Το CaWRKY30 ρυθμίζει θετικά την ανοσία του πιπεριού στοχεύοντας το CaWRKY40 κατά του εμβολιασμού Ralstonia Solanacearum μέσω Διαμόρφωσης γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα Μέρος 2

2.5. CaWRKY30 παροδική υπερέκφραση που διεγείρει κυτταρικό θάνατο παρόμοιο με HR, παραγωγή H2O2 και μεταγραφική ανοδική ρύθμιση των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία

Τα πειράματα VIGS έδειξαν ότι το CaWRKY30 ρυθμίζει θετικά την ανοσία της πιπεριάς στο RSI. Πραγματοποιήθηκαν παροδικά πειράματα υπερέκφρασης με διείσδυση κυττάρων GV3101 που έφεραν 35S:00 (EV) ή 35S: CaWRKY30 σε φύλλα πιπεριάς για περαιτέρω επικύρωση αυτής της εικασίας. Μελετήσαμε τον ρόλο της παροδικής υπερέκφρασης CaWRKY30 στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου που μοιάζει με HR και συσσώρευσης H2O2 σε φυτά πιπεριάς. Η έκφραση του CaWRKY30 σε φυτά πιπεριάς καθιερώθηκε με πειράματα στύπωσης western (Εικόνα 5Α).

Ο κυτταρικός θάνατος τύπου HR και η συσσώρευση H2O2 επιβεβαιώθηκαν με χρώση μπλε τρυπανίου και DAB, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 προκάλεσε κυτταρικό θάνατο που μοιάζει με HR και συσσώρευση H2O2 στα φύλλα πιπεριάς που εκδηλώνεται με πιο σκούρα χρώση μπλε τρυπανίου και σκούρο καφέ χρώση DAB (Εικόνα 5Β). Διεξήχθη αγωγιμότητα για τη μελέτη της έντασης της κυτταρικής νέκρωσης που προκαλείται από παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα φύλλα πιπεριάς που παροδικά υπερέκφραζαν CaWRKY30 έδειξαν μεγαλύτερη διαρροή ιόντων στις 24 και 48 ώρες μετά την Αγροδιήθηση σε σύγκριση με τα φύλλα πιπεριάς υπερβολικά που εκφράζει κενό διάνυσμα (Εικόνα 5Γ). Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα όπως το CaPR1 που σχετίζεται με τη βιοσύνθεση ET, το CaNPR1 που σχετίζεται με SA, το CaABR1 που ανταποκρίνεται σε ABA και το γονίδιο δείκτη που σχετίζεται με HR CaHIR1 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση qRT-PCR.

Τα αποτελέσματά μας απεικόνισαν ότι η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 στα φύλλα πιπεριάς ενίσχυσε σημαντικά τη μεταγραφική συσσώρευση των CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 και CaHIR1 στην πιπεριά σε σύγκριση με παροδικά υπερέκφραση κενών φυτών πιπεριάς φορέα στα 48 dpi (Εικόνα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα απεικονίζουν ότι το CaWRKY30 δρα ως θετικός ρυθμιστής του κυτταρικού θανάτου που μοιάζει με HR των φυτών, της παραγωγής H2O2 και της μεταγραφικής ανοδικής ρύθμισης των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία.

Εικόνα 5. Παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 που προκαλείται από HR-όπως κυτταρικό θάνατο, συσσώρευση H2O2 και έκφραση γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία σε φύλλα πιπεριάς. Η επιτυχής υπερέκφραση του CaWRKY30-Η σημαία επιβεβαιώθηκε με το πείραμα western blotting (A), ο κυτταρικός θάνατος που μοιάζει με HR προκλήθηκε από παροδική υπερέκφραση του 35S: CaWRKY30, που επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση φαινοτύπου, έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία και DAB και Trypan Blue χρώση στους 48 hpi, αντίστοιχα. Γραμμή κλίμακας=50 μm (B), Μέτρηση διαρροής ηλεκτρολυτών (αγωγιμότητα ιόντων) για εκτίμηση της απόκρισης κυτταρικού θανάτου σε δίσκους φύλλων πιπεριάς σε 24 και 48 ώρες μετά την αγροδιήθηση, αντίστοιχα (C), προσδιορισμός qRT-PCR σε ελέγξτε τα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία, συμπεριλαμβανομένων των CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 και CaHIR1 στο 35S: CaWRKY30 εκφράζονται φύλλα πιπεριού στα 48 dpi, αντίστοιχα (D). Το σχετικό επίπεδο έκφρασης των γνωστών γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα σε φύλλα πιπεριού που υπερεκφράζουν παροδικά τον κενό φορέα ορίστηκε σε "1". Δεδομένα που αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± SE από τέσσερα βιολογικά αντίγραφα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τυπικά σφάλματα των μέσων. Διαφορετικά γράμματα πάνω από τις ράβδους υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων.

2.6. Διασύνδεση μεταξύ CaWRKY30 και CaWRKY40

Αναφέρεται ότι διαφορετικά WRKY TF σχηματίζουν δίκτυα μαζί και αναφέραμε προηγουμένως ότι διάφορα μέλη των WRKY TF, π.χ. CaWRKY6, CaWRKY22 και CaWRKY40, συνδέονται εκφραστικά και λειτουργικά μεταξύ τους. Επομένως, υποθέτουμε ότι το CaWRKY30 μπορεί να σχετίζεται με άλλα μέλη της οικογένειας WRKY, συμπεριλαμβανομένου του CaWRKY40, το οποίο είναι ένας θετικός ρυθμιστής της ανοσίας του πιπεριού έναντι του RSI. Η ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για περαιτέρω διερεύνηση πιθανής ρύθμισης ανάδρασης του CaWRKY40 από το CaWRKY30 και για τη μελέτη της πιθανής διαμόρφωσης του CaWRKY30 με δοκιμασία παροδικής υπερέκφρασης CaWRKY40 ή με σίγαση του CaWRKY40 από VIGS.

