Το CaWRKY30 ρυθμίζει θετικά την ανοσία του πιπεριού στοχεύοντας το CaWRKY40 κατά του εμβολιασμού Ralstonia Solanacearum μέσω ρυθμιστικών γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα Μέρος 1

Αφηρημένη:

Το δίκτυο των παραγόντων μεταγραφής WRKY (TFs) αποτελείται από το υποσύνολο WRKY TF, το οποίο διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ανοσίας των φυτών. Ωστόσο, οι λειτουργίες του δικτύου WRKY TF παραμένουν ασαφείς, ιδιαίτερα σε φυτά που δεν είναι μοντέλα όπως η πιπεριά (Capsicum annum L.). Αυτή η μελέτη χαρακτήρισε λειτουργικά το CaWRKY30 - μέλος της ομάδας III της πρωτεΐνης Pepper WRKY - για την ανοσία της πιπεριάς έναντι της μόλυνσης από Ralstonia solanacearum. Το CaWRKY30 ανιχνεύθηκε στον πυρήνα και τα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασής του αυξήθηκαν σημαντικά με ενοφθαλμισμό R. solanacearum (RSI), φυλλική εφαρμογή αιθυλένιο (ET), ασπισικό οξύ (ABA) και σαλικυλικό οξύ (SA). Η επαγόμενη από τον ιό γονιδιακή σίγηση (VIGS) του CaWRKY30 ενίσχυσε την ευπάθεια της πιπεριάς στο RSI.

Επιπλέον, η σίγαση του CaWRKY30 από το VIGS έθετε σε κίνδυνο τον κυτταρικό θάνατο τύπου HR που πυροδοτήθηκε από το RSI και μείωσε τα γονίδια δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα, όπως τα CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1 και CaWRKY40. Αντίθετα, η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 στα φύλλα πιπεριάς προκάλεσε κυτταρικό θάνατο που μοιάζει με HR και ρυθμίζει προς τα πάνω γονίδια δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα. Επιπλέον, η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 ρύθμισε προς τα πάνω τα μεταγραφικά επίπεδα των CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 και CaWRKY40.

Από την άλλη πλευρά, η παροδική υπερέκφραση των CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 και CaWRKY40 ρύθμισε προς τα πάνω τα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης του CaWRKY30. Τα αποτελέσματα προτείνουν ότι το πρόσφατα χαρακτηρισμένο CaWRKY30 ρυθμίζει θετικά την ανοσία της πιπεριάς έναντι της επίθεσης Ralstonia, η οποία διέπεται από συνεργική μεσολάβηση σηματοδότησης από φυτοορμόνες όπως ET, ABA και SA και αφομοιώνεται μεταγραφικά σε δίκτυα WRKY TFs, που αποτελούνται από CaWRKY27YWRKY27, CaWRKY2, CaWRKY . Συλλογικά, τα δεδομένα μας θα διευκολύνουν την εξήγηση του υποκείμενου μηχανισμού αλληλεπίδρασης μεταξύ της ανοσίας του πιπεριού και της απόκρισης στο RSI.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες παίζουν βασικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα, ελέγχοντας τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και το σχηματισμό συγκεκριμένων τύπων κυττάρων. Ακολουθεί η σχέση μεταξύ των παραγόντων μεταγραφής και της ανοσίας:

1. Παράγοντας μεταγραφής - NF-κB: Ο NF-κB είναι ένας βασικός μεταγραφικός παράγοντας που εμπλέκεται στη ρύθμιση των προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων των Τ κυττάρων και των Β κυττάρων. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ μπορεί να προάγει τη φλεγμονώδη απόκριση, την ανοσοαπόκριση και την κυτταρική απόπτωση.

2. Παράγοντες μεταγραφής—STATs: Τα STAT είναι μεταγραφικοί παράγοντες που μεσολαβούν στη σηματοδότηση του φορέα και στις κυτταρικές αποκρίσεις. Τα STAT μπορούν να ενεργοποιηθούν, να διαδραματίσουν βασικό ρόλο σε ενεργοποιημένα Τ κύτταρα και Β κύτταρα και να συμμετέχουν σε διαδικασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η ενεργοποίηση των ανοσοκυττάρων.

