Ποντίκια καρβοξυπεπτιδάσης Ε υπό όρους νοκ-άουτ παρουσιάζουν ελλείμματα μάθησης και μνήμης και νευροεκφυλισμό Μέρος 1

Η καρβοξυπεπτιδάση Ε (CPE) είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη με πολλές μη ενζυματικές λειτουργίες σε διάφορα συστήματα. Προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούσαν ποντίκια με νοκ-άουτ CPE έδειξαν ότι το CPE έχει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα κατά του στρες και εμπλέκεται στη μάθηση και τη μνήμη.

Η αντίσταση στο στρες και η μνήμη είναι δύο αχώριστες πτυχές. Είτε πρόκειται για δουλειά, είτε για σπουδές, είτε για ζωή, θα αντιμετωπίσουμε κάθε είδους πίεση. Μερικές φορές, αυτά τα στρες μπορεί να μας κάνουν να νιώθουμε κατάθλιψη, άγχος, κούραση και ακόμη και να επηρεάσουν τη μνήμη μας. Σε αυτή την περίπτωση, πρέπει να βρούμε κάποιους τρόπους για να βελτιώσουμε την αντίσταση στο στρες και τη μνήμη μας.

Πρώτον, η βελτίωση της ανοχής στο στρες μπορεί να επιτευχθεί μέσω της άσκησης. Έρευνες δείχνουν ότι η άσκηση μπορεί να βοηθήσει τους ανθρώπους να μειώσουν το άγχος και την κατάθλιψη. Επιπλέον, η κατάλληλη άσκηση μπορεί επίσης να προωθήσει το μεταβολισμό, να βελτιώσει τον ύπνο και να ενισχύσει τη φυσική κατάσταση. Όλα αυτά βοηθούν στη βελτίωση της ανοχής στο στρες και της μνήμης μας.

Δεύτερον, η ψυχολογική συμβουλευτική είναι επίσης ένα αποτελεσματικό μέσο για τη βελτίωση της αντίστασης στο στρες. Όταν αντιμετωπίζετε δυσκολίες και αποτυχίες, επικοινωνήστε αμέσως με την οικογένεια ή τους φίλους σας για να απελευθερώσετε τα εσωτερικά άσχημα συναισθήματά σας και να μειώσετε το ψυχολογικό σας βάρος, ώστε να αντιμετωπίσετε καλύτερα την πίεση και τις προκλήσεις.

Επιπλέον, οι καλές συνήθειες ύπνου είναι επίσης απαραίτητες για τη βελτίωση της μνήμης και της αντίστασης στο στρες. Ο κακός ύπνος μπορεί να οδηγήσει σε σωματική κόπωση, κατάθλιψη και απώλεια μνήμης. Επομένως, πρέπει να αναπτύξουμε καλές συνήθειες ύπνου, να διασφαλίζουμε επαρκή χρόνο ύπνου κάθε βράδυ και να διασφαλίζουμε την ποιότητα του ύπνου.

Τέλος, η θετική στάση είναι επίσης κρίσιμη. Πρέπει να διατηρήσετε μια καλή στάση, να συνεχίσετε να μαθαίνετε και να βελτιώνετε τις δεξιότητές σας, να αντιμετωπίζετε ενεργά τις προκλήσεις, να διατηρείτε μια αισιόδοξη στάση όταν αντιμετωπίζετε δυσκολίες και να πιστεύετε ότι μπορείτε να ξεπεράσετε την πίεση και να πετύχετε.

Εν ολίγοις, η αντίσταση στο στρες και η μνήμη είναι δύο στενά συνδεδεμένες πτυχές. Μέσω της άσκησης, της ψυχολογικής συμβουλευτικής, των καλών συνηθειών ύπνου και της θετικής στάσης, μπορούμε να βελτιώσουμε αποτελεσματικά την ικανότητά μας να αντέχουμε το στρες και τη μνήμη και να αντιμετωπίζουμε καλύτερα διάφορες προκλήσεις στη ζωή και την εργασία. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό που έχει πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του κιμά προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με διάφορους τρόπους.

