Χαρακτηρισμός Καφεοϋλκινικών Οξέων από Lepisorus Thunbergianus και η ανασταλτική τους δράση μελανογένεσης

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* και Kooyeon Lee*

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ:Η υπερμελάγχρωση που προκύπτει από την υπερενεργοποίηση της τυροσινάσης οδηγεί σε πιο σκούρες κηλίδες ή μπαλώματα στο ανθρώπινο δέρμα. Αν και αυτά τα φαινόμενα είναι αβλαβή, εξακολουθεί να υπάρχει μεγάλη ζήτηση για αναστολείς μελανογένεσης για την πρόληψη της υπερμελάγχρωσης αναστέλλοντας την τυροσινάση, ένα ένζυμο που περιορίζει το ρυθμό στη μελανογένεση. Αν και ο Lepisorus thunbergianus έχει χρησιμοποιηθεί στις λαϊκές ιατρικές θεραπείες ως διουρητικός και αιμοστατικός παράγοντας, η επίδρασή του στη μελανογένεση δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, παρασκευάσαμε ένα εκχύλισμα L.thunbergianus και τα κλάσματα διαλυτών του και αξιολογήσαμε τη βιολογική τους δράση ενάντια στη σύνθεση ελεύθερων ριζών και μελανίνης. Το εκχύλισμα του L. thunbergianus ανέστειλε τη δραστηριότητα της τυροσινάσης μανιταριού πιο αποτελεσματικά από και με παρόμοια αντιοξειδωτική δράση με την αρβουτίνη in vitro. Η συγκριτική αξιολόγηση της δραστικότητας κατά της μελανογένεσης και της αντι-τυροσινάσης των κλασμάτων διαλύτη L. thunbergianus έδειξε ότι, με την αναστολή της δραστηριότητας τυροσινάσης, το κλάσμα βουτανόλης έχει το υψηλότερο δυναμικό για την αναστολή των κυττάρων μελανώματος μελανογένεσης. Βρήκαμε με δομική ανάλυση χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και φασματοσκοπία NMR ότι οι κύριες ενώσεις στο κλάσμα βουτανόλης ήταν τρία παράγωγα καφεοϋλκινικού οξέος. Τα τρία παράγωγα είχαν παρόμοιες δραστηριότητες απομάκρυνσης ριζών και αντι-τυροσινάσης in vitro, ενώ μόνο το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ είχε ανασταλτική δράση στην επαγόμενη από -MSH μελανογένεση. Η ανασταλτική δράση του 5-καφεοϋλκινικού οξέος επαληθεύτηκε με τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε μελανίνη και της δραστικότητας τυροσινάσης στο μελάνωμα μετά την επεξεργασία των κυττάρων με μια εμπορική ένωση. Περαιτέρω, αποκαλύψαμε ότι το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ ανέστειλε τη μελανογένεση χηλώνοντας ένα κατιόν χαλκού από ένα σύμπλεγμα χαλκού-τυροσινάσης. Έτσι, το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ ή η κλασματοποίηση βουτανόλης που απομονώνεται από το L. thunbergianus μπορεί να είναι χρήσιμα στα καλλυντικά ως παράγοντας λεύκανσης του δέρματος.

Cistanche tubulosa: ο παράγοντας λεύκανσης του δέρματος.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η μελανίνη, μια ομάδα φυσικών χρωστικών που βρίσκεται στους περισσότερους οργανισμούς, παίζει σημαντικό ρόλο στο μαύρισμα φρούτων, μυκήτων και λαχανικών και στη χρώση στο ανθρώπινο δέρμα.1 Η μελανίνη παράγεται από το αμινοξύ τυροσίνη μέσω μιας διαδικασίας πολλαπλών σταδίων που περιλαμβάνει ενζυματική οξείδωση και πολυμερισμό. 2 Απάνθρωποι, η χρωστική μελανίνη συντίθεται από εξειδικευμένα μελανοκύτταρα δενδριτικών κυττάρων που βρίσκονται στη διασταύρωση μεταξύ της επιδερμίδας και του χόριου, όπου η σύνθεση ξεκινά με έκθεση σε υπεριώδεις ακτίνες (UV). Έτσι, το χρώμα του δέρματος καθορίζεται από το σχέδιο κατανομής της χρωστικής μελανίνης.2 Η δυσρύθμιση της σύνθεσης της μελανίνης οδηγεί σε πολλές μορφές υπερμελάγχρωσης, όπως μέλασμα, φακίδες, κηλίδες ηλικίας, ηλιακό φακό, μεταφλεγμονώδη υπερμελάγχρωση και άλλα σύνδρομα υπερμελάγχρωσης. εκατοντάδες πρωτεΐνες σχετίζονται με τη σύνθεση τομελανίνης, και μεταξύ αυτών, η τυροσινάση είναι το ένζυμο περιορισμού του ρυθμού που αναγνωρίζεται ως υπεύθυνο για τη σύνθεση της φορμαλανίνης. αναστολείς τυροσινάσης για την πρόληψη της μελανογένεσης.1,6 Ένας αριθμός αναστολέων τυροσινάσης, όπως το κοτζικό οξύ, η αρβουτίνη, η υδροκινόνη, το αζελαϊκό οξύ, το ελλαγικό οξύ και το τρανεξαμικό οξύ, έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στη βιομηχανία καλλυντικών ως παράγοντες κατά της μελανογένεσης. Ωστόσο, λόγω των περιορισμών των χημικών φαρμάκων, που περιλαμβάνουν κυτταροτοξικότητα και παρενέργειες, εξακολουθεί να υπάρχει ζήτηση για νέα υλικά με βελτιωμένη ασφάλεια, σταθερότητα και αποτελεσματικότητα.7