Το CaWRKY40 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας WRKY που εμπλέκεται στις αποκρίσεις των φυτών σε διάφορες βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις. Μελέτες έχουν δείξει ότι το CaWRKY40 προκαλείται στις ντομάτες και μπορεί να ενισχύσει την αντοχή των φυτών σε επεξεργασίες ξηρασίας και χαμηλής θερμοκρασίας. Επιπλέον, η μελέτη διαπίστωσε επίσης ότι η υπερέκφραση του CaWRKY40 μπορεί να βελτιώσει την αντοχή της τομάτας στην ξηρασία και να ανακουφίσει την αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από το στρες στο αλάτι, αλλά η αντοχή στα παθογόνα χρειάζεται περαιτέρω μελέτη. Ως εκ τούτου, το CaWRKY40 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική απόκριση των φυτών και έχει ορισμένες δυνατότητες για αύξηση της γεωργικής απόδοσης. Ταυτόχρονα, πρέπει επίσης να προσέχουμε το ανοσοποιητικό μας. Η ανοσία του οργανισμού μας είναι πολύ σημαντική. Το Cistanche έχει σημαντική επίδραση στη βελτίωση της ανοσίας. Το Cistanche είναι πλούσιο σε διάφορες αντιοξειδωτικές ουσίες, όπως βιταμίνη C, βιταμίνη C, καροτενοειδή κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να καθαρίσουν τις ελεύθερες ρίζες, να μειώσουν το οξειδωτικό στρες και να βελτιώσουν την αντίσταση του ανοσοποιητικού συστήματος.

Κάντε κλικ στο συμπλήρωμα cistanche deserticola

Τα αποτελέσματά μας εξέφρασαν τα μεταγραφικά επίπεδα του CaWRKY30 σε φύλλα πιπεριάς που υπερεκφράζουν παροδικά CaWRKY40 αυξήθηκαν στους 24 και 48 ίππους σε σύγκριση με φυτά που υπερεκφράζουν προσωρινά κενό φορέα (EV) (Εικόνα 6Α), ενώ τα μεταγραφικά επίπεδα του CaWRKY40 αυξήθηκαν παροδικά σε αυτά τα φυτά υπερεκφράζουν το CaWRKY30 σε σύγκριση με φυτά που υπερεκφράζουν παροδικά EV (Εικόνα 6Β). Αντίθετα, τα αποτελέσματά μας απεικόνισαν ότι η μεταγραφική συσσώρευση του CaWRKY40 ήταν σημαντικά μειωμένη στα μολυσμένα με Ralstonia φυτά CaWRKY30- που είχαν σιγήσει σε σύγκριση με τα μη σιγασμένα φυτά (Εικόνα 6Γ). Επιπρόσθετα, η μεταγραφική συσσώρευση γνωστών γονιδίων δεικτών που συνδέονται με την ανοσία, π.χ. CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 και CaHIR1, κατεστάλη πλήρως ή εν μέρει σε φυτά που είχαν σιγήσει με CaWRKY30 που πυροδοτήθηκαν από το CaWRK40 (Εικόνα 6D).

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν μεταγραφική ρύθμιση του CaWRKY40 από το CaWRKY30 και την παρουσία ενός θετικού ρυθμιστικού βρόχου που περιλαμβάνει CaWRKY30 και CaWRKY40.

Εικόνα 6. Αλληλεπίδραση μεταξύ CaWRKY30 και CaWRKY40. Μεταγραφική έκφραση lev. EL του CaWRKY40 στα φύλλα της πιπεριάς που υπερεκφράζουν παροδικά CaWRKY30 σε χρονικό διάστημα 24 και 48 dpi (A), επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης του CaWRKY30 στα φύλλα πιπεριάς υπερεκφράζουν παροδικά CaWRKY40 σε χρονικό διάστημα 24 και 48 pi (48), Ανάλυση gRT-PCR των επιπέδων μεταγραφικής έκφρασης CaWRKY40 σε φυτά πιπεριάς CaWRKY30-σιωπηρά και μη σε 48 dpi (C)gRT-PCR των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα σε CaWRKY{{21}και μη σιγασμένα φυτά πιπεριάς που υπερεκφράζουν παροδικά 35S: CaWRKY40-HA και 35S:00στους 48 hpi (D). Ο μέσος όρος δεδομένων συν SE από τέσσερα βιολογικά αντίγραφα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τυπικά σφάλματα των μέσων. Διαφορετικά γράμματα πάνω από τις ράβδους δείχνουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων.

2.7. Διασύνδεση μεταξύ CaWRY30 και CaWRKY6, CaWRKY22 και CaWRKY27

Σε προηγούμενες μελέτες μας, το CaWRKY40 ανιχνεύθηκε ότι σχετίζεται εκφραστικά και λειτουργικά με διαφορετικά WRKY TF, όπως το CaWRKY6 και το CaWRKY22. Η σχέση μεταξύ CaWRKY30 και CaWRKY40 δείχνει ότι το CaWRKY30 πιθανώς συνδέεται με διαφορετικούς WRKY TF που εμπλέκονται στην ανοσία του πιπεριού έναντι του RSI. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση, η ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε για τη μελέτη της σχέσης μεταξύ CaWRKY30 και διαφορετικών WRKY TF που έχουν αναφερθεί προηγουμένως ότι εμπλέκονται στην ανοσία της πιπεριάς έναντι του RSI, συμπεριλαμβανομένων των CaWRKY6, CaWRKY22 και CaWRKY27. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η μεταγραφική συσσώρευση του CaWRKY30 ενισχύθηκε σε φυτά πιπεριάς που υπερέκφραζαν παροδικά CaWRKY6, CaWRKY22 και CaWRKY27 στα 48 dpi (Εικόνα 7Α), ενώ η μεταγραφική συσσώρευση των CaWRKY6, CaWRKY22-pee και CaWRKY22-pepper και CaWRKY27 ήταν επίσης υπερβολικά εκφραστική. CaWRKY30 στα 48 dpi (Εικόνα 7Β). Τα αποτελέσματά μας της ανάλυσης qRT-PCR υποδηλώνουν ότι τα CaWRKY30 και CaWRKY6, CaWRKY22 και CaWRKY27 είναι εκφραστικά και λειτουργικά αλληλένδετα.