3. Παράγοντας μεταγραφής - AP-1: Το AP-1 είναι μια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη ρύθμιση διαφόρων κυτταρικών λειτουργιών και ανοσολογικών αποκρίσεων. Η ενεργοποίηση AP-1 μπορεί να προωθήσει διαδικασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και ο μετασχηματισμός των κυττάρων, καθώς και να διατηρήσει αντιικές και ανοσολογικές αποκρίσεις.

4. Παράγοντες μεταγραφής — CEBP: Τα CEBP είναι μια μεγάλη οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των CEBP , , , κ.λπ. σε διάφορα κύτταρα ιστών. Στο ανοσοποιητικό σύστημα, η CEBP εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των μακροφάγων και την απελευθέρωση κυτοκινών, καθώς και στη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των Β κυττάρων και των Τ κυττάρων.

Συνολικά, οι μεταγραφικοί παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσία, συμμετέχοντας στη ρύθμιση και τη διατήρηση της δραστηριότητας του ανοσοποιητικού συστήματος σε διαφορετικούς τύπους και λειτουργίες κυττάρων. Επομένως, πρέπει επίσης να προσέχουμε τη βελτίωση της ανοσίας στην καθημερινότητά μας. Το Cistanche μπορεί να ενισχύσει την ανοσία και οι πολυσακχαρίτες στο κρέας μπορούν να ρυθμίσουν την ανοσολογική απόκριση του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος, να βελτιώσουν την ικανότητα στρες των ανοσοκυττάρων και να ενισχύσουν το αποτέλεσμα της αποστείρωσης των ανοσοκυττάρων.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστανάκι

Λέξεις-κλειδιά:

πιπεριά τσίλι (Capsicum annuum); Ralstonia solanacearum; CaWRKY30; WRKY TF.

1. Εισαγωγή

Τα φυτά εκτίθενται συχνά σε διάφορες βιοτικές και αβιοτικές πιέσεις κατά τη διάρκεια της ζωής τους λόγω της ακίνητης φύσης τους [1,2]. Τα φυτά έχουν αναπτύξει αρκετούς αμυντικούς μηχανισμούς ως απάντηση στην επαναλαμβανόμενη πίεση επιλογής από σημαντικούς οικολογικούς και περιβαλλοντικούς περιορισμούς. Διαφορετικοί μεταγραφικοί παράγοντες (TF) διασυνδέονται για να αναπτύξουν εξελιγμένα μεταγραφικά δίκτυα για τη ρύθμιση αυτών των κλασικών αμυντικών μηχανισμών σε μεταγραφικό επίπεδο [3,4]. Οι αμυντικές αντιδράσεις σε διάφορες καταπονήσεις συγχρονίζονται και ελέγχονται σωστά καθώς είναι κρίσιμες για τα φυτά με τη μορφή ενεργειακής δαπάνης και ανάπτυξης [5]. Οι αμυντικοί μηχανισμοί μπορεί να διαφέρουν σε διαφορετικά είδη φυτών λόγω των ποικίλων περιβαλλοντικών συνθηκών που επηρεάζουν τον εγκλιματισμό τους [6-8].

Ως εκ τούτου, το αμυντικό σύστημα που χρησιμοποιείται από τις πρότυπες μονάδες δεν μπορεί να υπονοηθεί πλήρως για τις μη-μοντέλες εγκαταστάσεις. Ως εκ τούτου, τα αμυντικά συστήματα των φυτών έχουν αποτελέσει πρωταρχικό επίκεντρο τις τελευταίες δεκαετίες. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες επικεντρώθηκαν κυρίως σε μοντέλα φυτών, π.χ. Arabidopsis thaliana και ρύζι (Oryza sativa L.). Παρόλα αυτά, ο λειτουργικός συγχρονισμός αυτών των μεταγραφικών συμπλεγμάτων για τη ρύθμιση της απόκρισης των φυτών σε διάφορες τάσεις έχει διερευνηθεί ελάχιστα, κυρίως σε φυτά που δεν είναι μοντέλα.