Τα φυσικά προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων των φυτών, των βακτηρίων και των μυκήτων, έχουν γίνει εναλλακτικές πηγές για την ανακάλυψη αποτελεσματικών συστατικών λεύκανσης του δέρματος λόγω της μικρότερης τοξικότητας και της καλύτερης βιοσυμβατότητας και βιοδιαθεσιμότητάς τους. ή τον φλοιό των δέντρων και διανέμεται στις εύκρατες περιοχές της Ανατολικής Ασίας, όπως η Κορέα, η Ιαπωνία, η Κίνα, οι Φιλιππίνες και η Ινδοκίνα. Το L. thunbergianus έχει χρησιμοποιηθεί ως αδιουρητικό, αιμοστατικό παράγοντα και είναι αντιβηχικό στις λαϊκές ιατρικές της Κορέας. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι ένα εκχύλισμα L. thunbergianus έχει τοπική αντιλιπιδική υπεροξείδωση σε τοπική και αντιοξειδωτική δράση.9 Επιπλέον, το εκχύλισμα L. thunbergianus έδειξε σημαντική αναστολή ανάπτυξης εξαρτώμενης από τη συγκέντρωση σε κύτταρα καρκίνου του στόματος και καρκίνου του παχέος εντέρου.10 Το εκχύλισμα L. thunbergianus μπορεί να έχει πιθανές εφαρμογές στην καλλυντική βιομηχανία, επειδή αυτό το φυτό περιέχει διάφορες φλαβονοειδείς ενώσεις και πολυάριθμα βιοενεργά μόρια, τα οποία περιλαμβάνουν κουερσετίνη 3-μεθυλαιθέρα-γλυκοσίδη, βιτεξίνη, ανατολίτικη, περιοδική γλυκοσίδη, ισοβιτεξίνη, οριεντίνη, κορεντίνη και καφεοϋλοκινικό οξύ.9α, ωστόσο, οι επιδράσεις του Η σύνθεση της μελανίνης του εκχυλίσματος L. thunbergianus στα μελανοκύτταρα δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί.

Σχήμα 1. Ανάλυση του εκχυλίσματος L. thunbergianus για (Α) δράση δέσμευσης ριζών ABTS, (Β) αντι-τυροσινάση και (C) ενδοκυτταρική δράση σάρωσης ROS

Σε αυτή τη μελέτη, παρασκευάσαμε το εκχύλισμα L. thunbergianus και τα κλάσματα του διαλύτη μέσω σειριακής κλασματοποίησης και διερευνήσαμε τα ανασταλτικά αποτελέσματα των κλασμάτων διαλύτη στη βιοσύνθεση μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος B16F10. Προσδιορίσαμε το κλάσμα της βουτανόλης (n-BuOH) ως το κύριο μέρος που περιέχει τον φυσικό αναστολέα και χαρακτηρίσαμε περαιτέρω τις επιδράσεις των παραγώγων καφεοϋλοκινικού οξέος που απομονώθηκαν από τα εκχυλίσματα L. thunbergianus στην αναστολή της βιοσύνθεσης μελανίνης.

κριτική cistanche: αντιοξείδωση

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Αιθανολικό εκχύλισμα L. thunbergianus Scavenges 2,2'-Azinobis(3-αιθυλ-βενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ (ABTS) Ρίζα και αναστέλλει τη δράση τυροσινάσης.

Η εξόρυξη του Λ. thunbergianus με 70 τοις εκατό αιθανόλη (EtOH) πραγματοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η πιθανή ανασταλτική δράση των φυσικών ενώσεων στο φυτό. Η δραστικότητα δέσμευσης ριζών του εκχυλίσματος L.thunbergianus προσδιορίστηκε στο εύρος συγκέντρωσης 2−200 ug/mL. Το εκχύλισμα αιθανόλης έδειξε δραστικότητα δέσμευσης ριζών εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση με μέγιστο αποτέλεσμα στα 50 ug/mL, όπου το αποτέλεσμα ήταν συνεπές με αυτό της αρβουτίνης που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (Εικόνα 1Α).

Αξιολογήσαμε επίσης την ανασταλτική επίδραση του εκχυλίσματος στη δραστηριότητα της τυροσινάσης μανιταριού μετρώντας τον ρυθμό σύνθεσης ντοπαχρώματος που καταλύεται από την τυροσινάση. Το αιθανολεξικό ανέστειλε το 87 τοις εκατό της δραστηριότητας τυροσινάσης στα 500 ug/mL, ενώ η αρμπουτίνη ανέστειλε μόνο το 38 τοις εκατό της δραστηριότητας τυροσινάσης στην ίδια συγκέντρωση (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τη δραστηριότητα δέσμευσης του εκχυλίσματος στο ενδοκυτταρικό ROS αυξημένο κατά 100 μM υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η θεραπεία με υπεροξείδιο του υδρογόνου προκάλεσε περίπου 2,1-πλάσια αύξηση του ενδοκυτταρικού επιπέδου ROS των κυττάρων B16F10 (Εικόνα 1C). Βρήκαμε ότι η μεσολαβούμενη από υπεροξείδιο του υδρογόνου αύξηση του ενδοκυτταρικού ROS καθαρίστηκε από το εκχύλισμα με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση: η μέγιστη δραστικότητα σάρωσης στα 100 ug/mL ήταν 78 τοις εκατό (Εικόνα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το αιθανολικό εκχύλισμα του L. thunbergianus περιέχει βιοενεργά συστατικά που αναστέλλουν τη δραστηριότητα της τυροσινάσης καθώς και τον καθαρισμό των ριζών ABTS και των ενδοκυτταρικών ROS.