Κάντε κλικ στο Μάθετε 10 τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη

Ωστόσο, οι λειτουργίες του CPE στους νευρώνες είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Εδώ χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα Camk2a-Cre για να χτυπήσουμε υπό όρους τους νευρώνες CPE. Τα ποντίκια άγριου τύπου, CPEflox/− και CPEflox/flox απογαλακτίστηκαν, επισημάνθηκαν στο αυτί και κόπηκαν με την ουρά για γονότυπο σε ηλικία 3 εβδομάδων και υποβλήθηκαν σε δοκιμές ανοιχτού πεδίου, αναγνώρισης αντικειμένων, λαβύρινθο Υ και προσαρμογής φόβου στις 8 εβδομάδων.

Τα ποντίκια CPEflox/flox είχαν φυσιολογικό σωματικό βάρος και μεταβολισμό γλυκόζης. Οι δοκιμές συμπεριφοράς έδειξαν ότι τα ποντίκια CPEflox/flox είχαν μειωμένη μάθηση και μνήμη σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου και CPEflox/-. Παραδόξως, η περιοχή του υποκοιλίου (Sub) των ποντικών CPEflox/flox εκφυλίστηκε πλήρως, σε αντίθεση με τα CPE full knockout ποντίκια, τα οποία εμφανίζουν νευροεκφυλισμό της περιοχής CA3. Επιπλέον, η ανοσοχρώση με διπλή κορτίνη πρότεινε ότι η νευρογένεση στην οδοντωτή έλικα του ιππόκαμπου μειώθηκε σημαντικά σε ποντικούς CPEflox/flox.

Είναι ενδιαφέρον ότι η φωσφορυλίωση TrkB στον ιππόκαμπο ήταν μειωμένη σε ποντίκια CPEflox/flox, αλλά τα επίπεδα νευροτροφικού παράγοντα που προέρχονται από τον εγκέφαλο δεν ήταν. Τόσο στον ιππόκαμπο όσο και στον ραχιαίο έσω προμετωπιαίο φλοιό, παρατηρήσαμε μειωμένη έκφραση MAP2 και GFAP σε ποντικούς CPEflox/flox. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης καταδεικνύουν ότι συγκεκριμένο νευρωνικό knockout CPE οδηγεί σε ποντίκια δυσλειτουργίας του κεντρικού νευρικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων ελλειμμάτων μάθησης και μνήμης, υποεκφυλισμού του ιππόκαμπου και μειωμένης νευρογένεσης.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η καρβοξυπεπτιδάση Ε (CPE), επίσης γνωστή ως νευροτροφικός παράγοντας- 1, είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη με πολλές βασικές μη ενζυμικές λειτουργίες στο ενδοκρινικό και το νευρικό σύστημα [1]. Το CPE είναι εμπλουτισμένο σε ώριμα εκκριτικά κυστίδια και παίζει κρίσιμο ρόλο στη βιοσύνθεση πεπτιδικών ορμονών και νευροπεπτιδίων [2]. Το CPE δρα επίσης ως υποδοχέας ταξινόμησης πολλών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης της προϊνσουλίνης, της προεγκεφαλίνης, της προ-οπιομελανοκορτίνης και του νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται από τον εγκέφαλο (pro-BDNF) [3].

Μια φυσική μετάλλαξη φαινοτύπου παχυσαρκίας ποντικού, που ονομάζεται "λίπος", έχει χαρτογραφηθεί στο γονίδιο CPE [4]. Μια μεταγενέστερη μελέτη έδειξε ότι τα ποντίκια CPEfat/fat και CPE-knockout (KO) εμφάνισαν παρόμοιους φαινότυπους, συμπεριλαμβανομένης της στειρότητας και της παχυσαρκίας των ενηλίκων [5]. Έχει αναφερθεί ότι το ανθρώπινο γονίδιο CPE έχει μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων μηδενικών μεταλλάξεων, μεταλλάξεων που αποδίδουν κολοβωμένες πρωτεΐνες και εκείνων που έχουν εξαλειφθεί τα βασικά καταλυτικά κατάλοιπα [6].