Οι πρωτεΐνες WRKY αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια TF στα φυτά. Τα WRKY TF περιέχουν μία ή δύο περιοχές WRKY και συνήθως την ακολουθία WRKYGQK στο Ν-άκρο ακολουθούμενη από C2HC ή C2H2 ψευδάργυρο μοτίβο δακτύλου [4,9,10]. Οι πρωτεΐνες WRKY χωρίζονται φυλογενετικά σε τρεις κύριες ομάδες (δηλαδή, ομάδες I–III) με βάση αρκετούς τομείς WRKY και τη δομή του μοτίβου ψευδαργύρου-δακτύλου.

Η ομάδα II των WRKY TF υποδιαιρείται και πάλι σε πέντε υποομάδες (IIa, IIb, IIc, IId και IIe) [11-13]. Τα μέλη WRKY συνδέονται κυρίως με W-boxes [TTGAC(C/T)] που βρίσκονται σε περιοχές προαγωγέα διαφόρων γονιδίων-στόχων εισάγοντας μια αποκλειστική σφήνα κάθετα στην κύρια αυλάκωση του DNA [14] με το μοτίβο WRKY GQK στον δεύτερο κλώνο β, η οποία διεγείρει μεταγραφική τροποποίηση της έκφρασης των γονιδίων-στόχων [14-16]. Τα WRKY έχουν εμπλακεί σε πολλά βιολογικά συστήματα στα φυτά, συμπεριλαμβανομένου του λήθαργου των σπόρων, της βλάστησης των σπόρων, της γήρανσης και της ανάπτυξης των σπόρων. Ομοίως, εμπλέκονται επίσης στην απόκριση σε βιοτικές και αβιοτικές πιέσεις και στην αλλαγή μεταγραφής των γονιδίων-στόχων τους [17-20].

Αναφέρεται ότι μια ομάδα WRKY TF ή ένα WRKY TF που προκαλείται μεταγραφικά από μόνο ένα στρες ρυθμίζει πολλές τάσεις. Τα W-boxes εμπλουτίζονται εντός των περιοχών υποκινητή [21-24]. Αυτές οι μελέτες απεικονίζουν την παρουσία δικτύων WRKY που εμπλέκονται σε απόκριση σε ένα συγκεκριμένο άγχος ή σε συνδυασμό δύο ή περισσότερων. Ο ρόλος των πρωτεϊνών WRKY και των υποκείμενων μηχανισμών σε απόκριση σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις έχουν διερευνηθεί συχνά την τελευταία δεκαετία. Ωστόσο, η έμφαση αυτών των μελετών δόθηκε κυρίως σε ένα γονίδιο ως απόκριση σε ένα στρες σε μοντέλα φυτών, π.χ., A. thaliana και O. sativa. Πρόσφατα, έχει προταθεί μια σημαντική λειτουργική διακύμανση μεταξύ των στενών ομολόγων των WRKY TF από διάφορα είδη φυτών [24,25]. Οι λειτουργίες των WRKY και του ιστού WRKY σε μη-μοντέλα φυτά όπως το Capsicum annuum L., ως απόκριση σε μεμονωμένες ή συνδυασμένες τάσεις, έχουν διερευνηθεί ελάχιστα μέχρι τώρα.

Το πιπέρι είναι παγκοσμίως γνωστό για την οικονομική του σημασία. Σπέρνεται σε ορεινές περιοχές κατά τις εύκρατες εποχές [26,27]. Η πιπεριά εκτίθεται σε διάφορες ασθένειες που μεταδίδονται από το έδαφος, όπως η μάστιγα της πιπεριάς και η βακτηριακή μαρασμός που προκαλούνται από βακτηριακά παθογόνα, π.χ. Phytophthora capsicum και Ralstonia solanacearum, αντίστοιχα [28,29]. Η σύμπτωση αυτών των παθογόνων παραγόντων έχει καταστροφικές επιπτώσεις στην παραγωγή πιπεριάς υπό υψηλές θερμοκρασίες και υψηλή υγρασία (HTHH). Η HTHH βλάπτει την ανοσία της πιπεριάς με τη μεσολάβηση της πρωτεΐνης R και επιταχύνει την ανάπτυξη και ανάπτυξη παθογόνων. Επιπλέον, η επίθεση παθογόνου και η HTHH ασκούν ταυτόχρονα πίεση φυσικής επιλογής στην πιπεριά, η οποία έχει επηρεάσει την εξέλιξη της πιπεριάς στο παρελθόν [30-32]. Αντίθετα, η ταυτόχρονη εμφάνιση μόλυνσης από παθογόνο και HTHH μπορεί να μην επηρεάσει την εξέλιξη των μοντέλων φυτών, όπως το A. thaliana και το O. sativa. Ως εκ τούτου, το πιπέρι φαίνεται πιο κατάλληλο για έρευνα σχετικά με την ανοσία έναντι βιοτικών ή αβιοτικών στρες, π.χ. RSI ή HTHH.