εκχύλισμα cistanche deserticola: αναστέλλει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης.

Ανασταλτικό Δυναμικό του L. thunbergianus Κλάσμα κατά της Μελανογένεσης.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, το οποίο είναι σύμφωνο με την προηγούμενη αναφορά.10bΠεραιτέρω, οι ανασταλτικές επιδράσεις των διαφορετικών κλασμάτων διαλύτη δραστικότητας οντυροσινάσης αυξήθηκαν με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση: οι μέγιστες ανασταλτικές δραστηριότητες των κλασμάτων n-Hex και CH2Cl2 ήταν κάτω από 65 τοις εκατό, αλλά εκείνες του EtOA και Τα κλάσματα n-BuOH ήταν πάνω από 70 τοις εκατό (Σχήμα 2Β). Η ανασταλτική δραστηριότητα ήταν της τάξης του n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα περισσότερα υδρόφιλα κλάσματα, συμπεριλαμβανομένων των κλασμάτων n-BuOH και EtOAc, έδειξαν υψηλότερη δραστικότητα δέσμευσης ριζών και καλύτερη ανασταλτική δράση από το λιπόφιλο κλάσμα2 και το CH2CHex .

Στη συνέχεια, οι επιδράσεις των κλασμάτων διαλύτη L. thunbergianus στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του μελανώματος διερευνήθηκαν με επεξεργασία κυττάρων B16F10 με 200 ug/mL κάθε ένα από τα διαφορετικά κλάσματα ή 2 mg/mL αρβουτίνης στο παρουσία μιας ορμόνης που διεγείρει τα μελανοκύτταρα (-MSH), η οποία είναι πολύ γνωστό ότι προάγει τη μελανογένεση μέσω επαγωγής μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF).11 Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κανένα από τα κλάσματα δεν είχε σημαντική επίδραση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό του μελανώματος (Εικόνα 2C). Στη συνέχεια διερευνήσαμε την ανασταλτική επίδραση των κλασμάτων του διαλύτη στη μελανογένεση που διεγείρεται από -MSH σε κύτταρα μελανώματος. Η θεραπεία με -MSH προκάλεσε κατά προσέγγιση 2.0-πλάσια αύξηση στην ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε μελανίνη των κυττάρων B16F10 (Εικόνα 2D). Βρήκαμε ότι η μελανογένεση με τη μεσολάβηση MSH αναστέλλεται πλήρως από το κλάσμα n-BuOH (ρ < 0,01)="" και="" εν="" μέρει="" αναστέλλεται="" από="" το="" κλάσμα="" etoac="" (40="" τοις="" εκατό,="" p=""><0,01), ενώ="" η="" μελανογένεση="" με="" τη="" μεσολάβηση="" -msh="" δεν="" μεταβάλλεται="" σημαντικά="" από="" το="" n-hex="" και="" κλάσματα="" ch2cl2="" (εικόνα="" 2d).="" επιπλέον,="" προσδιορίστηκαν="" τα="" ανασταλτικά="" αποτελέσματα="" των="" κλασμάτων="" διαλύτη="" στην="" ενεργοποίηση="" τυροσινάσης="" που="" προκαλείται="" από="" -msh,="" καθώς="" η="" τυροσινάση="" παίζει="" βασικό="" ρόλο="" στη="" μελανογένεση.="" από="" -msh,="" ενώ="" τα="" κλάσματα="" n-hex="" και="" ch2cl2="" όχι,="" όπως="" φαίνεται="" στο="" σχήμα="" 2ε.="" επιπλέον,="" η="" επίδραση="" σάρωσης="" διαφορετικών="" κλασμάτων="" διαλύτη="" στην="" ενδοκυτταρική="" αύξηση="" ros="" διεγέρθηκε="" από="" το="" υπεροξείδιο="" του="" υδρογόνου.="" όλα="" τα="" κλάσματα="" διαλύτη="" ανέστρεψαν="" την="" ενδοκυτταρική="" αύξηση="" ros="" που="" προκαλείται="" από="" το="" υπεροξείδιο="" του="" υδρογόνου,="" όπως="" φαίνεται="" στο="" σχήμα="" 2στ.="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" υποδεικνύουν="" ότι="" το="" κλάσμα="" buoh="" του="" l.="" thunbergianus="" ανέστειλε="" την="" επαγόμενη="" από="" -msh="" σύνθεση="" μελανίνης="" αναστέλλοντας="" την="" ενδοκυτταρική="" δραστηριότητα="" τυροσινάσης="" στα="" κύτταρα="" β16f10.="" επιπλέον,="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" υποδηλώνουν="" ότι="" τα="" βιοενεργά="" συστατικά="" που="" αναστέλλουν="" τη="" σύνθεση="" μελανίνης="" ήταν="" υδρόφιλα="" και="" βρέθηκαν="" κυρίως="" στο="" κλάσμα="">

Σχήμα 2. Επιδράσεις των κλασμάτων διαλύτη στις δραστηριότητες δέσμευσης ριζών ABTS, αντι-τυροσινάσης και αντι-μελανογένεσης.