3. Συζήτηση

Η πρωτεΐνη WRKY είναι μια από τις μεγαλύτερες οικογένειες φυτικών μεταγραφικών παραγόντων (TF). Μια ομάδα μελών της οικογένειας των WRKY TFs, που αναφέρθηκαν από τα Arabidopsis thaliana και Oryza sativa, είναι γνωστό ότι συμμετέχουν και διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ανοσίας των φυτών. Έχουν αναφερθεί σημαντικές λειτουργικές παραλλαγές μεταξύ των στενά δομικών ομολόγων των WRKY [17,48] και οι λειτουργίες των WRKY TF στην ανοσία φυτών που δεν είναι μοντέλα, όπως η πιπεριά, έχουν διερευνηθεί επαρκώς.

Το CaWRKY30, ένα γονίδιο της ομάδας Ill WRKY, έχει χαρακτηριστεί λειτουργικά στην παρούσα μελέτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CaWRKY30 ρυθμίζει θετικά την ανοσία του πιπεριού έναντι του RSl και είναι ένα ζωτικό συστατικό του ιστού WRKY που περιλαμβάνει CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 και CaWRKY40. Η εμπλοκή του CaWRKY30 στην ανοσία του πιπεριού επιβεβαιώνεται από στοιχεία cis που ανταποκρίνονται στα παθογόνα, συμπεριλαμβανομένων των στοιχείων TGA, TGACG-motifIATC-box, TATA-box και W-box που υπάρχουν στην περιοχή προαγωγέα του CaWRKY30. Αυτή η υπόθεση ήταν συνεπής με την ανοδική ρύθμιση των μεταγραφικών επιπέδων του CaWRKY30 μετά και μετά από εξωγενώς παρεχόμενα ETH, ABA και SA [49,50].

Δεδομένου ότι τα γονίδια που προκαλούνται από την έκθεση σε έναν συγκεκριμένο παράγοντα στρες είναι συχνά γνωστό ότι εμπλέκονται σε απόκριση σε αυτό το στρες [51], υποθέσαμε ότι το CaWRKY30 μπορεί να ρυθμίζει θετικά την ανοσία του πιπεριού στο RSI. Αυτή η εικασία υποστηρίχθηκε από τα δεδομένα σίγησης του CaWRKY30 από το VIGS και από τη δοκιμασία παροδικής υπερέκφρασης CaWRKY30. Αυτή η περιορισμένη ανοσία λόγω της απώλειας της λειτουργίας του CaWRKY30 συνοδεύτηκε από ενισχυμένη ανάπτυξη του RSI και μείωση των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία όπως το εξαρτώμενο από SA CaPR1 (52CaNPR1 [53], το σχετιζόμενο με JA CaDEF1 (54], το σχετιζόμενο με ABA CaABR1 [55 ], και CaHIR1 που σχετίζεται με HR (561. Από την άλλη πλευρά, ο κυτταρικός θάνατος τύπου HR και η έκκριση HO πυροδοτήθηκαν από την παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 που συνοδεύεται από μεταγραφική ανοδική ρύθμιση γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία όπως CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 και CaHIR1. Αυτό υποδηλώνει το ρόλο του CaWRKY30 ως θετικού ρυθμιστή του κυτταρικού θανάτου που μοιάζει με HR και της ανοσίας του πιπεριού έναντι του RSI. Ομοίως, έχει παρατηρηθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι το AtWRKY30, ένα ομόλογο του CaWRKY30 στο Arabidopsis, ρυθμίζει θετικά την εμφύσηση των φυτών -munitv έναντι βιοτικών και αβιοτικών τάσεων 157.581. Αυτό μπορεί να υποδηλωθεί ότι το CaWRKY30 ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από Ralstonia, οδηγώντας σε μειωμένη ευπάθεια της πιπεριάς σε μόλυνση από βακτηριακό παθογόνο.

Οι φυτοορμόνες όπως το ET, το ABA και το SA είναι απαραίτητα μόρια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην απόκριση των φυτών σε επιθέσεις παθογόνων και στρες υψηλής θερμοκρασίας. Αυτά εμπλέκονται επίσης στη διασταύρωση μεταξύ των αποκρίσεων των φυτών σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις [59]. Το SA υποκινεί την αντίσταση έναντι των βιοτροφικών παθογόνων, ενώ το ET παίζει ζωτικό ρόλο στην ανοσία των φυτών έναντι των νεκροτροφικών παθογόνων [60]. Γενικά, η σύνθεση των SA, ET και JA συνδέεται με ανοσία που προκαλείται από PAMP (PTI) ή ανοσία που προκαλείται από τελεστή (ETI). Αυτές οι φυτοορμόνες μπορούν να παίξουν το ρόλο τους τόσο συνεργιστικά όσο και ανταγωνιστικά με βάση τις συγκεντρώσεις τους κατά τη διάρκεια της αμυντικής σηματοδότησης [61]. Μια συνεργιστική συσχέτιση μεταξύ αυτών των τριών στοιχείων σηματοδότησης έχει ανιχνευθεί στο PTI, ενώ μια αντισταθμιστική συσχέτιση έχει ανιχνευθεί στο ETI [62]. Το CaWRKY30 επάγεται συνεχώς από εξωγενώς παρεχόμενες φυτορμόνες. Τα γνωστά γονίδια δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία SA, ET και ABA, όπως CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 και CaABR1, ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με σίγηση του CaWRK30. Ωστόσο, ρυθμίστηκαν προς τα πάνω από την παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 στα φυτά πιπεριάς, δείχνοντας ότι το CaWRKY30 συμμετέχει στη συνεργικά διαμεσολαβούμενη αμυντική σηματοδότηση από SA, ET και ABA, που οδηγεί σε PTI.