Τα ομόζυγα άτομα με σοβαρές μεταλλάξεις είναι νοσηρά παχύσαρκα και έχουν υπογοναδισμό. Επιπροσθέτως, έχει βρεθεί πολυμορφισμός κακής έννοιας CPE σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2. Η μετάλλαξη μεταβάλλει τη δραστηριότητα του ενζύμου CPE και οι ασθενείς εμφανίζουν πρώιμη έναρξη του διαβήτη τύπου 2 [7]. Επιπλέον, η CPE διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη φυσαλιδώδη μεταφορά, όπως φαίνεται στους ενδοιπποκαμπικούς νευρώνες και τις συνάψεις [8].

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι υψηλά επίπεδα CPE εκφράζονται στον ιππόκαμπο και έχουν νευροτροφικό ρόλο, ανεξάρτητα από την ενζυματική του δραστηριότητα στην προστασία από τον επαγόμενο από το στρες θάνατο πυραμιδικών νευρώνων και γνωστική εξασθένηση [9, 10]. Το άγχος βλάπτει τη δομή και τη λειτουργία μιας σειράς εγκεφαλικές περιοχές [11].

Ο προμετωπιαίος φλοιός (PFC) είναι ο κύριος νευροπαθολογικός στόχος του στρες, ο οποίος συνδέεται με πολυάριθμες υποφλοιώδεις περιοχές του φλοιού και συμβάλλει στις γνωστικές λειτουργίες[12, 13]. Ο ραχιαίος έσω PFC (dmPFC) περιλαμβάνει τον ροστρονομικό πρόσθιο περιφερικό φλοιό και τον προκαταρκτικό φλοιό, οι οποίες είναι περιοχές που εμπλέκονται στη ρύθμιση του πόνου, των συναισθημάτων και της γνώσης. Έχει αποδειχθεί ότι η λειτουργική αδρανοποίηση του dmPFC προκαλεί αρνητικά συναισθήματα και μειώνει τη γνωστικότητα [14]. Η δραστηριότητα των νευρώνων dmPFC μεταφέρει πληροφορίες σχετικά με προηγούμενες επιλογές και αποτελέσματα, και η αφαίρεση του dmPFC ή η απενεργοποίηση επηρεάζει την καθοδήγηση υπόδειξης [15].

Επιπλέον, το άγχος οδηγεί σε εξασθένηση των νευρικών δικτύων, γνωστική δυσλειτουργία, εκφύλιση του ιππόκαμπου και μειωμένη νευρογένεση [10]. Οι πυραμιδικοί νευρώνες στο dmPFC και στον ιππόκαμπο παρουσιάζουν ατροφία και το ψυχοκοινωνικό στρες και το στρες περιορισμού προκαλούν ατροφία μέσα σε περίπου 3-4 εβδομάδες [11, 16]. Οι θεμορφολογικές αλλαγές ποικίλλουν ανάλογα με την περιοχή του εγκεφάλου. Το χρόνιο στρες οδηγεί σε δενδριτική συστολή και μειώνει τη νωτιαία πυκνότητα στην προκαταρκτική περιοχή του dmPFC και του ιππόκαμπου [17].

Η επαγόμενη από το στρες μείωση της πολυπλοκότητας του ιππόκαμπου κορυφαίου δενδρίτη είναι σύμφωνη με τις εξασθενημένες λειτουργίες του ιππόκαμπου, όπως η μάθηση και η μνήμη [18]. Επιπλέον, ο νευρωνικός τραυματισμός και η απόπτωση στην περιοχή CA3 οδηγούν σε ελλείμματα χωρικής μνήμης [19]. Συμπεριφορικά, έχει βρεθεί ότι το στρες βλάπτει διάφορες λειτουργίες που εξαρτώνται από τον ιππόκαμπο, όπως η μνήμη [20].

Το CPE διαμορφώνεται κάτω από διαφορετικά είδη στρες και είναι σημαντικό για την προστασία των νευρώνων. Οι νευρώνες στον ιππόκαμπο και τον φλοιό ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση της CPE μετά από ισχαιμικό στρες, το οποίο σχετίζεται με την επιβίωση των νευρώνων [21].

Επιπλέον, μετά τα ποντίκια CPEknockout (KO) που έλαβαν ένα παράδειγμα στρες όταν απογαλακτίστηκαν σε ηλικία 3 εβδομάδων, εμφάνισαν εκφυλισμό της περιοχής CA3 και μειωμένη νευρογένεση στην οδοντωτή έλικα (DG)[1, 22].