Το Ralstonia solanacearum προκαλεί βακτηριακό μαρασμό σε πολλές καλλιέργειες, π.χ. πιπεριά, ντομάτα, πατάτα κ.λπ. Είναι ένα gram-αρνητικό πρωτεοβακτήριο [33]. Σχηματίζει γρήγορες αποικίες στους ιστούς του ξυλώματος, γεγονός που οδηγεί σε βακτηριακή ασθένεια μαρασμού στα προσβεβλημένα φυτά [34].

Οι αποκρίσεις των φυτικών ειδών στο βιοτικό και αβιοτικό στρες είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από φυτοορμόνες [35]. Οι φυτορμόνες είναι μικροσκοπικά μόρια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανάπτυξης των φυτών, στην αναπαραγωγή των φυτών και στην επιβίωση. Το σαλικυλικό οξύ (SA) και το ιασμονικό οξύ (JA) είναι κρίσιμα για τις ανοσολογικές αποκρίσεις των φυτικών ειδών. Αυτά τα δύο θεωρούνται ως κρίσιμα θεμέλια των ανοσολογικών αντιδράσεων των φυτών έναντι των παθογόνων. Η βιοσύνθεση και η σηματοδότηση του SA είναι ζωτικής σημασίας για την άμυνα έναντι των βιοτροφικών παθογόνων, ενώ το JA παρέχει άμυνα έναντι των νεκροτροφικών παθογόνων [36,37]. Το αιθυλένιο (ET) βοηθά στις αμυντικές αποκρίσεις έναντι πολλών αλληλεπιδράσεων φυτού-παθογόνου [37].

Διάφορες γηγενείς ποικιλίες πιπεριάς υποτροπικών περιοχών επιδεικνύουν επιταχυνόμενη αντοχή στις ασθένειες, ακόμη και υπό HTHH [38]. Η HSE του cis-στοιχείου που σχετίζεται με τη θερμότητα γενικά συνυπάρχει με φυτοορμόνες, συμπεριλαμβανομένων των SA, JA, ET, ABA ή σχετιζόμενων με παθογόνων στοιχείων cis σε περιοχές προαγωγών των περισσότερων MAPK και CDPK που εμπλέκονται στη φυτική ανοσία [39-41]. Συνιστά την παρουσία διασταύρωσης μεταξύ ανοσίας και HTHH. Το γονιδίωμα του πιπεριού είναι 27 και 7,5 φορές μεγαλύτερο σε σύγκριση με το A. thaliana και το O. sativa, αντίστοιχα. Ωστόσο, έχει μόνο 73 γονίδια WRKY, ενώ τα μικρότερα γονιδιώματα του A. thaliana και του O. sativa έχουν 72 και 122 γονίδια WRKY, αντίστοιχα [9,42,43]. Προηγουμένως εντοπίσαμε ότι τα CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45] και CaWRKY58 [46] είχαν εμπλακεί στην απόκριση του πιπεριού έναντι του RSI.

Μεταξύ αυτών, τα CaWRKY6, -22, -27 και -40 δρουν ως θετικοί ρυθμιστές της ανοσίας των φυτών, ενώ το CaWRKY58 είναι αρνητικός ρυθμιστής. Αυτά τα γονίδια διαθέτουν ένα υποσύνολο στοιχείων HSE και W-boxs στην περιοχή προαγωγέα τους και τους προαγωγείς άλλων WRKY TF, συνάγοντας τον ρόλο των δικτύων WRKY στη ρύθμιση της απόκρισης του πιπεριού έναντι του RSI. Επιπλέον, το CaWRKY40 ρυθμιζόταν άμεσα από το CaWRKY6 [44] και το CabZIP63 [16], ενώ το CaWRKY40 ρυθμίστηκε έμμεσα από το CaCDPK15 [47]. Αντίθετα, τα περισσότερα από τα WRKY TF της πιπεριάς δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί για την ανταπόκρισή τους σε επιθέσεις παθογόνων.