Η ανάλυση σε όλο το γονιδίωμα έδειξε τη συμμετοχή αρκετών WRKY TF στη φυτική ανοσία [63-65]. Σύμφωνα με μελέτες λειτουργικής γονιδιωματικής, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] και -75 [78] έχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά ως ανοσία του Arabidopsis, ρυθμίζοντας την ανοσία θετικά ή αρνητικά. Αυτά τα WRKY TF έχουν προταθεί να διατάσσονται σε έναν μεταγραφικό ιστό WRKY, που αποτελείται από βρόχους ανάδρασης plus και -ve και ενότητες τροφοδοσίας προς τα εμπρός [12]. Ωστόσο, η διαμόρφωση αυτών των δικτύων WRKY παραμένει ελάχιστα κατανοητή.

Σε προηγούμενες μελέτες, ανακαλύψαμε ότι τα CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 και CaWRKY40 είναι θετικοί ρυθμιστές της ανοσίας του πιπεριού στο RSI [9,44,45], ενώ το CaWRKY58 είναι αρνητικός ρυθμιστής [46]. Η τρέχουσα μελέτη συμπεραίνει ότι το CaWRKY30 δρα ως θετικός ρυθμιστής στον κυτταρικό θάνατο που μοιάζει με HR της πιπεριάς και στην απόκριση του πιπεριού στη μόλυνση από R. solanacearum. Τα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης του CaWRKY30 αυξήθηκαν κατά την παροδική υπερέκφραση των CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 και CaWRKY40. Αντίθετα, η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 ρύθμισε προς τα πάνω τη μεταγραφική συσσώρευση των CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 και CaWRKY40, υποδηλώνοντας την παρουσία δικτύων WRKY TFs και βρόχους ανάδρασης συν ve μεταξύ των CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, και CaWRKY2 Οι όμοιοι βρόχοι ανατροφοδότησης plus ve υποτίθεται ότι εμπλέκονται στην ανοσία των φυτών [47]. Το ίδιο είδος βρόχου ανάδρασης plus ve έχει υπάρξει μεταξύ των CaWRKY40 και CaWRKY6, CaWRKY40 και CabZIP63, CaWRKY40 και CaCDPK15. Σε προηγούμενες μελέτες, τα CaWRKY6 [44] και CabZIP63 [16] έχουν επίσης ανιχνευτεί ότι εμπλέκονται άμεσα και μεταγραφικά στη ρύθμιση της έκφρασης του CaWRKY40 έναντι του RSI. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, μπορεί να προταθεί ότι το CaWRKY40 μπορεί να συντονίζεται από διάφορα TF. Συμπερασματικά, η έκφραση του CaWRKY40 συν-ρυθμίζεται από τα CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 και CabZIP63 μετά από RSI, και η έκφραση CaWRKY40 ρυθμίζεται από CaWRKY6 και CabZIP63, αλλά όχι από CaWRKY30 στο πιπέρι μετά από έκθεση σε υψηλή θερμοκρασία.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Φυτικά Υλικά και Συνθήκες Ανάπτυξης

Οι σπόροι της ποικιλίας πιπεριάς «Mexi» και Nicotiana benthamiana ελήφθησαν από το Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Πακιστάν. Οι σπόροι πιπεριού και N. benthamiana φυτεύτηκαν σε πλαστικές γλάστρες που είχαν μίγμα εδάφους [τύρφη και περλίτης. 2/1 (v/v)] και διατηρείται σε δωμάτιο ανάπτυξης υπό ελεγχόμενες συνθήκες, π.χ. θερμοκρασία 25 ◦C, 60–70 μmol φωτόνια m−2 s −1 ένταση φωτός και 70 τοις εκατό σχετική υγρασία κάτω από 16 ώρες φως/8 h σκοτεινή φωτοπερίοδο.

4.2. Δημιουργία διανυσμάτων

Η τεχνική της πύλης-κλωνοποίησης χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία φορέων. Για την κατασκευή δορυφορικών φορέων, το CaWRKY30 ORF πλήρους μήκους (με τερματικό κωδικόνιο ή χωρίς τερματικό κωδικόνιο) κλωνοποιήθηκε στον φορέα εισόδου pDONR207 χρησιμοποιώντας μια αντίδραση ΒΡ. Στη συνέχεια, αυτό το κατασκεύασμα μεταφέρθηκε στους φορείς προορισμού pMDC83, CD3687 (HA-tag), CD3688 (Flag-tag) και Pk7WG2 εκτελώντας αντίδραση LR για τη δημιουργία φορέων για υποκυτταρικό εντοπισμό και υπερέκφραση, αντίστοιχα.

Για την κατασκευή φορέων για VIGS, επιλέχθηκε θραύσμα 364 bps σε 30 -μη μεταφρασμένη περιοχή (UTR) του CaWRKY30 και η ειδικότητα επιβεβαιώθηκε με BLAST έναντι της αλληλουχίας γονιδιώματος στη βάση δεδομένων του CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (πρόσβαση στις 29 Οκτωβρίου 2021)) και Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (πρόσβαση στις 29 Οκτωβρίου 2021)). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η αντίδραση ΒΡ για να κλωνοποιηθεί αυτό το θραύσμα στο pDONR207/201, αφού αυτό το κατασκεύασμα μεταφέρθηκε στον φορέα PYL279 με την εκτέλεση μιας αντίδρασης LR.