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα κοινό σύστημα Camk2aCre, ειδικό για νευρώνες, για να διαγράψουμε το CPE του νευρώνα. Δημιουργήσαμε ένα μοντέλο ποντικού CPE conditionalKO (cKO) για να μελετήσουμε τον φαινότυπο απώλειας λειτουργίας του CPE σε νευρώνες του εγκεφάλου. Αξιολογήσαμε την επίδραση του παραδείγματος στρες (απογαλακτισμένοι, κολλημένοι στο αυτί και κόψιμο της ουράς) σε ποντίκια CPE-cKO ηλικίας 3 εβδομάδων. Χρησιμοποιήσαμε τεστ αναγνώρισης αντικειμένων, λαβύρινθο Υ και ελέγχου του φόβου σε ηλικία 8-10 εβδομάδων για να αξιολογήσουμε τη γνωστική απόδοση. Επιπλέον, αναλύσαμε τους φαινοτύπους των νευρώνων και των αστροκυττάρων, καθώς και τη νευρογένεση στον ιππόκαμπο.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Των ζώων

Τα ποντίκια Camk2a-Cre και τα ποντίκια CPEflox/flox ελήφθησαν από την CyagenBiosciences (Suzhou, Κίνα). Όλα τα ζώα στεγάστηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (22 βαθμοί ± 2 βαθμοί) με φυσικό κύκλο φωτός/σκότους και επέτρεψαν ελεύθερη πρόσβαση σε καθαρό νερό και τυπική τροφή τρωκτικών. Τα Camk2a-Cre και CPEflox/floxmice αναφέρονται ως ποντίκια CPE-cKO. Στην ηλικία των 3 εβδομάδων, τα ποντίκια απογαλακτίστηκαν, κολλήθηκαν με αυτιά και κόπηκαν οι ουρές τους για γονότυπο, προκαλώντας ένα παράδειγμα συναισθηματικού και σωματικού στρες. Αναφερόμαστε στο Camk2a-Cre. Ποντίκια CPEflox/flox ως CPEcKO, Camk2a-Cre; Τα ποντίκια CPEflox/− ως ετερόζυγα (HE) και CPE−/− ποντίκια aswild type (WT). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες για τα ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Πειραματικών Ζώων στο Πανεπιστήμιο Minzu της Κίνας.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Οι ουρές που κόπηκαν συλλέχθηκαν για να απομονωθεί DNA για PCR για να ταυτοποιηθεί ο γονότυπος. Οι αλληλουχίες εκκινητών είναι οι εξής:

Σωματικό βάρος

Τα ποντίκια WT, CPEflox/− και CPEflox/flox (ηλικίας 1–20 εβδομάδων, n=10 για κάθε γονότυπο) ζυγίζονταν κάθε εβδομάδα, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των αλλαγών βάρους. Το βάρος κάθε ποντικιού υπολογίστηκε κατά μέσο όρο για κάθε ομάδα.

Γλυκόζη πλάσματος

Το φλεβικό αίμα από τις ουρές του ποντικού συλλέχτηκε και ανιχνεύθηκε από το Σύστημα Παρακολούθησης Γλυκόζης Αίματος (Yuwell, Κίνα) μετά από νηστεία για 12 ώρες. Ελήφθησαν δείγματα αίματος από την ουραία φλέβα σε 0 λεπτά για γλυκόζη πλάσματος νηστείας. Στη συνέχεια, κάθε ποντίκι εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά με 1 g/kg διάλυμα γλυκόζης. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τη γλυκόζη του πλάσματος για 15,30, 60, 90 και 120 λεπτά για να μετρήσουμε τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα.

Τεστ συμπεριφοράς

Για την αξιολόγηση της συμπεριφοράς των ποντικιών WT, CPEflox/− και CPEflox/flox, ζώα ηλικίας 8–10- εβδομάδων υποβλήθηκαν σε δοκιμές ανοιχτού πεδίου, αναγνώρισης αντικειμένων, λαβύρινθου Υ και ελέγχου φόβου.

