Βιοδοκιμασία για την παρακολούθηση της αντιγηραντικής επίδρασης της θεραπείας αίματος ομφάλιου λώρου

Επικοινωνία:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Τμήμα Βιοτεχνολογίας, College of Life Science, Πανεπιστήμιο CHA, Gyeonggi-do 13488, Δημοκρατία της Κορέας

2. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, USA

3. Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA *Αυτοί οι συγγραφείς συνεισέφεραν εξίσου.

Αντίστοιχος συγγραφέας: Hakho Lee, PhD. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, USA. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Τμήμα Βιοτεχνολογίας, College of Life Science, Πανεπιστήμιο CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Δημοκρατία της Κορέας. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της άδειας Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Δείτε http://ivyspring.com/terms για τους πλήρεις όρους και προϋποθέσεις.

Λήψη: 04.10.2018; Αποδοχή: 2018. 11. 18; Δημοσίευση: 01.01.2019

Το Cistanche έχει αντιγηραντική δράση

Αφηρημένη

Ιστορικό: Η θεραπεία ηλικιωμένων ζώων με πλάσμα πρώιμου αναπτυξιακού σταδίου (π.χ. πλάσμα ομφάλιου λώρου) έδειξε μια εντυπωσιακή δυνατότητα να επιβραδύνει την υποβάθμιση των νευρωνικών και γνωστικών λειτουργιών που σχετίζεται με την ηλικία. Ωστόσο, η μετάφραση τέτοιων ευρημάτων στην κλινική πραγματικότητα απαιτεί αποτελεσματικούς τρόπους για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Οι ιδανικές μέθοδοι θα πρέπει να είναι ελάχιστα επεμβατικές, επιδεκτικές για σειριακές αναλύσεις, οικονομικά αποδοτικές και ποσοτικές.

Μέθοδοι: Αναπτύξαμε μια νέα προσέγγιση βιοαισθητήρα για την παρακολούθησηαντι γήρανσηθεραπεία. Προχωρήσαμε σε δύο βασικά στοιχεία αισθητήρα: i) ένας μεταβολίτης που μεταφέρεται στο αίμα αναγνωρίστηκε ως υποκατάστατος δείκτης γήρανσης. και ii) αναπτύχθηκε ένα συμπαγές και οικονομικά αποδοτικό σύστημα ανάλυσης για επιτόπιες εφαρμογές. Αντιμετωπίσαμε ηλικιωμένα ποντίκια είτε με πλάσμα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου είτε με φυσιολογικό ορό. αμερόληπτο προφίλ μεταβολίτη στο πλάσμα ποντικού αποκάλυψε το αραχιδονικό οξύ (AA) ως ισχυρό δείκτη που σχετίζεται με τηναντι γήρανσηαποτέλεσμα. Στη συνέχεια εφαρμόσαμε έναν ανταγωνιστικό μαγνητοηλεκτροχημικό αισθητήρα (cMES) βελτιστοποιημένο για ανίχνευση ΑΑ απευθείας από το πλάσμα. Η αναπτυγμένη πλατφόρμα θα μπορούσε να ανιχνεύσει ΑΑ απευθείας από μικρούς όγκους πλάσματος (0,5 µL) εντός 1,5 ώρας.

Αποτελέσματα: οι δοκιμασίες cMES επιβεβαίωσαν μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων ΑΑ καιαντιγηραντική δράση: Τα επίπεδα ΑΑ, ενώ μειώνονταν με τη γήρανση, αυξήθηκαν στα ηλικιωμένα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με πλάσμα, τα οποία παρουσίασαν επίσης βελτιωμένη απόδοση μάθησης και μνήμης.

Συμπεράσματα: Η πλατφόρμα cMES θα ενδυναμώσει τόσο την προληπτική όσο και την κλινικήαντι γήρανσηέρευνα με τη δυνατότητα ελάχιστα επεμβατικής, διαχρονικής επιτήρησης θεραπείας· αυτές οι ικανότητες θα επιταχύνουν την ανάπτυξηαντι γήρανσηθεραπείες, βελτιώνοντας την ποιότητα της ατομικής ζωής.