Ταυτοποίηση και Χαρακτηρισμός Βιοδραστικών Ενώσεων Εκχυλίσματος L. thunbergianus.

Για τον προσδιορισμό και τον χαρακτηρισμό συστατικών που αναστέλλουν τη μελανογένεση, πραγματοποιήθηκε ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) για όλα τα κλάσματα διαλύτη. Η ανάλυση HPLC των κλασμάτων διαλύτη αποκάλυψε ότι όλα τα κλάσματα περιέχουν τρεις κύριες ενώσεις σε χρόνους κατακράτησης 21, 28 και 29 λεπτών για τις ενώσεις 1, 2 και 3, αντίστοιχα (Εικόνα 3A−D). Αυτές οι τρεις κύριες ενώσεις απομονώθηκαν περαιτέρω με προπαρασκευαστικό καθαρισμό HPLC. Οι ποσότητες των τριών κύριων ενώσεων στο κλάσμα n-BuOH προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά παράγωγα καφεοϋλκινικού οξέος ως εσωτερικά πρότυπα μόρια, σύμφωνα με την προηγούμενη αναφορά.12

Οι απομονωμένες ενώσεις στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση των δεδομένων NMR 1Η και 13C με τη βιβλιογραφία και βρέθηκε ότι συμφωνούν με τις προτεινόμενες δομές (Εικόνα 4).13 Το Σχήμα 3Ε δείχνει τη μοριακή δομή των τριών ενώσεων. Η ένωση 1 (απόδοση, 3,2 ± 0, 1 mg/100 mg η κλάσμα BuOH) ελήφθη ως ωχροκίτρινη σκόνη. 1HNMR (400 ΜΗζ, DMSO-d6) δ 9.66 (1Η, brs), 9.20 (1Η, brs), 7.49 (1Η, d, J=15.9 Ηζ), 7.04 (1Η, s), 6.99 ( 1H, d, J=8.2Hz), 6.78 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.23 (1H, d, J=15.9 Hz), 5.20( 1Η, m), 5,08 (1Η, brs), 4,89 (1Η, brs) 4,13 (1Η, m), 3,84 (1Η, m), 3,56 (1Η, s), 3,35 (1Η, s), 1,99 (1Η, m), m), 1,92 (1 Η, m), 1,89 (1 Η, m), 1,79 (1 Η, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65.121.07, 115.75, 1114.75, 115.75. Η ένωση 1 αναγνωρίστηκε ως 3-καφεοϋλοκινικό οξύ με ανάλυση NMR και σε σύγκριση με την προηγούμενη βιβλιογραφία.13β

Η ένωση 2 (απόδοση, 14,1 ± 0, 1 mg/100 mg η-ΒυΟΗ κλάσμα) ελήφθη ως ωχροκίτρινη σκόνη. 1Η NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1Η, brs), 9.20 (1Η, brs), 7.52 (1Η, d, J=15.9 Hz), 7.06 (1Η, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1Η, brs), 4.70 (1Η, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1Η, brs), 3.95 (1Η, m), 1.97 (2Η, m), 1.88 (1Η, m), 1,83 (1 Η, m). 13C {1Η} NMR (100MHz, DMSO-D6) Δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77,125,54, 121,19, 115,76, 114,68, 114,57, 76,66, 73,92, 66,05,64,31, 48,57, 38,20). Η ένωση 2 αναγνωρίστηκε ως 5-καφεοϋλοκινικό οξύ με ανάλυση NMR και σε σύγκριση με την προηγούμενη βιβλιογραφία.13γ

Η ένωση 3 (απόδοση, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg η-ΒυΟΗ κλάσμα) ελήφθη ως ωχροκίτρινη σκόνη. 1Η NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1Η, brs), 9.20 (1Η, brs), 7.52 (1Η, d, J=15.9 Hz), 7.06 (1Η, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1Η, brs), 4.70 (1Η, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1Η, brs), 3.95 (1Η, m), 1.97 (2Η, m), 1.88 (1Η, m), 1,83 (1 Η, m). 13C {1Η} NMR (100MHz, DMSO-D6) Δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77,125,54, 121,19, 115,76, 114,68, 114,57, 76,66, 73,92, 66,05,64,31, 48,57, 38,20). Η ένωση 3 αναγνωρίστηκε ως 4-καφεοϋλοκινικό οξύ με ανάλυση NMR και σε σύγκριση με την προηγούμενη βιβλιογραφία.13α

Σχήμα 3. Χρωματογραφήματα HPLC (Α) n-Hex, (Β) CH2Cl2, (C) EtOAc και (D) n-BuOH κλασμάτων του L. thunbergianus και (Ε) της δομής των τριών κύριων ενώσεων.

Ανασταλτικό δυναμικό παραγώγων καφεοϋλκινικού οξέος που απομονώθηκαν από L. thunbergianus κατά της μελανογένεσης.