Στην τρέχουσα μελέτη, ένα πλήρους μήκους cDNA για την οικογένεια πιπεριών WRKY TFs απομονώθηκε και ονομάστηκε CaWRKY30. Το χαρακτηρίσαμε εκφραστικό και λειτουργικά και διαπιστώσαμε ότι το CaWRKY30 προκλήθηκε από RSI και διαφυλλική εφαρμογή SA, JA, ET και ABA. Η παροδική υπερέκφραση του CaWRKY30 στα φύλλα πιπεριάς προκάλεσε κυτταρικό θάνατο που μοιάζει με HR και παραγωγή H2O2. Η σίγαση του CaWRKY30 στο πιπέρι έθεσε σε κίνδυνο την ανοσία του πιπεριού στο RSI. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CaWRKY30 ρυθμίζει θετικά την ανοσία του πιπεριού στο RSI.

2. Αποτελέσματα

2.1. Κλωνοποίηση και Ανάλυση Αλληλουχίας του CaWRKY30

Ένα νέο γονίδιο WRKY CaWRKY30 (CA01g34480) ταυτοποιήθηκε με ανάλυση σε όλο το γονιδίωμα. Το γονίδιο CaWRKY30 επιλέχθηκε για λειτουργικό χαρακτηρισμό δεδομένου ότι η ύπαρξη cis-στοιχείων που σχετίζονται με την ανοσία, όπως το TGA (TGACG-motif-binding factor), το μοτίβο TGACG, το TATC-box, το TATAbox και το W-box στην περιοχή του προαγωγέα ρόλο στην ανοσία της πιπεριάς (Εικόνα S1). Ένα θραύσμα cDNA του CaWRKY30 (CA01g34480) 924 bp ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικούς για γονίδιο εκκινητές (Πίνακας S1). Το μήκος της συναγόμενης αλληλουχίας αμινοξέων του CaWRKY30 ήταν 307 υπολείμματα αμινοξέων, που κατείχαν συντηρημένη περιοχή WRKY, και κατηγοριοποιήθηκε στην ομάδα III (Εικόνα 1). Η προβλεπόμενη πρωτεΐνη έχει μέγεθος και θεωρητικό pI 34,55 kDa και 7,32, αντίστοιχα. Το CaWRKY30 μοιράζεται 88, 60, 68 και 57 τοις εκατό ταυτότητα αμινοξέων με τα NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53 και StWRKY53, αντίστοιχα (Εικόνα S2).

2.2. Μεταγραφική έκφραση του CaWRKY30 υπό RSI και θεραπεία με διάφορες φυτοορμόνες

Η παρουσία cis-στοιχείων που σχετίζονται με την ανοσία στην περιοχή προαγωγέα του CaWRKY30 έδειξε τον πιθανό ρόλο του στο RSI ανοσίας του πιπεριού. Για να ελεγχθεί η έννοια, διεξήχθη ανάλυση qRT-PCR για την αξιολόγηση των μεταγραφικών επιπέδων του CaWRY30 σε RSI. Τα μεταγραφικά επίπεδα του CaWRKY30 αυξήθηκαν σε φύλλα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ralstonia σε σύγκριση με φύλλα που υποβλήθηκαν σε ψεύτικη επεξεργασία (Εικόνα 2Α). Τα ενισχυμένα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης CaWRKY30 ήταν συνεπή μεταξύ 0 h και 48 h μετά τη θεραπεία (HPT). Τα υψηλότερα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης καταγράφηκαν στους 48 hpt (Εικόνα 2Α).