Λέξεις κλειδιά: Αντιγήρανση, Αραχιδονικό οξύ, Προφίλ μεταβολίτη, Μαγνητοηλεκτροχημικός αισθητήρας, Βιοαισθητήρας

Εισαγωγή

Η γήρανση αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ως κλινικός παράγοντας κινδύνου για γνωστικό εκφυλισμό (π.χ. νευροεκφυλισμός, άνοια) και άλλες χρόνιες ασθένειες (π.χ. καρκίνος, καρδιαγγειακές παθήσεις, μυϊκή εκφύλιση) [1]. Με την επέκταση της ανθρώπινης ζωής και τον αυξανόμενο πληθυσμό των ηλικιωμένων, γίνονται σημαντικές προσπάθειες για την αποσαφήνιση των μηχανισμών γήρανσης [1-3] και για την εύρεση θεραπευτικών στρατηγικών για την επιβράδυνση ή ακόμα και την αναστροφή των διαδικασιών γήρανσης [4]. Πράγματι, έχουν αναφερθεί πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα από μελέτες σε ζώα. Τα ενήλικα ποντίκια που έλαβαν μετάγγιση πλάσματος από νεαρά ποντίκια ανέκτησαν τη γνωστική λειτουργία, τη συναπτική πλαστικότητα και τη νευρωνική δραστηριότητα [5]. Ταχεία ανάπτυξη σεαντι γήρανσηαναμένονται θεραπείες και η μετάφρασή τους σε δοκιμές σε ανθρώπους [6]. Ωστόσο, οι τρέχουσες μετρήσεις για την παρακολούθηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας έχουν περιορισμένη πρακτικότητα, καθώς οι μέθοδοι είναι συχνά δύσκολο να εφαρμοστούν με ανθρώπους (π.χ. επεμβατική απεικόνιση εγκεφάλου, ελεγχόμενη παρατήρηση συμπεριφοράς) και υποκειμενικές (π.χ. ερωτηματολόγια για τις εμπειρίες των ασθενών). Μια βασική προϋπόθεση για την πρόοδοαντι γήρανσηΈτσι, οι θεραπείες έγκεινται στην ανάπτυξη ποσοτικών, ελάχιστα επεμβατικών δοκιμασιών για την παρακολούθηση της θεραπείας.

Σκεφτήκαμε ότι οι μεταβολίτες θα ήταν μια ισχυρή πηγή γιααντι γήρανσηβιοδείκτες. Οι μεταβολίτες είναι ένας βασικός φαινότυπος σε έναν οργανισμό και μελετώνται ως διαγνωστικοί βιοδείκτες για άλλες ασθένειες [7]. Συγκεκριμένα, η γήρανση συνήθως συνδέεται με μεταβολικές αλλαγές ή δυσλειτουργία, η οποία επηρεάζει τα συνολικά προφίλ μεταβολιτών στους οργανισμούς. Ως εκ τούτου, είναι κατανοητό ότι η ανίχνευση της σύνθεσης και/ή των επιπέδων των μεταβολιτών θα πληροφορούσε την αποτελεσματικότητα τουαντι γήρανσηθεραπευτική αγωγή. Επιπλέον, οι αναλύσεις μεταβολιτών, ιδιαίτερα με τη μορφή εξετάσεων αίματος, θα μπορούσαν να είναι ποσοτικές και ελάχιστα επεμβατικές. Αυτά τα πλεονεκτήματα θα διευκόλυναν την εφαρμογή διαφορετικών θεραπευτικών σχημάτων ή ομάδων ασθενών και την παρακολούθηση της δυναμικής (αντι-)γήρανσης μέσω σειριακής δειγματοληψίας.

Εδώ περιγράφουμε μια νέα στρατηγική βιοαισθητήρα για παρακολούθησηαντι γήρανσηθεραπευτική αγωγή. Δύο βασικά στοιχεία προηγήθηκαν: i) ένας μεταβολίτης που μεταδίδεται από το αίμα αναγνωρίστηκε ως υποκατάστατος δείκτης γήρανσης. και ii) ένα γρήγορο, οικονομικά αποδοτικό σύστημα ανάλυσης αναπτύχθηκε για εφαρμογές σε κλινικές συνθήκες ρουτίνας. Συγκεκριμένα, αντιμετωπίσαμε μια ομάδα ηλικιωμένων ποντικών (περίπου 2 ετών) με πλάσμα από ανθρώπινο ομφάλιο αίμα. Ολοκληρωμένες μεταβολομικές αναλύσεις σε αίμα ποντικού αποκάλυψαν ότι το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ), του οποίου το επίπεδο μειώθηκε σημαντικά με τη γήρανση, αυξήθηκε αντίστροφα στην ομάδα που έλαβε θεραπεία. Αυτή η παρατήρηση μας οδήγησε να επινοήσουμε έναν μαγνητοηλεκτροχημικό αισθητήρα για μικρούς μοριακούς στόχους: βελτιστοποιήσαμε μια ανταγωνιστική ηλεκτροχημική αντίδραση όπου το AA συλλαμβανόταν σε μαγνητικά σφαιρίδια και συγκεντρώθηκε για μεγαλύτερη ευαισθησία. Η αναπτυγμένη πλατφόρμα μπορούσε να ανιχνεύσει ΑΑ απευθείας από μικρούς όγκους πλάσματος (0,5 µL) εντός 1,5 ώρας. Χρησιμοποιώντας αυτήν την πλατφόρμα, θα μπορούσαμε να δημιουργήσουμε περαιτέρω μια θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων ΑΑ στο αίμα και της καλύτερης απόδοσης των ζώων στην κινητική εργασία.