Στη συνέχεια, για να προσδιορίσουμε το βιολογικά δραστικό συστατικό που βρίσκεται κάτω από την ισχυρή αντιμελανογένεση, προσδιορίσαμε την ανασταλτική δράση των τριών παραγώγων καφεοϋλκινικού οξέος που απομονώθηκαν από το L. thunbergianus έναντι των κυττάρων του μελανώματος της σύνθεσης μελανίνης. Πρώτον, διερευνήθηκαν οι επιδράσεις των τριών παραγώγων στον καθαρισμό ριζών ABTS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα τρία παράγωγα είχαν παρόμοιες δραστικότητες δέσμευσης ριζών ABTS (Εικόνα 5Α). Στη συνέχεια διερευνήσαμε το ανασταλτικό αποτέλεσμα των τριών παραγώγων που απομονώθηκαν από τη δραστηριότητα της οντυροσινάσης του L. thunbergianus. Τα τρία παράγωγα έδειξαν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της δραστηριότητας της τυροσινάσης, με μέγιστη αναστολή σε συγκέντρωση 200 μΜ (Εικόνα 5Β). Επιπλέον, διερευνήσαμε την ανασταλτική επίδραση των τριών παραγώγων στη σύνθεση μελανίνης που προκαλείται από -MSH σε κύτταρα B16F10. Η θεραπεία με -MSH προκάλεσε περίπου 2,{11}}πλάσια αύξηση της περιεκτικότητας σε ενδοκυτταρική μελανίνη των κυττάρων B16F10 (Εικόνα 5C). Είναι ενδιαφέρον ότι οι ενώσεις 1 (3-caffeoylquinicacid) και 3 (4-caffeoylquinic acid) αύξησαν σημαντικά τη σύνθεση μελανίνης κατά 25 και 23 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικόνα 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Σχήμα 4. Φάσματα 1Η NMR του (Α) 3-καφεοϋλοκινικού οξέος, (Β) 4-καφεοϋλκινικού οξέος και (C) 5-καφεοϋλκινικού οξέος και Φασμάτων 13C NMR του (D) {{ 6}}καφεοϋλκινικό οξύ, (Ε) 4-καφεοϋλκινικό οξύ και (F) 5-καφεοϋλκινικό οξύ

Επαλήθευση της αποτελεσματικότητας κατά της μελανογένεσης του 5-Καφεοϋλκινικού οξέος.

Για να επαληθεύσουμε την ανασταλτική δράση του {0}}καφεοϋλοκινικού οξέος κατά της μελανογένεσης, προσδιορίσαμε την ανασταλτική επίδραση της εμπορικής σύνθεσης του καφεοϋλκινικού οξέος επί της μελανίνης με τη μεσολάβηση -MSH. Θεραπεία με χαμηλότερες συγκεντρώσεις 0.1 και 0.2 mM 5-καφεοϋλοκινικοξέος αύξησε ελαφρώς τη σύνθεση μελανίνης και τη δραστηριότητα ενδοκυτταρικής τυροσινάσης, ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις 0,5 και 1 mm της ένωσης ανέστρεψαν τη μελανογένεση με τη μεσολάβηση MSH και ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης (Εικόνα 6Α, Β) στα οποία τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με την προηγούμενη αναφορά.14

Το καφεοϋλοκινικό οξύ είναι μια φαινολική ένωση που σχηματίζεται από τον δεσμό του εστέρα μεταξύ του καφεϊκού οξέος και του L-κινικού οξέος. Τα παράγωγα του καφεοϋλκινικού οξέος είναι γνωστό ότι έχουν δραστικότητα κατά της μελανογένεσης και κατά της τυροσινάσης καθώς και δράση δέσμευσης ROS. Η τυροσινάση είναι ένα πολυλειτουργικό μεταλλοένζυμο που περιέχει χαλκό με δισθενή κατιόντα χαλκού.1 Τα παράγωγα του καφεοϋλοκινικού οξέος μπορεί να αναστείλουν τη δραστικότητα της τυροσινάσης χηλώνοντας ένα κατιόν χαλκού που είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της ενεργού κατάστασης της τυροσινάσης. Για την πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης μεταξύ 5-καφεοϋλοκινικού οξέος και τυροσινάσης, πραγματοποιήθηκε μια υπολογιστική μοριακή μελέτη σύνδεσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Maestro. Η καλύτερη στάση για την ένωση, η συνδεδεμένη τοτυροσινάση, απεικονίζεται στο Σχήμα 6Γ, Δ. Η μελέτη μοριακής σύνδεσης αποκάλυψε ότι το 5-καφεοϋλκινικό οξύ αλληλεπιδρά με το χαλκό σε απόσταση 2,43 Å και δημιουργεί μια σειρά π-π στοίβαξης με το His 259, Asn 260, His 85 και His 263 υπολείμματα και ένας δεσμός Η με Arg 268. Επιπλέον, η ενέργεια δέσμευσης μεταξύ τυροσινάσης και 5-καφεοϋλοκινικού οξέος ήταν−4,425 kJ/mol. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ θα μπορούσε να αναστείλει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης μέσω χηλίωσης χαλκού. Για να επαληθεύσουμε τον ανασταλτικό μηχανισμό της μελανογένεσης από το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ, προσδιορίσαμε την ικανότητα χηλικοποίησης χαλκού του 5-καφεοϋλοκινικού οξέος. Η ικανότητα χηλικοποίησης χαλκού του 5-καφεοϋλκινικού οξέος αυξήθηκε με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Εικόνα 6Ε). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ αναστέλλει τη σύνθεση μελανίνης μέσω της χηλοποίησης ενός κατιόντος χαλκού που αλληλεπιδρά με την τυροσινάση.