4.3. Διαδικασίες ανάπτυξης και εμβολιασμού του παθογόνου

Απομονώσαμε ένα συμβατό λοιμογόνο στέλεχος R. solanacearum από φυτά πιπεριάς μολυσμένα από Ralstonia από το Dera Ghazi Khan του Πακιστάν. Η μέθοδος του χλωριούχου τετραζολίου χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των εξιδρωμάτων του τμήματος του αγγειακού ιστού πάνω από το έδαφος των μολυσμένων από παθογόνο φυτών [9,45]. Το απομονωμένο R. solanacearum καλλιεργήθηκε σε μέσο SPA σε αναδευτήρα θερμικού ελέγχου (200 g πατάτας, 20 g σακχαρόζης, 3 g εκχύλισμα βοείου κρέατος, 5 g τρυπτόνης και 1 L διπλής απόσταξης H2O) στις 200 rpm και στους 28 ◦C για διανυκτέρευση. Στη συνέχεια, το καλλιεργημένο στέλεχος R. solanacearum φυγοκεντρήθηκε στις 6500 μ.μ. και στους 28 ◦C για 10 λεπτά. Το υγρό υπερκείμενο μετά τη φυγοκέντρηση χύθηκε και τα σφαιρίδια στον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης αραιώθηκαν σε αποστειρωμένο διάλυμα MgCl2 10 mM. Η πυκνότητα των βακτηριακών κυττάρων προσαρμόστηκε στα 108 cfu ml-1 (OD600=0.8).

Για να μελετηθούν οι επιδράσεις του RSI στα μεταγραφικά επίπεδα του CaWRKY30 και στην αντίσταση των φυτών πιπεριάς στην επίθεση του R. solanacearum, το επάνω τρίτο φύλλο των φυτών πιπεριάς διεισδύθηκε με 10 μL διαλύματος R. solanacearum με μια σύριγγα χωρίς βελόνα. Δείγματα φύλλων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με παθογόνο συλλέχθηκαν σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία για πειράματα ιστοχημικής χρώσης (π.χ. χρώση DAB ή χρώση μπλε τρυπανίου), ηλεκτρική αγωγιμότητα, εκχύλιση cfu και RNA για περισσότερα πειράματα. Για το πείραμα φαινοτύπου των CaWRKY30-σιαγμένων και μη σιγασμένων φυτών, οι ρίζες τραυματίστηκαν χρησιμοποιώντας μια γυάλινη ράβδο και διείσδυσαν με συμβατό λοιμογόνο R. solanacearum. Τα φυτά διατηρήθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης σε συνθήκες ελέγχου σε θερμοκρασία 28 ± 2 ◦C, 60–70 μmol φωτόνια m−2 s −1 ένταση φωτός, 70 τοις εκατό σχετική υγρασία και κάτω από 16-φως/{{12 }}h σκοτεινή φωτοπερίοδο μετά τον εμβολιασμό με R. solanacearum. Οι εικόνες του φαινοτύπου καταγράφηκαν μετά από RSI σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα.

4.4. Διαφυλλική Εφαρμογή Φυτοορμονών

Για τη μελέτη των επιδράσεων των φυτοορμονών, υγιή φυτά πιπεριάς ψεκάστηκαν με 100 μΜ ETH, 100 μΜ ABA και 1 mM SA σε τέσσερα στάδια φύλλων. Τα εικονικά φυτά (μάρτυρες) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με στείρο ddH2O. Δείγματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυτοορμόνες συλλέχθηκαν σε επιθυμητά χρονικά σημεία για εκχύλιση RNA και περαιτέρω μελέτη.

4.5. Εξέταση υποκυτταρικού εντοπισμού CaWRKY30

Κύτταρα Agrobacterium που έχουν 35S: CaWRKY30-GFP ή 35S: GFP (μάρτυρας) καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα σε ένα μέσο LB που διέθετε αντίστοιχα αντιβιοτικά. Το καλλιεργημένο μέσο φυγοκεντρήθηκε στις 6500 rpm, το υγρό υπερκείμενο χύθηκε και το ίζημα στον πυθμένα αραιώθηκε σε ένα μέσο επαγωγής (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 και 150 μΜ ακετοσυριγγόνη) και ρυθμίστηκε σε OD{{{ 10}}.8. Αγροβακτηρίδιο που περιέχει 35S: CaWRKY30-GFP και 35S: GFP εγχύθηκαν στα φύλλα του N. benthamiana χρησιμοποιώντας μια σύριγγα χωρίς βελόνα. Η μέθοδος που περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI) [9]. Στους 48 hpt, παρατηρήθηκαν σήματα φθορισμού GFP και DAPI και οι φωτογραφίες καταγράφηκαν από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (TCS SP8, Leica, Solms, Γερμανία), με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και ζώνη εκπομπής 505-530 nm φίλτρο.

4.6. Ιστοχημική χρώση

Διεξήχθη ιστοχημική χρώση (κυανό τρυπανίου και 3, 30 -διαμινοβενζιδίνη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9,11,79]. Για να πραγματοποιηθεί η δοκιμασία χρώσης με μπλε του τρυπανίου, φύλλα πιπεριού βράστηκαν σε διάλυμα μπλε τρυπάνης (10 mL γαλακτικού οξέος, 10 mL γλυκερόλης, 10 mL φαινόλης, 40 mL αιθανόλης, 10 mL ddH2O και 1 mL μπλε τρυπάνης) για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα φύλλα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 8 ώρες, βυθίστηκαν σε διάλυμα ένυδρης χλωράλης (2,5 g ένυδρης χλωράλης διαλυμένα σε 1 mL απεσταγμένου νερού) και αποχρωματίστηκαν με βρασμό για 30 λεπτά. Το διάλυμα ένυδρης χλωράλης άλλαξε πολλές φορές για να μειωθεί το υπόβαθρο και στη συνέχεια τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε 70 τοις εκατό γλυκερόλη. Τα φύλλα τοποθετήθηκαν σε 1 mg/mL διαλύματος DAB όλη τη νύχτα για δοκιμασία χρώσης DAB. Τα χρωματισμένα με DAB φύλλα βράστηκαν σε γαλακτικό οξύ:γλυκερόλη: απόλυτη αιθανόλη [1:1:3 (v/v/v)] και στη συνέχεια αποχρωματίστηκαν σε απόλυτη αιθανόλη όλη τη νύχτα [80]. Οι φωτογραφίες των φύλλων με μπλε τρυπάνι και χρωματισμένα με DAB τραβήχτηκαν με κάμερα και με μικροσκόπιο φωτός (Leica, Wetzlar, Γερμανία).

