομάδας φερουλικού οξέος, 177 Da, και 1 μορίου ακετυλ ομάδας, 43 Da. Σε συνδυασμό με τον χρόνο κατακράτησης και το σχετικό μοριακό βάρος της ουσίας αναφοράς, η χρωματογραφική αιχμή 16 ταυτοποιήθηκε ως γλυκοσίδης cistanche J. Οι χρωματογραφικές κορυφές του εκχυλίσματος μεθανόλης 60% του Cistanche deserticola ταυτοποιήθηκαν με HPLC-MS σε συνδυασμό με το σχετικό μοριακό βάρος, το χρόνο κατακράτησης της ξεχωριστής ουσίας και το θραύσμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 17 συστατικά από τις 16 χρωματογραφικές κορυφές ταυτοποιήθηκαν με ακρίβεια (Πίνακας 2).

Πίνακας 2: Προσδιορισμένες χρωματογραφικές κορυφές του Cistanches Herba και πρότυπες ενώσεις αναφοράς

3  . Συζήτηση

3.1 Επιλογή της μεθόδου προετοιμασίας του δοκιμαστικού αντικειμένου

Ο κύριος σκοπός αυτής της μελέτης είναι να αναγνωρίσει τις κορυφές HPLC του Cistanche deserticola. Επομένως, η επιλογή του διαλύτη εκχύλισης και της μεθόδου εκχύλισης βασίζεται στην ικανότητα λήψης περισσότερων κορυφών HPLC. Η ερευνητική ομάδα έχει διεξαγάγει μακροχρόνια έρευνα για το Cistanche deserticola και έχει κάνει πολλή δουλειά στην ποιοτική ανάλυση. Σε αυτή την εργασία, ο διαλύτης εκχύλισης και η μέθοδος εκχύλισης του Cistanche deserticola επιλέχθηκαν επίσης με βάση την προηγούμενη εργασία ανάλυσης της ερευνητικής ομάδας και την Κινεζική Φαρμακοποιία (έκδοση 2015). Τέλος, ως μέθοδος εκχύλισης επιλέχθηκε η εκχύλιση με υπερήχους 60% με διαλύτη μεθανόλης για 40 λεπτά.

3.2 Επιλογή συνθηκών HPLC-MS

Η επιλογή της χρωματογραφικής στήλης σε αυτό το άρθρο βασίζεται στην ποιοτική ανάλυση του Cistanche deserticola στο πρώιμο στάδιο της ερευνητικής ομάδας και στη διερεύνηση του AgilentZORBAXEclipsePlusC18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μ m), του DionexC18 (4,6 mm × 250 mm 250 mm, 5 μ5 μ5 μ8, m) Χρωματογραφική στήλη, τέλος επιλέξτε AgilentZORBAXEclipsePlusC18 χρωματογραφική στήλη (4,6 mm × 250 mm, 5 μ m) Έχει καλή επίδραση διαχωρισμού στο Cistanche deserticola. Οι 39 ουσίες αναφοράς περιλαμβάνουν φαινυλαιθανοειδή, λιγνάνες και φαινυλοπροπανοειδή, επομένως το μήκος κύματος ανίχνευσης είναι 254 nm. Ταυτόχρονα, διερευνήθηκαν τα αποτελέσματα της κινητής φάσης όπως μεθανόλη-νερό, ακετονιτρίλιο-νερό, μεθανόλη-0,1% νερό φωσφορικού οξέος, ακετονιτρίλιο-0,1% νερό μυρμηκικού οξέος στον χρωματογραφικό διαχωρισμό και την ανίχνευση φασματομετρίας μάζας και τελικά επιλέχθηκε το ακετονιτρίλιο-0,1% ως κινητή φάση για το νερό.

3.3 Περίληψη

Η μέθοδος που καθιερώθηκε σε αυτή τη μελέτη εντόπισε με ακρίβεια 17 συστατικά από 16 χρωματογραφικές κορυφές της μεθανόλης 60%.εκχύλισματουCistanche deserticola.