Οι φυτοορμόνες, συμπεριλαμβανομένων των οδών σηματοδότησης ET, ABA, SA και JA, είναι βασικοί ρυθμιστές των αντιδράσεων των φυτών σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις. Η ρύθμιση του CaWRKY30 από τα μονοπάτια σηματοδότησης που διαμεσολαβούνται από φυτοορμόνες μελετήθηκε με εφαρμογή φυλλώματος ET, ABA, SA και JA χρησιμοποιώντας ανάλυση qRT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα σχετικά επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης του CaWRKY30 αυξήθηκαν από 0 h σε 48 hpt με 100 μΜ ET σε σύγκριση με το ψευδές. Αυτά τα μεταγραφικά επίπεδα ήταν υψηλότερα στους 48 hpt με ET (Εικόνα 2Β). Η διαφυλλική εφαρμογή 100 μΜ ABA αύξησε σημαντικά τα μεταγραφικά επίπεδα του CaWRKY30 σε σύγκριση με την εικονική. Τα επίπεδα μεταγραφής έφτασαν στο υψηλότερο επίπεδο στους 12 ίππους με το ABA (Εικόνα 2Γ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεταγραφική συσσώρευση του CaWRKY30 αυξήθηκε σημαντικά μετά την εφαρμογή 1 mM SA, σε σύγκριση με την εικονική. Αυτά τα ενισχυμένα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης ήταν τα υψηλότερα στους 24 hpt (Εικόνα 2D).

Σχήμα 2. Η ανάλυση qRT-PCR των επιπέδων σχετικής μεταγραφικής έκφρασης CaWRKY30 σε φύλλα πιπεριάς που υποβλήθηκαν σε ενοφθαλμισμό Ralstonia solanacearum (RSI) και διαφυλλική εφαρμογή διαφόρων φυτοορμονών. Η ανάλυση qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο των μεταγραφικών επιπέδων του CaWRKY30 σε φύλλα πιπεριάς που υποβλήθηκαν σε διάφορες επεξεργασίες όπως RSI (A), εφαρμογή 100 μm ET (B), εφαρμογή 100 μm ABA (C) και εφαρμογή 1 mM SA (D) σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Η μεταγραφική αφθονία σε φύλλα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με RSI συγκρίθηκε με τα φύλλα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MgCl2 -(mock), των οποίων το σχετικό επίπεδο έκφρασης ορίστηκε σε "1". (B–D) Τα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης σε φύλλα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυτοορμόνη συγκρίθηκαν με φύλλα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ddH2O (mock), των οποίων το επίπεδο έκφρασης ορίστηκε σε "1". Το ύψος της ράβδου υποδεικνύει μέσο όρο και οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα των μέσων. Διαφορετικά γράμματα πάνω από τις ράβδους δείχνουν μια σημαντική διαφορά μεταξύ των μέσων που βασίζονται στο προστατευμένο τεστ LSD του Fisher.

2.3. Το CaWRKY30 βρέθηκε να εντοπίζεται στον πυρήνα

Η ανάλυση αλληλουχίας με χρήση WoLFPSORT απεικόνισε ότι η προβλεπόμενη αλληλουχία πρωτεΐνης CaWRKY30 διαθέτει ένα υποτιθέμενο σήμα πυρηνικού εντοπισμού (Εικόνα 1), που δείχνει την πιθανή στόχευση στον πυρήνα. Για να επικυρωθεί αυτή η αντίληψη, δημιουργήθηκε ένα κατασκεύασμα σύντηξης aCaWRKY30 GFP που οδηγήθηκε από έναν συστατικό υποκινητή του CaMV35S. Κατόπιν, αυτός ο συσταθείς φορέας μεταφέρθηκε στο στέλεχος GV3101 Agrobacterium. Υπερεκφράσαμε παροδικά το κατασκεύασμα CaWRKY30 GFP σε φύλλα Nicofiamabenthamiana με έγχυση A. tumefacient και τα σήματα GFP εξετάστηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. Τα αποτελέσματα απεικόνισαν ότι τα σήματα GFP του CaWRKY30-GFP ήταν παρόντα στους πυρήνες, ενώ το GFP του ελέγχου ανιχνεύθηκε σε διάφορα υποκυτταρικά τμήματα, όπως το κυτταρόπλασμα και οι πυρήνες (Εικόνα 3).

Εικόνα 3. Υποκυτταρικός εντοπισμός του CaWRKY30. Το CaWRKY30 έχει πλήρως εντοπιστεί στον πυρήνα των φύλλων nicotiana benthaminna. Το πράσινο χρώμα δείχνει GFP Το μπλε χρώμα δείχνει τη χρώση DAPI του πυρήνα. Το κυανό χρώμα δείχνει τη σύντηξη πράσινου CFP και μπλε πυρήνων που έχουν χρωματιστεί με DAPI. CPP signaGreen) για τον έλεγχο, ανιχνεύθηκαν φύλλα N. benthamiana σε όλο το κύτταρο. Οι εικόνες καταγράφηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό. Μπάρες=25 um.