4.7. Σίγαση του CaWRKY30 μέσω γονιδιακής σίγησης που προκαλείται από ιούς (VIGS)

Ένα προηγουμένως περιγραφόμενο σύστημα γονιδιακής σίγησης (VIGS) που βασίζεται στον ιό του Κουδουνίστρα Καπνού (TRV) διεξήχθη για τη σίγαση CaWRKY30 σε φυτά πιπεριάς [47,81,82]. Κατασκευάσματα Agrobacterium GV3101 που περιέχουν PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 και PYL279-PDS (OD600=0.8) αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:1. Αυτό το μείγμα διεισδύθηκε σε κοτυληδόνες φυτών πιπεριάς 2-μιας εβδομάδας με σύριγγα χωρίς βελόνα. Τα διηθημένα φυτά επωάστηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης για 56 ώρες κάτω από σκοτάδι σε θερμοκρασία 16 ◦C και σχετική υγρασία 45 τοις εκατό, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ένα δωμάτιο ανάπτυξης σε ελεγχόμενες συνθήκες στους 25 ± 2 ◦C, 60-70 μmol φωτόνια m−2 s −1 και σχετική υγρασία 70 τοις εκατό σε φωτοπερίοδο 16 ωρών φωτός/8 ωρών σκότους.

4.8. CaWRKY30 Παροδική υπερέκφραση σε φύλλα πιπεριάς

Τα κύτταρα Agrobacterium GV3101 που περιέχουν CaWRKY30-Flag και EV καλλιεργήθηκαν σε μέσο LB σε αναδευτήρα θερμικού ελέγχου, έχοντας αντίστοιχα αντιβιοτικά κατά τη διάρκεια της νύχτας σε OD600=1.0. Στη συνέχεια, αυτά τα Agrobacterium GV3101 φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 μ.μ. και στους 28 ◦C για 10 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υγρό υπερκείμενο αφαιρέθηκε και το στερεό ίζημα στον πυθμένα αραιώθηκε σε OD600=0.8 σε ένα μέσο επαγωγής (10 mM MES, ρΗ 5.4, 10 mM MgCl2, 200 μΜ ακετοσυριγγόνη). Αυτό το μίγμα διηθήθηκε στα φύλλα με μια σύριγγα χωρίς βελόνα. Αυτά τα παροδικά υπερεκφρασμένα φύλλα παρατηρήθηκαν για κυτταρικό θάνατο που μοιάζει με HR ή συλλέχθηκαν δείγματα για να πραγματοποιηθούν πειράματα χρώσης DAB και μπλε τρυπανίου και για απομόνωση RNA για περισσότερα πειράματα.

4.9. Εκχύλιση RNA και ποσοτική RT-PCR σε πραγματικό χρόνο

Η μέθοδος αντιδραστηρίου TRIZol (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή ολικού RNA από δείγματα φύλλων επεξεργασμένων φυτών πιπεριάς και από ψευδή σπορόφυτα. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε κιτ Prime Script RT-PCR (TaKaRa, Dalian, Κίνα) για την αντιστροφή της μεταγραφής του εκχυλισμένου RNA. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση qRT-PCR σε πραγματικό χρόνο για τη μελέτη των σχετικών μεταγραφικών επιπέδων των στοχευμένων γονιδίων δεικτών. Η επεξεργασία των δεδομένων έγινε σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [45,82], με συγκεκριμένους εκκινητές (Συμπληρωματικός Πίνακας S3), χρησιμοποιώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή για σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο Bio-Rad (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) και Σύστημα SYBR premix Ex Taq II (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Εκτίμηση ΗΛΕΚΤΡΙΚΗΣ Αγωγιμότητας

Η ηλεκτρική αγωγιμότητα (διαρροή ιόντων) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές αλλαγές [44,83]. Ελήφθησαν έξι δίσκοι φύλλων (4 mm σε πλάτος) με τη χρήση ενός διατρητή. Οι δίσκοι πλύθηκαν τρεις φορές με αποστειρωμένο ddH2O και επωάστηκαν στιγμιαία σε 10 mL ddH2O. Μετά από αυτό, αυτοί οι δίσκοι φύλλων διατηρήθηκαν σε αναδευτήρα ήπιας ανακίνησης (60 rpm) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Ένας μετρητής αγωγιμότητας (Mettler Toledo 326 Mettler, Ζυρίχη, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε για την καταγραφή δεδομένων σχετικά με την ηλεκτρική αγωγιμότητα.

4.11. Immuno Blotting

Μια προηγουμένως περιγραφείσα διαδικασία ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή πρωτεΐνης από φύλλα πιπεριού [3]. Η εκχυλισμένη πρωτεΐνη επωάστηκε όλη τη νύχτα με αντιΗΑ αγαρόζη στους 4°C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Χρησιμοποιήθηκε μαγνητική ρωγμή για τη συλλογή σφαιριδίων και πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Tris (TBS) και tween 20 (0,05 τοις εκατό). Η εκλουσμένη πρωτεΐνη παρατηρήθηκε με τη χρήση ανοσοστύπωσης και αντι-ΗΑ-υπεροξειδάσης (Abcam, Cambridge, UK).