Σχήμα 5. Επιδράσεις των τριών παραγώγων του καφεοϋλκινικού οξέος στη δέσμευση ριζών, στη δράση αντι-τυροσινάσης in vitro και κατά της μελανογένεσης στα κύτταρα Β16F10.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Υλικά

Το L. thunbergianus αγοράστηκε από την ηλεκτρονική αγορά www.jirisangol.com (Κορέα) και ξηράνθηκε σε συνθήκες περιβάλλοντος πριν από τη χρήση σε αυτή τη μελέτη. Αντιδραστήρια, όπως 2,2′- ψευδάργυρος δις(3-αιθυλ-βενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ (ABTS) και 3-(4,5-διμεθυλθειαζόλη-2- υλ)-2,5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT), μια ορμόνη διέγερσης μελανοκυττάρων (-MSH) και ένζυμα, όπως η τυροσινάση μανιταριού, ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Η.Π.Α.) Υπερθειικό κάλιο (K2S2O8), βιολέτα πυροκατεχόλης και 3,4-διυδροξυ-L φαινυλαλανίνη (L-DOPA) αγοράστηκαν από την Alfa Aesar (Haverhill, MA, ΗΠΑ).

Εκχύλιση και Κλασματοποίηση του L. thunbergianus.

Το αποξηραμένο L. thunbergianus (80 γρ.) κονιοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κονιοποιητή (HBL-3500S, Samyang Electronics, Κορέα) και εκχυλίστηκε με 70 τοις εκατό EtOH τρεις φορές (800 mL, κάθε φορά ) στους 70 βαθμούς για 3 ημέρες. Το προκύπτον εκχύλισμα διηθήθηκε υπό κενό χρησιμοποιώντας χαρτί Advantecfilter αρ. 1 και 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία) και συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας περιστροφικό εξατμιστή Hei-Vap Advantage (Heidolph, Γερμανία) για να ληφθούν 17,2 g του εκχυλίσματος EtOHcrude. Αυτό το ακατέργαστο εκχύλισμα εναιωρήθηκε σε dH2O (180 mL) και κλασματοποιήθηκε διαδοχικά με Hex, CH2Cl2, EtOAc, και n-BuOH για να δώσει Hex (1,51 g, 8,8 τοις εκατό), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 τοις εκατό g, E.3t, 5,1 g, E.30, 5,0 g, 2,0 γρ. τοις εκατό) και n-BuOH (3,02 g, 17,6 τοις εκατό), όπως περιγράφηκε προηγουμένως.15 Τα εκχυλίσματα και τα κλάσματα που προέκυψαν ξηράνθηκαν με κατάψυξη και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς πριν από τη χρήση.

Προσδιορισμός ABTS Free Radical Scavenging Activity.

Για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων L.thunbergianus και των κλασμάτων του διαλύτη, προσδιορίστηκε η δραστικότητα σάρωσης ριζικού ABTS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.16 Για να δημιουργηθεί η ρίζα ABTS, 10 mL 7 mMABTS αναμίχθηκαν με 176 μL 140 mM υπεροξυδιθειικό κάλιο σε dH2O και επωάστηκε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 16 ώρες πριν από τη χρήση. Το διάλυμα ρίζας ABTS αραιώθηκε με απόλυτη μεθανόλη για να ληφθεί απορρόφηση κοντά στο 0,7 στα 734 nm. Δείγματα 100 μL από κάθε εκχύλισμα ή κλάσματα στην υποδεικνυόμενη περιοχή συγκέντρωσης 2−200 ug/mL προστέθηκαν σε 100 μL του αραιωμένου διαλύματος ρίζας ABTS και επωάστηκαν για 10 λεπτά στο σκοτάδι σε RT. Η απορρόφηση στη συνέχεια μετρήθηκε στα 732 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Η δραστηριότητα καθαρισμού ριζών ABTS υπολογίστηκε ως εξής

Δραστηριότητα καθαρισμού ριζών ABTS ( ποσοστό ) =1−(Δείγμα/Έλεγχος)×100 (1)

In Vitro Αναστολή Τυροσινάσης.

Η ανασταλτική επίδραση των εκχυλισμάτων του L.thunbergianus και των κλασμάτων του διαλύτη στη δραστικότητα της τυροσινάσης εκτιμήθηκε από την ποσότητα της ντοπαχρωμοσύνθεσης από την καταλυτική αντίδραση της τυροσινάσης. U/mL τυροσινάση μανιταριού σε 50 mM ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl, και 138 mM NaCl) σε ένα τρυβλίο {{20}μΜ σε φρεάτιο 30 λεπτά και Στη συνέχεια, προστέθηκαν 100 μL L-DOPA 1 mM σε κάθε φρεάτιο και ακολούθησε επώαση για επιπλέον 10 λεπτά στους 37 βαθμούς. Η απορρόφηση του προκύπτοντος διαλύματος μετρήθηκε στα 475 nm χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης πολυτροπικών μικροπλακών SpectraMax M5.

Κυτταρικής καλλιέργειας.