2.4. Σίγαση του CaWRKY30 από την VIGS Περιορισμένη ανοσία του πιπεριού σε RSI και γονίδια δεικτών που σχετίζονται με μειωμένη ανοσία.

Το CaWRKY30 αποσιωπήθηκε με γονιδιακή σίγαση που προκαλείται από ιούς (VIGS) για να μελετηθεί ο ρόλος του στην ανοσία του πιπεριού. Αποκτήθηκαν συνολικά 50 CaWRKY30-μη σιγασμένα (TRV:00) και 50 CaWRKY30- σιγασμένα φυτά (TRV: CaWRKY30). Έξι CaWRKY30 σιγασμένα φυτά επιλέχθηκαν τυχαία για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητά τους στη γονιδιακή σίγηση με εμβολιασμό ρίζας με κύτταρα συμβατού λοιμογόνου στελέχους R. solanacearum. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι τα μεταγραφικά επίπεδα του CaWRKY30 μειώθηκαν κατά ~ 30 τοις εκατό σε φυτά που είχαν υποστεί επεξεργασία με Ralstonia σε σιγασμένα φυτά CaWRKY30 σε σύγκριση με μη σιγασμένα φυτά, επικυρώνοντας τη σίγαση του CaWRKY30 (Εικόνα 4Α).

Τα σιγασμένα φυτά CaWRKY30 έδειξαν σημαντικά υψηλότερη ευαισθησία στο RSI σε σύγκριση με τα μη σιγασμένα φυτά. Η ευαισθησία του πιπεριού στο παθογόνο αυξήθηκε δείχνοντας μια αύξηση στην αύξηση του πληθυσμού Ralstonia, που χαρακτηρίζεται από υψηλότερες τιμές cfu στα σιγασμένα φυτά πιπεριάς CaWRKY30 σε σύγκριση με τα μη σιγασμένα φυτά στις 3 ημέρες και 5 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (dpi) (Εικόνα 4Β). Έγινε ανάλυση ιστοχημικής χρώσης για την ανίχνευση της παραγωγής H2O2 και της κυτταρικής νέκρωσης σε φύλλα πιπεριάς με ενοφθαλμισμένα με Ralstonia CaWRKY30 (TRV: CaWRKY30) και μη σιγασμένα (TRV:00). Μια σκούρα χρώση DAB (σημάδι παραγωγής H2O2) και ο κυτταρικός θάνατος που μοιάζει με HR που υποδηλώνεται από σκούρα χρώση με μπλε τρυπανίου παρατηρήθηκαν σε μη σιγασμένα φύλλα πιπεριού στους 48 hpi (ώρες μετά τον εμβολιασμό). Αντίστροφα, οι συγκεντρώσεις του κυανού τρυπάνης και της χρώσης DAB μειώθηκαν σημαντικά στα φύλλα πιπεριάς που έχουν σιγήσει CaWRKY30 (Εικόνα 4Γ). Η ηλεκτρική αγωγιμότητα - ένας δείκτης διαρροής ιόντων - υπολογίστηκε για τη μελέτη της βλάβης της πλασματικής μεμβράνης και του κυτταρικού θανάτου μετά από RSI.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα μη σιγασμένα φυτά που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RSI εμφάνισαν υψηλότερη διαρροή ιόντων από τα φυτά που είχαν υποστεί επεξεργασία με CaWRKY30 στα 24 και 48 dpi (Εικόνα 4D). Ο σχετικός δείκτης ασθενειών υπολογίστηκε έως και 10 dpi για να συναχθεί το επίπεδο της νόσου σε φυτά CaWRKY30-αποσιωπημένα και μη σιγασμένα μετά από RSI (Συμπληρωματικός Πίνακας S2). Σημαντικά συμπτώματα ασθένειας παρατηρήθηκαν σε φυτά που είχαν σιγήσει με CaWRKY30 στα 10 dpi, ενώ τα μη σιγασμένα φυτά εξέφρασαν λίγα συμπτώματα ασθένειας (Εικόνα 4Ε). Επιλέχθηκαν τυχαία έξι CaWRKY30-σιωπηρά και μη σιγασμένα φυτά και διείσδυσαν με R. solanacearum στις ρίζες για τον προσδιορισμό φαινοτύπου. Εμφανή συμπτώματα ασθένειας μαρασμού παρατηρήθηκαν στην πιπεριά CaWRKY30 στα 10 dpi, ενώ τα φυτά που δεν είχαν σιγήσει εξέφρασαν πολύ αδύναμα συμπτώματα μαρασμού (Εικόνα 4ΣΤ). Η ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τη μελέτη της μεταγραφικής συσσώρευσης γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία και τα αποτελέσματα εξέφρασαν ότι τα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία όπως CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 και CaHIR1 μειώθηκαν στο CaWRKY{{ 25}}σιγασμένα φυτά σε σύγκριση με μη σιγασμένα φυτά στα 48 dpi (Εικόνα 4G).