Ανοιχτό πεδίο

Η διερευνητική συμπεριφορά μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανοιχτού πεδίου (50 × 50 × 40 cm). Κάθε ζώο τοποθετήθηκε σε μια γωνία της συσκευής και μετρήθηκε για 7 λεπτά. Η απόσταση που διανύθηκε καταγράφηκε για τα τελευταία 5 λεπτά με σύστημα απεικόνισης βίντεο (Taimeng, Chengdu, Κίνα).

Αναγνώριση αντικειμένου

Το τεστ αναγνώρισης αντικειμένων χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της μάθησης και της μνήμης σε ποντίκια. Την ημέρα της εκπαίδευσης, δύο πανομοιότυπα αντικείμενα τοποθετήθηκαν στη διαγώνιο μιας συσκευής (50 × 50 × 40 cm). Τα ζώα αφέθηκαν να εξερευνήσουν ελεύθερα για 7 λεπτά. Για τη διαδικασία δοκιμής, ένα αντικείμενο αντικαταστάθηκε με ένα νέο αντικείμενο στην ίδια διαγώνιο με την ημέρα προπόνησης. Τα ζώα αφέθηκαν να εξερευνήσουν ελεύθερα για 7 λεπτά. Ο χρόνος εξερεύνησης στα 2–3 cm γύρω από το νέο αντικείμενο καταγράφηκε τα τελευταία 5 λεπτά.

Υ λαβύρινθος

Η διερευνητική δραστηριότητα και η μνήμη εργασίας μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή Υ-λαβυρίνθου (μήκος βραχίονα: 30 cm, πλάτος βραχίονα: 6 cm, ύψος τοιχώματος: 15 cm). Κάθε ζώο τοποθετήθηκε στην κεντρική περιοχή. Ο αριθμός και οι αλλαγές των εισόδων στους βραχίονες καταγράφηκαν για 7 λεπτά με ένα σύστημα απεικόνισης βίντεο (Taimeng, Chengdu, Κίνα). Το αποτέλεσμα υπολογίστηκε ως ο αριθμός διόρθωσης/συνολικός αριθμός εισόδου βραχίονα.

Προετοιμασία φόβου

Η ρύθμιση φόβου αποτελείται από δύο θαλάμους και το παγωμένο μόνιτορ (23 × 23 × 30 cm) τοποθετήθηκε σε ένα μεγαλύτερο ηχομονωμένο δωμάτιο (30 × 30 × 37 cm). Το κιβώτιο παρακολούθησης κατάψυξης περιείχε ένα μεταλλικό πλέγμα για χτυπήματα στα πόδια και καταγράφηκαν οι κάθετες και οριζόντιες κινήσεις των ζώων. Η πρώτη μέρα ήταν προπόνηση αντανακλαστικών υπό συνθήκες. Η διαδικασία ήταν η εξής: αδράνεια για 60 δευτερόλεπτα και μετά διέγερση 12 φορές.

Τα περιεχόμενα της διέγερσης περιελάμβαναν ένα ρυθμισμένο ερέθισμα 30 δευτερολέπτων (75 dB), ακολουθούμενο από ένα διάστημα ίχνους (30 s) και τελείωσε με ένα σοκ ποδιών 2 δευτερολέπτων (30 mA) και 15 δευτερόλεπτα αδράνειας. Έξι ώρες αργότερα, διεξήχθη το τεστ βραχυπρόθεσμης μνήμης και ο αριθμός των ερεθισμάτων μειώθηκε σε 6. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διέγερσης, κάθε δοκιμή αποτελούνταν από το ρυθμισμένο ερέθισμα που ακολουθήθηκε από ένα διάστημα ίχνους (30 δευτερόλεπτα) και τελείωσε χωρίς να χορηγηθεί το σοκ στο πόδι.

Το τεστ μακροπρόθεσμης μνήμης πραγματοποιήθηκε την επόμενη ημέρα με μεσοδιάστημα μίας ημέρας. Η μέθοδος ήταν η ίδια με αυτή της βραχυπρόθεσμης μνήμης για τη μέτρηση της ποιότητας της μακροπρόθεσμης μνήμης.

For more information:1950477648nn@gmail.com