5. Συμπεράσματα

Συμπερασματικά, είμαστε της άποψης ότι το CaWRKY30 ενεργοποιεί μεταγραφικά την ανοσία του πιπεριού έναντι του RSI. Η αποσιώπηση του CaWRKY30 από το VIGS περιόρισε την ανοσία των φυτών πιπεριάς σε λοίμωξη από βακτηριακό παθογόνο, ενώ η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 προκάλεσε αντίσταση στο R. solanacearum. Συλλογικά, ο σχηματισμός ενός βρόχου θετικής ανάδρασης και η λειτουργία του παράλληλα με άλλα TFs είναι άφθονη απόδειξη της ενεργοποίησής του υπό βιοτικό στρες. Επιπλέον, προτείνουμε τη δημιουργία σταθερών διαγονιδιακών φυτών πιπεριάς CaWRKY30 και πρωτεΐνης στόχου CaWRKY30 για να εξηγήσουμε πλήρως τον ρόλο αυτού του γονιδίου έναντι βακτηριακών παθογόνων και επίσης σε διάφορες μεταβολικές οδούς.

Συνεισφορές συγγραφέα:

Conceptualization, AH, MIK, MA, BSA, ZL και ATKZ; Επιμέλεια δεδομένων, AH, MIK και AME-S.; Επίσημη ανάλυση, ZL και SF; Απόκτηση χρηματοδότησης, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. και ATKZ? Διαχείριση έργου, AH και MIK. Πόροι, AH; Επικύρωση, SM; Οπτικοποίηση, SM και SF; Γράψιμο—πρωτότυπο προσχέδιο, AH και MIK. Συγγραφή— κριτική και επεξεργασία, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF και ATKZ Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση:

Ο κύριος συγγραφέας είναι ιδιαίτερα υποχρεωμένος στην Επιτροπή Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης του Πακιστάν για οικονομική βοήθεια για την ολοκλήρωση αυτής της μελέτης στο πλαίσιο της επιχορήγησης SRGP Αρ. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Η τρέχουσα εργασία χρηματοδοτήθηκε από το Taif University Researchers Supporting Project number (TURSP2020/245), Πανεπιστήμιο Taif, Taif, Σαουδική Αραβία. Η μελέτη υποστηρίχθηκε επίσης από το Αναπτυξιακό Ταμείο Έργου του Fujian Agriculture and Forestry University (CXZX2018114, CXZX2020008A και CXZX2019024G).

Δήλωση του Συμβουλίου Θεσμικής Αναθεώρησης: Δεν ισχύει.

Δήλωση συγκατάθεσης μετά από ενημέρωση: Δεν ισχύει.

Δήλωση Διαθεσιμότητας Δεδομένων: Όλα τα δεδομένα βρίσκονται εντός του χειρογράφου και των Συμπληρωματικών Αρχείων του.4

Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Arif, Μ.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, Α.; Shahjahan, Μ.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Ο αντίκτυπος του χρόνου εφαρμογής του FosetylAluminium στην καταστολή των καρπών και στις οικονομικές αποδόσεις του σιταριού ψωμιού (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, Α.; Khan, MI; Arif, Μ.; Hussain, Α.; Ullah, R.; Irfan, Μ.; Mahpara, S.; Shah, RU; Ansari, MJ; Kintl, A. Η βαθιά τοποθέτηση αζωτούχου λιπάσματος βελτιώνει την απόδοση, την αποδοτικότητα χρήσης αζώτου και τις οικονομικές αποδόσεις του μεταφυτευμένου εκλεκτού ρυζιού. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, Α.; Hussain, Α.; Adnan, Μ.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, Μ.; Khan, KA; Ghramh, ΗΑ; He, S. Ένας νέος παράγοντας μεταγραφής MYB CaPHL8 παρέχει ενδείξεις σχετικά με την εξέλιξη της ανοσίας της πιπεριάς έναντι του παθογόνου που μεταδίδεται στο έδαφος. Microb. Pathog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, Α.; Noman, Α.; Khan, MI; Zaynab, Μ.; Aqeel, Μ.; Anwar, Μ.; Ashraf, MF; Liu, Ζ.; Raza, Α.; Mahpara, S. Μοριακή ρύθμιση της έμφυτης ανοσίας και της ανοχής στο στρες του πιπεριού: Μια επισκόπηση των WRKY TFs. Microb. Pathog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Το μεταγραφικό προφίλ αποκαλύπτει διατηρημένες και ειδικές για τα είδη αποκρίσεις άμυνας των φυτών κατά την αλληλεπίδραση του Physcomitrium patens με το Botrytis cinerea. Φυτό ΜοΙ. Biol. 2021, 1–21. [CrossRef]

6. Aerts, Ν.; Mendes, βουλευτής; van Wees, SC Πολλαπλά επίπεδα αλληλεπίδρασης σε δίκτυα ορμονών που ρυθμίζουν την άμυνα των φυτών. Plant J. 2021, 105, 489–504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Ζ.; Shi, L.; Weng, Υ.; Zou, Η.; Li, Χ.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, Χ.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 δρα ως νέος στόχος του WRKY40 για να μεσολαβήσει στην ανοσία της πιπεριάς έναντι της μόλυνσης από Ralstonia solanacearum. ΜοΙ. Αλληλεπίδραση φυτού-μικροβίου. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, Α.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Βελτιστοποίηση της γεωμετρίας φύτευσης για το σύστημα ενδοκαλλιέργειας κριθαριού-αιγυπτιακού τριφυλλιού σε ένα ημίξηρο υποτροπικό κλίμα. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, Α.; Li, Χ.; Weng, Υ.; Liu, Ζ.; Ashraf, MF; Noman, Α.; Yang, S.; Ιφνάν, Μ.; Qiu, S.; Το Yang, Y. CaWRKY22 δρα ως θετικός ρυθμιστής στην απόκριση πιπεριού στο Ralstonia solanacearum δημιουργώντας δίκτυα με CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 και CaWRKY58. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, Χ.; Somssich, IE Διευκρίνιση του ρόλου του WRKY27 στην ανδρική στειρότητα στο Arabidopsis. Σήμα εγκατάστασης. Συμπεριφορά. 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Υ.; Liu, Ζ.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, Α.; Ashraf, MF; Noman, Α.; Το Shen, L. CaWRKY40b στο πιπέρι δρα ως αρνητικός ρυθμιστής ως απόκριση στο Ralstonia solanacearum ρυθμίζοντας άμεσα τα αμυντικά γονίδια συμπεριλαμβανομένου του CaWRKY40. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, Τ.; Somssich, IE Δίκτυα παραγόντων μεταγραφής WRKY στην αμυντική σηματοδότηση. Curr. Γνώμη. Plant Biol. 2007, 10, 366-371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, Μ.; Oelmüller, R. WRKY transcription factor: Jack of many trades in plants. Σήμα εγκατάστασης. Συμπεριφορά. 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Υ.-Ρ.; Xu, Η.; Wang, Β.; Su, X.-D. Κρυσταλλικές δομές Ν-τερματικών παραγόντων μεταγραφής WRKY και σύμπλοκα DNA. Protein Cell 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Χ.; Li, C.; Wang, Η.; Guo, Z. WRKY μεταγραφικοί παράγοντες: Εξέλιξη, δέσμευση και δράση. Φυτοπαθόλη. Res. 2019, 1, 13. [CrossRef]