Αποτελέσματα

Θεραπεία ενήλικων ποντικών με πλάσμα αίματος ομφάλιου λώρου Το Σχήμα 1α δείχνει το συνολικό σχήμα πειράματος.

Ως παράγοντας, χρησιμοποιήσαμε πλάσμα που προέρχεται από δείγματα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα ηλικιωμένα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με πλάσμα νεαρών ποντικών ανέκτησαν τη λειτουργία της χωρικής μνήμης και η συστηματική χορήγηση πλάσματος ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος βελτίωσε την εξαρτώμενη από τον ιππόκαμπο γνωσιακή ικανότητα σε ηλικιωμένα ποντίκια [5, 8]. Η έγχυση πλάσματος, το οποίο στερείται κυτταρικών συστατικών, ελαχιστοποίησε τον κίνδυνο απόρριψης του ανοσοποιητικού που προέρχεται από αναντιστοιχία ειδών. Ηλικιωμένοι ποντικοί (ηλικία έναρξης, ηλικίας 18 μηνών) τυχαιοποιήθηκαν και έλαβαν είτε πλάσμα (ομάδα θεραπείας) είτε ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού (μια εικονική ομάδα) μέσω ένεσης με ουρά (130 μL, βλέπε Εικ. S1 για λεπτομέρειες). Ως θετικός έλεγχος, χρησιμοποιήθηκαν νεαρά ποντίκια (ηλικίας 3 μηνών). Το πλάσμα που προέρχεται από το αίμα του ομφάλιου λώρου δεν συγκεντρώθηκε και σε κάθε ποντίκι εγχύθηκε επανειλημμένα πλάσμα από τον ίδιο δότη (Εικ. S1). Μετά από μια 4-εβδομαδιαία θεραπεία, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε τεστ συμπεριφοράς (δηλαδή, rotarod) και λήφθηκε αίμα για αναλύσεις.

Εικόνα 1. Πειραματικός σχεδιασμός. Το πλάσμα ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος χορηγήθηκε σε νεαρές (3-μηνών), ηλικιωμένες (20- και 23-μηνών) και ηλικιωμένες ομάδες που έλαβαν θεραπεία με πλάσμα (20- και 23-μηνών). Οι τρεις ομάδες υποβλήθηκαν σε 2-δοκιμαστικά τεστ Rotarod για τη μέτρηση του κινητικού συντονισμού και της μάθησης. Το μη στοχευμένο προφίλ μεταβολίτη πραγματοποιήθηκε στο αίμα από τις τρεις ομάδες και τις περισσότερεςαντι γήρανση-το σχετικό μονοπάτι προσδιορίστηκε μέσω μιας βιοπληροφορικής προσέγγισης. Ο βιοαισθητήρας αναπτύχθηκε για να ανιχνεύει τον πιο σημαντικό μεταβολίτη της οδού.

Σχήμα 2. Προσδιορισμός βιοδεικτών μεταβολίτη που σχετίζονται με θεραπεία πλάσματος ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος. (Α) Παγκόσμιο προφίλ της διαταραχής του μεταβολίτη. Οι σειρές αντιστοιχούν σε χαρακτηριστικά (ένας μοναδικός συνδυασμός τιμής m/z και χρόνου συγκράτησης) από LC/MS και στήλες σε δείγματα. Οι σειρές είναι ιεραρχικά ομαδοποιημένες. (Β) Διάγραμμα βαθμολογίας PCA για μείωση διαστάσεων. Τα δείγματα σχεδιάστηκαν με βάση το κύριο συστατικό (PC) 1 και 2. Οι τιμές στις παρενθέσεις των υπομνημάτων του άξονα είναι αναλογίες διακύμανσης που εξηγούνται από αυτά τα στοιχεία. Το PC1 πιθανότατα εξηγεί τα αντιγηραντικά αποτελέσματα, δεδομένου ότι η ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με πλάσμα ήταν πολύ πιο κοντά στη νεαρή ομάδα παρά στην ψευδή ομάδα. (Γ) Ανάλυση εμπλουτισμού μονοπατιού. Οι μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν με αντιστοίχιση των μετρούμενων τιμών m/z με πληροφορίες μοριακής μάζας. Κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει ένα συγκεκριμένο μονοπάτι που βρέθηκε. Για μια δεδομένη οδό, η θέση x ή το μέγεθος του κύκλου αντιστοιχεί στη σχετική μεταξύ τους κεντρική θέση (ένα μέτρο της επίδρασης της οδού) των μεταβολιτών και η θέση ή το χρώμα y (χαμηλότερες τιμές p για το κόκκινο και υψηλότερες για το μπλε) στο βαθμό που ποιοι μεταβολίτες υπερεκπροσωπούνται. Τα κυρίαρχα μονοπάτια έχουν υψηλότερες τιμές x και y. Συνεπώς, ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος (ΑΑ) αναγνωρίστηκε ως η πιο πιθανή οδός για την εξήγηση τηςαντιγηραντικές επιδράσειςτου πλάσματος του αίματος του ομφάλιου λώρου.