Εικόνα 4. Η σίγαση του CaWRKY30 από το VIGS περιόρισε την αντίσταση του πιπεριού στο RSI και ρυθμίζει προς τα πάνω τα γονίδια δεικτών που σχετίζονται με την ανοσία. Η δοκιμασία qRT-PCR των εκφραστικών επιπέδων CaWRKY30 σε φυτά εμβολιασμένα με R. solanacearum, εικονικά (ενοφθαλμισμένα με διάλυμα MgCl2) CaWRKY30-σιωπηρή πιπεριά (TRV: CaWRKY30) και φυτά ελέγχου (TRV:00) (ΕΝΑ). Η διαφορά στην ανάπτυξη του R. solanacearum μεταξύ CaWRKY{10}}σιαγμένων και μη σιγασμένων (μάρτυρα) φυτών πιπεριάς που εμβολιάστηκαν με R. solanacearum στα 3 και 5 dpi (B). Ιστοχημική χρώση (χρώση DAB και μπλε τρυπανίου) σε φύλλα πιπεριού CaWRKY30-αποσιωπημένα (TRV: CaWRKY30) και μη σιγασμένα (TRV:00) εμβολιασμένα με R. solanacearum στα 48 dpi. Γραμμή κλίμακας=50 μm (C). Μέτρηση διαρροής ηλεκτρολυτών ως αγωγιμότητα ιόντων για την αξιολόγηση των αποκρίσεων κυτταρικού θανάτου στους δίσκους φύλλων CaWRKY30-σιωπημένων (TRV: CaWRKY22) και μη σιγασμένων (TRV:00) φυτών πιπεριάς στους 24 και 48 hpi με και χωρίς R. solanacearum (D). Το CaWRKY30-σίγαση από το VIGS ενίσχυσε την ευαισθησία των φυτών πιπεριάς στη μόλυνση από R. solanacearum.

Ο δείκτης ασθενειών κλιμακώθηκε σημαντικά με την πάροδο του χρόνου. Τα φυτά CaWRKY30-σιωπηρά (TRV: CaWRKY30) εξέφρασαν υψηλή ευαισθησία στη μόλυνση από R. solanacearum σε σύγκριση με φυτά που δεν σίγησαν (TRV:00). Οι μέσοι όροι βασίζονται σε τέσσερα βιολογικά αντίγραφα με πέντε φυτά ανά αναπαραγωγή (E). Η φαινοτυπική επίδραση της θεραπείας με R. solanacearum σε φυτά πιπεριάς CaWRKY30-σιωπηρά (TRV: CaWRKY30) και μη σιγασμένα (TRV:00) στα 10 dpi (F). Προσδιορισμός qRT-PCR μεταγραφικών επιπέδων γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα σε φυτά πιπεριάς CaWRKY{11}}σιαγμένα (TRV: CaWRKY30) και μη σιγασμένα (TRV:00) 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό με R. solanacearum (G). Το σχετικό επίπεδο μεταγραφικής έκφρασης των μη σιγασμένων φυτών που υποβλήθηκαν σε ψευδή αγωγή ορίστηκε σε "1". Το ύψος της ράβδου υποδεικνύει μέσο όρο και οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα των μέσων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± SE από τέσσερα βιολογικά αντίγραφα. Διαφορετικά γράμματα πάνω από τις ράβδους δείχνουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων.

For more information:1950477648nn@gmail.com