16. Shen, L.; Liu, Ζ.; Yang, S.; Yang, Τ.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Υ.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 δρα ως θετικός ρυθμιστής κατά τη διάρκεια της πρόκλησης Ralstonia solanacearum ή υψηλής θερμοκρασίας-υψηλής υγρασίας σε βρόχο θετικής ανάδρασης με CaWRKY40. J. Εχρ. Bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Κανονισμός Εξειδικευμένου Μεταβολισμού από Παράγοντες Μεταγραφής WRKY. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Ye, N.; Jiang, Μ.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY μεταγραφικοί παράγοντες στις αποκρίσεις των φυτών στις τάσεις. J. Integr. Plant Biol. 2017, 59, 86–101. [CrossRef]

19. Yu, Κ.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Ευεργετικά μικρόβια που υποχωρούν από την ανοσία των ριζών. Περιβάλλον Φυτικών Κυττάρων. 2019, 42, 2860–2870. [CrossRef]

20. Noman, Α.; Liu, Ζ.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, Α.; Ashraf, MF; Khan, MI; He, S. Έκφραση και λειτουργική αξιολόγηση του CaZNF830 κατά την απόκριση πιπεριού σε Ralstonia solanacearum ή υψηλή θερμοκρασία και υγρασία. Microb. Pathog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. Noman, Α.; Hussain, Α.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Ζ.; He, S. CabZIP53 στοχεύεται από το CaWRKY40 και δρα ως θετικός ρυθμιστής στην άμυνα του πιπεριού έναντι του Ralstonia solanacearum και της θερμοανοχής. Περιβάλλω. Exp. Bot. 2019, 159, 138–148. [CrossRef]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Υ.; Hussain, Α.; Noman, Α.; Khan, MI; Liu, Ζ.; Qiu, Α.; Guan, D.; et al. Το Capsicum annuum HsfB2a Ρυθμίζει θετικά την απόκριση στη μόλυνση από Ralstonia solanacearum ή τον μεταγραφικό καταρράκτη που σχηματίζει υψηλή θερμοκρασία και υψηλή υγρασία με CaWRKY6 και CaWRKY40. Plant Cell Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, Κ.; Εσύ, J.; Zhang, Υ.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, Χ.; Zhu, Χ.; Jiang, S.; et al. Η υψηλής ανάλυσης αλληλουχία χρονικής μεταγραφής αποκαλύπτει το ERF και το WRKY ως τους κύριους παίκτες στα ρυθμιστικά δίκτυα που υποκρύπτουν τις αποκρίσεις του σουσάμι στην υπερχείλιση και την ανάκτηση. Genomics 2021, 113, 276–290. [CrossRef]

24. Yang, Χ.; Zhou, Ζ.; Fu, Μ.; Han, Μ.; Liu, Ζ.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Υ.; Zhang, W.; et al. Ταυτοποίηση σε επίπεδο μεταγραφώματος των γονιδίων της οικογένειας WRKY και το προφίλ έκφρασης τους προς το σαλικυλικό οξύ στην Camellia japonica. Σήμα εγκατάστασης. Συμπεριφορά. 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez, Μ.; Babar, Μ.; Iqbal, J.; Hasnain, Μ.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. In Silico Structural and Functional Analysis of Wrky1 and Wrky3 Genes in The Selected Cereal Crops. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Υ.-Υ.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, Η.-Χ.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, Α.; et al. Το SGT1 απαιτείται σε PcINF1/SRC2-1-προκαλούμενη απόκριση άμυνας πιπεριού μέσω αλληλεπίδρασης με SRC2-1. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Biological Activities of Red Pepper (Capsicum annuum) and Its Pungent Principle Capsaicin: A Review. Κριτ. Rev. Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu, Ζ.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Υ.; Weng, Υ.; Li, Χ.; Hussain, Α.; Noman, Α.; He, S. Functional and Promoter Analysis of ChiIV3, a Chitinase of Pepper Plant, in Response to Phytophthora capsici Infection. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Ali, Μ.; Luo, D.-X.; Khan, Α.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, Η.-Χ.; Cheng, G.-X.; Μωάμεθ, Ι.; Γκονγκ, Ζ.-Η. Ταξινόμηση και ευρεία ανάλυση γονιδιώματος της οικογένειας γονιδίων πρωτεϊνών που δεσμεύουν χιτίνη στο πιπέρι (Capsicum annuum L.) και μεταγραφική ρύθμιση σε Phytophthora capsici, αβιοτικά στρες και ορμονικές εφαρμογές. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, Α.; Liu, Ζ.; Aqeel, Μ.; Zainab, Μ.; Khan, MI; Hussain, Α.; Ashraf, MF; Li, Χ.; Weng, Υ.; He, S. Βασικοί παράγοντες μεταγραφής τομέα λευκίνης φερμουάρ: Οι πρωτοπορίες στη φυτική ανοσία. Biotechnol. Κάτοικος της Λατβίας. 2017, 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com