Τα κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό ορό βοοειδών απενεργοποιημένο από τη θερμότητα (Gibco), 100 μονάδες/mL πενικιλλίνη και 100 ug/mL σε 3 βαθμούς streptocin (7 βαθμοί streptocin) υπό υγραμένο 5 τοις εκατό CO2.

Βιωσιμότητα κυττάρων.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων B16F10 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ΜΤΤ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.18 Εν συντομία, τα κύτταρα B16F10 σπάρθηκαν σε τρυβλία 24- φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 104 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων ή κλασμάτων L. thunbergianus για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διάλυμα ΜΤΤ για 4 ώρες και οι ανηγμένοι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε DMSO. Το προκύπτον διάλυμα μεταφέρθηκε σε 96-πλάκες φρεατίων και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλακών SpectraMax M5multimode.

Προσδιορισμός Ενδοκυτταρικών Αντιδραστικών Ειδών Οξυγόνου (ROS).

Το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ κυτταρικής ανάλυσης ROS DCF/H2DCFDA (ab113851, Abcam), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα B16F10 σπάρθηκαν σε 48-πλάκες φρεατίου σε πυκνότητα 2 x 104 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από καλλιέργεια 24 ωρών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 h με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις κλασμάτων διαλύτη εκχυλίσματος L. thunbergianus σε 0,1 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) που περιέχει μέσα καλλιέργειας χωρίς ερυθρό φαινόλης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 100 μΜ υπεροξείδιο του υδρογόνου για 30 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μMH2DCFDA σε PBS για 45 λεπτά. Το επίπεδο ROS αναλύθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Synergy Η1, Biotek, Vermont, ΗΠΑ) εξοπλισμένη με φίλτρο φθορισμού στα 485/545 nm (μήκος κύματος διέγερσης/εκπομπής). Η μέση σχετική ένταση φθορισμού του ελέγχου ισοδυναμούσε με 100 τοις εκατό, με τις συνθήκες θεραπείας να υπολογίζονται αναλογικά.

Προσδιορισμός Περιεκτικότητας Μελανίνης.

Η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ορισμένες τροποποιήσεις.19 Τα κύτταρα μελανώματος καλλιεργήθηκαν σε ένα τρυβλίο έξι φρεατίων για 24 ώρες. Υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος L. thunbergianus ή των κλασμάτων διαλυτών του για περαιτέρω 48 ώρες παρουσία 100 nM -MSH. Μετά από δύο φορές πλύση με παγωμένο αλατούχο διάλυμα Dulbecco, ρυθμισμένο με φωσφορικά, συμπληρωμένο με χλωριούχο ασβέστιο και χλωριούχο μαγνήσιο (D-Pchloride Gibco), τα κύτταρα που προέκυψαν αποκολλήθηκαν με επώαση με διάλυμα θρυψίνης-EDTA. Μετά από φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 3 λεπτά, το κυτταρικό ίζημα διαλύθηκε σε 150 μL NaOH 1 M που περιείχε 10 τοις εκατό DMSO για 1 ώρα στους 60 βαθμούς για 1 ώρα. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε με την απορρόφηση στα 405 nm χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας.

Το εκχύλισμα Cistanche αναστέλλει τη μελανίνη.

Προσδιορισμός της Δραστικότητας Κυτταρικής Τυροσινάσης σε Κύτταρα Μελανώματος.

Η δραστικότητα τυροσινάσης σε κύτταρα B16F10 εξετάστηκε με βάση την ποσότητα ντοπαχρώματος που παρήχθη από την καταλυτική αντίδραση της ενδοκυτταρικής τυροσινάσης.20 Εν συντομία, τα κύτταρα μελανώματος καλλιεργήθηκαν σε ένα τρυβλίο έξι φρεατίων για 24 ώρες και ακολούθησε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος L.thunbergianus ή του διαλύτη του κλάσματα για επιπλέον 48 Hin την παρουσία 100 ηΜ -MSH. Μετά από δύο φορές πλύσιμο με παγωμένο D-PBS, τα κύτταρα λύθηκαν σε 200 μL ρυθμιστικού διαλύματος (Sigma-Aldrich) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης με δοκιμασία ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA). Μετά από φυγοκέντρηση του προϊόντος λύσης κυττάρων που συλλέχθηκε από κάθε φρεάτιο στα 15,000g για 15 λεπτά, 100 μL του υπερκειμένου αναμίχθηκαν με 100 μL 1 mM L-DOPA σε PBS (pH 6,8) και ακολούθησε επώαση για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς . Η απορρόφηση της ντόπαχρωμης μετρήθηκε στα 475 nm χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με τη συγκέντρωση πρωτεΐνης που προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία δικινχονικού οξέος.

Απομόνωση και Χαρακτηρισμός Βιοδραστικών Ενώσεων με χρήση HPLC.