Τα αποτελέσματα της έρευνας όχι μόνο έχουν μια ορισμένη τιμή αναφοράς για την περαιτέρω ποιοτική ανάλυση του φαρμακευτικού υλικού, αλλά μπορούν επίσης να αποφύγουν κάποιες επαναλαμβανόμενες εργασίες για την αναγνώριση της δομής των γνωστών ενώσεων του φαρμακευτικού υλικού. Ωστόσο, γενικά, υπάρχουν σχετικά λίγες ταυτοποιημένες χρωματογραφικές κορυφές και πολλές χρωματογραφικές κορυφές δεν έχουν εντοπιστεί επειδή δεν έχουν αποδοθεί στην ουσία αναφοράς. Τα περισσότερα συστατικά που αναγνωρίζονται είναι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, ενώ οι λιγνάνες είναι σπάνιες. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι η μέθοδος εκχύλισης που αναφέρεται στην έκδοση του 2015 της Κινεζικής Φαρμακοποιίας στοχεύει κυρίως σε φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες ή επειδή η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ενώσεις που μοιάζουν με κολοβακτηρίδια στο εκχύλισμα αυτού του φαρμακευτικού υλικού είναι πολύ υψηλή, γεγονός που καθιστά δύσκολο τον εντοπισμό άλλων ενώσεων με μικρή περιεκτικότητα. Οι συγκεκριμένοι λόγοι πρέπει να διευκρινιστούν περαιτέρω.

[Αναφορές]

[1] Συντακτική Επιτροπή της Flora της Κίνας. Φλώρα της Κίνας [Μ]. Πεκίνο: Science Press, 1990: 86

[2] Γιανγκ Τζουνσάν. Τζίνσενγκ της ερήμου -- Cistanche deserticola [J]. Chinese Journal of Pharmacy,2011,46( 12) : 881.

[3] Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Έρευνα για το Cistanche deserticola και τη βιομηχανική του ανάπτυξη[J]. Chinese Journal of Pharmacy, 2011, 46 (12): 882-887

[4]Εθνική Επιτροπή Φαρμακοποιίας. Φαρμακοποιία της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. Μέρος I [M]Beijing: China Pharmaceutical Science and Technology Press, 2015: 135

[5] JIANG Y, TU PF. Ανάλυση χημικών συστατικών στα είδη Cistanche (J］). J Chromatogr A,2009,1216 ( 11) : 1970-1979.

[6] PAN J, YUAN CS, LIN CJ, κ.ά. Φαρμακολογικές δραστηριότητες και μηχανισμοί φυσικών φαινυλοπροπανοειδών γλυκοσιδών. Pharmazie,2003,58( 11): 767-775.

[7] FU GM, PANG HH, Wong Y. Φυσικά απαντώμενες φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες: πιθανές απαγωγές για νέα θεραπευτικά. Curr Med Chem,2008,15 (25): 2592-2613.

[8] Rhode Mei, Long Mei, Du Wenjing, et al. Ο μηχανισμός της δράσης κατά της οστεοπόρωσης του εκχυλίσματος Cistanche deserticola σε ποντίκια M KOOPG ［ J］. Κινεζικό πείραμα Journal of Prescriptions, 2016, 22 (10): 138-142

[9] Ma Hui, Yin Ruoxi, Guo Min, et al. Επίδραση του πολυσακχαρίτη Cistanche deserticola στην επαγόμενη από D-γαλακτόζη γήρανση. Επίδραση της έκφρασης CREB σε παλιό μοντέλο ποντίκια ［ J］. Κινεζικές Πειραματικές Συνταγές Εφημερίδα, 2014, 20 (20): 137-141

[10] Tao Yicun, Li Jianying, Xu Yonghua, et al. Επιδράσεις της φαινυλαιθανοσίδης του Cistanche deserticola σε αρουραίους: Πρόληψη και θεραπεία πνευμονικού οιδήματος μεγάλου υψομέτρου (J ］). Κινεζική Εφημερίδα Πειραματικών Συνταγών, 2014, 20( 15): 134-138.

[11] Zhou Haitao, Cao Jianmin, Lin Qiang. Cistanche deserticola σχετικά με την εξαντλημένη κολυμβητική ικανότητα των αρουραίων και την αντιοξειδωτική ικανότητα του μυοκαρδίου στο μιτοχόνδριο ［ J ］. Κινεζικός πειραματικός τύπος Journal of Science, 2012, 18 (6): 229-233

[12] NAN ZD, ZHAO MB, ZENG KW, κ.ά. Αντιφλεγμονώδη ιριδοειδή από τους μίσχους του Cistanche deserticola που καλλιεργήθηκαν στην έρημο Tarim. Chin J Nat Med, 2016,14( 1): 61-65.

[13] NAN ZD, ZENG KW, SHI SP, κ.ά. Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες με αντιφλεγμονώδεις δράσεις από τους μίσχους του Cistanche deserticola που καλλιεργήθηκε στην έρημο Tarim ［J］ Fitoterapia,2013,89: 167-174.

[14] Nan Zedong, Zhao Mingbo, Jiang Yong, et al. Χημεία του κιστανιού της ερήμου που καλλιεργείται στο Tazhong: Μελέτη σύνθεσης ［ J ］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2013, 38 (16):2665-2670.

[15] Nan Zedong, Zhao Mingbo, Jiang Yong, et alLignans [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2015, 40 (3):463-468.