Η HPLC πραγματοποιήθηκε σε YL{{0}}(Young Lin Instrument, Κορέα), εξοπλισμένη με στήλη TC-C18 (4,6 mm, 250 mm και 5 μm, Agilent, USA), σε συνδυασμό με σύστημα βαθμίδωσης που αποτελείται από διαλύτη Α(0.2 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ) και διαλύτη Β (MeOH). Η αναλογία κλίσης διαλύτη ορίστηκε σε 0−5 λεπτά, 15 τοις εκατό Β. 5−10 min, 15−20 τοις εκατό B; 10−15 λεπτά, 20−30 τοις εκατό Β; 15−30 λεπτά, 30−40 τοις εκατό Β; 30−37 λεπτά, 40−60 τοις εκατό Β; 37−40 λεπτά, 60−100 τοις εκατό Β; 40−45 λεπτά, 100 τοις εκατό B; 45−50 λεπτά, 100−15 τοις εκατό Β; και 50−55 λεπτά, 15 τοις εκατό Β. Για την αναγνώριση των συστατικών σε κλάσματα διαλύτη, η κινητή φάση παραδόθηκε με ρυθμό ροής 1 mL/min και η ανίχνευση της έκλουσης πραγματοποιήθηκε στα 330 nm. Για τη συλλογή των κλασμάτων αδιάλυτων βιοδραστικών συστατικών, η κινητή φάση παραδόθηκε με ρυθμό ροής 15,0 mL/min και η ανίχνευση της έκλουσης διεξήχθη στα 330 nm χρησιμοποιώντας prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Κορέα ), εξοπλισμένη με στήλη prep-C18 (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, ΗΠΑ), σε συνδυασμό με σύστημα βαθμίδωσης που αποτελείται από διαλύτη Α (0,2 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ) και διαλύτη Β(MeOH). Ο λόγος κλίσης διαλύτη ορίστηκε σε 0−10 min, 10% B, 10−20 min, 10−15% B. 20−40 λεπτά, 15 τοις εκατό B; 40−60 λεπτά, 15−20 τοις εκατό B; και 60−70 λεπτά, 30 τοις εκατό Β.

Μοριακή Μοντελοποίηση.

Η κρυσταλλική δομή της mushroomtyrosinase για μοριακή μοντελοποίηση ήταν μια Agaricustyrosinase (PDB κάνει: 2Y9X) που ελήφθη από την Protein DataBank (PDB). Το ένζυμο παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη ροή εργασιών προετοιμασίας του πρωτεϊνικού οδηγού που είναι ενσωματωμένη στο πρόγραμμα Maestro (Maestro, έκδοση 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, ΗΠΑ, 2019). Το νερό και όλα τα άλλα μόρια που υπήρχαν στα αρχεία PDB αφαιρέθηκαν. Η μοριακή σύνδεση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο σύνδεσης επαγόμενης προσαρμογής (IFD) (πρωτόκολλο σύνδεσης επαγόμενης προσαρμογής Schrödinger Suite 2019), που είχε αναφερθεί προηγουμένως.21

Ικανότητα χηλοποίησης χαλκού.

Η ικανότητα χηλικοποίησης του χαλκού των ενώσεων που απομονώθηκαν από το L. thunbergianus προσδιορίστηκε σύμφωνα με την προηγούμενη αναφορά.22 Κάθε παράγωγο καφεοϋλκινικού οξέος (10 μL) στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση αναμειγνύεται με 280 μL ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου 50 mM (pH 6,0). 6 μL διαλύματος βιολέτας πυροκατεχόλης 4 mM παρασκευάστηκε στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O. Η εξαφάνιση του μπλε χρώματος παρατηρήθηκε μετρώντας την απορρόφηση στα 632 nm χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών SpectraMax M5. Χρησιμοποιήθηκε νερό ως έλεγχος αντί για δείγμα. Το ποσοστό χηλικής δραστηριότητας χαλκού υπολογίστηκε από την απορρόφηση στα 632 nm, η οποία είναι η εξής

ικανότητα χηλικοποίησης χαλκού ( ποσοστιαία )=1− (Ένα δείγμα/Ένας έλεγχος)×100 (2)

Στατιστική ανάλυση.

Όλα τα δεδομένα σε αυτή τη μελέτη εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Οι διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών του μάρτυρα και των εκτεθειμένων ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανάλυση διακύμανσης ενός τρόπου (ANOVA) ακολουθούμενη από το post hoctest του Dunnett. Το όριο για τη στατιστική σημασία για όλες τις αναλύσεις ήταν p < 0.05="" (με="" δύο="">

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το εκχύλισμα L. thunbergianus εκδικάζει τις ρίζες ABTS και παρουσιάζει ισχυρό ανασταλτικό αποτέλεσμα στη βιοσύνθεση μελανίνης χωρίς σημαντική κυτταροτοξικότητα. Το αβιοδραστικό συστατικό που υπάρχει στο L. thunbergianus και η αναστολή της μελανογένεσης απομονώθηκε στο κλάσμα n-BuOH. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι τα τρία παράγωγα καφεοϋλοκινικού οξέος είναι κύριες ενώσεις που υπάρχουν στο κλάσμα n-BuOH και ότι το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ είναι σημαντικό για ένα καταστέλλοντας τη μελανογένεση στα κύτταρα μελανώματος αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης. Εδώ, απομονώσαμε τον αναστολέα της φυσικής ένωσης 5-καφεοϋλοκινικό οξύ από το εκχύλισμα L.thunbergianus για να αποτρέψουμε την υπερμελάγχρωση και αποκαλύψαμε τον μηχανισμό αναστολής του που βασίζεται στη μελανογένεση. Έτσι, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ και το κλάσμα n-BuOH που απομονώθηκε από το L. thunbergianus μπορεί να είναι χρήσιμα στα καλλυντικά ως παράγοντες λεύκανσης του δέρματος.

φέτες κιστάνι