Μεταβολικές αναλύσεις σε δείγματα αίματος ποντικών

Πραγματοποιήσαμε αρχικά ένα αμερόληπτο προφίλ μεταβολίτη μικρού μορίου σε πλάσμα ποντικού. Δείγματα αίματος και από τις τρεις ομάδες ποντικών υποβλήθηκαν σε υγρή χρωματογραφία και αναλύσεις φασματομετρίας μάζας (LC/MS). Επεξεργάσαμε τα δεδομένα m/z από το MAIT (εργαλειοθήκη αυτόματης αναγνώρισης μεταβολίτη) και εντοπίσαμε στατιστικά σημαντικά χαρακτηριστικά μέσω ANOVA (8572 μοναδικοί συνδυασμοί m/z και χρόνου διατήρησης) (Εικ. 2α). Η ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης (HCA) των μεταβολιτών αποκάλυψε δύο βασικά μοτίβα: i) τα προφίλ μεταβολιτών ήταν σαφώς διαφορετικά μεταξύ ηλικιωμένων (χωρίς θεραπεία) και νεαρών ποντικών. και ii) το προφίλ των ηλικιωμένων ποντικών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με πλάσμα ήταν πιο κοντά σε αυτό των νεαρών ποντικών.

Η ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) αποκάλυψε εγγενείς δομές μεταβολομικών δεδομένων (Εικ. 2β). Περίπου το 50 τοις εκατό των συνολικών παραλλαγών εξηγούνταν από το πρώτο (PC1) και το δεύτερο κύριο στοιχείο (PC2). Και οι τρεις κοόρτες (δηλαδή, νεαρές, ομάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πλάσμα και ψευδείς ομάδες) εγκαταστάθηκαν σε διακριτές θέσεις, υποδεικνύοντας ότι εντοπίστηκαν βιολογικά σχετικά χαρακτηριστικά για τη διαφοροποίηση των τάξεων της ομάδας. Είναι ενδιαφέρον ότι η ηλικιωμένη ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με πλάσμα απομακρύνθηκε από την απάτη προς τη νεαρή ομάδα. Για να ποσοτικοποιήσουμε τον διαχωρισμό ομάδων, υπολογίσαμε την ιεραρχική ομαδοποίηση στα δύο κύρια στοιχεία. Στο δενδρογράφημα, οι νεαρές ομάδες και οι ομάδες που έλαβαν πλάσμα συγκεντρώθηκαν σε χαμηλότερο επίπεδο ανομοιότητας (ή υψηλότερο επίπεδο ομοιότητας, 1120,9) από ό,τι η ομάδα που δεν έλαβε αγωγή (3162,5) (Εικ. S2). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι επιλεγμένα χαρακτηριστικά (μεταβλητές ή σειρές στο Σχ. 2α) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να συναχθεί ο βιοδείκτης μεταβολίτη που σχετίζεται με τη γήρανση καιαντι γήρανση. Σημειώσαμε τα χαρακτηριστικά με γνωστούς μεταβολίτες χρησιμοποιώντας μια βάση δεδομένων στο δημόσιο τομέα [9].

Αξιολογήσαμε περαιτέρω τις λειτουργίες και τη διασύνδεση των προσδιορισμένων μεταβολιτών, εφαρμόζοντας χαρτογράφηση KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10]. Για ένα δεδομένο μονοπάτι, μετρήσαμε i) την υπερεκπροσώπηση ενός υποψήφιου μεταβολίτη και ii) τη σημασία του (δηλαδή, τη μεταξύ τους κεντρική θέση) [11] ως βασικό ενδιάμεσο κόμβο μεταξύ ζευγών άλλων μεταβολιτών (βλ. Μέθοδοι για λεπτομέρειες). Βρήκαμε ότι ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος (ΑΑ) ήταν η πιο υπερεκπροσωπούμενη οδός (η υψηλότερη τιμή y στο Σχήμα 2γ) και οι μεταβολίτες σε αυτό το μονοπάτι έτειναν να εντοπίζονται σε μονοπάτια επικοινωνίας (υψηλές τιμές x στο Σχήμα 2γ) και διέπει τη ροή πληροφοριών. Μεταξύ πολλών μεταβολιτών στον μεταβολισμό της ΑΑ, επιλέξαμε την ίδια την ΑΑ ως βιοδείκτη. Ως αρχική είσοδος στο μονοπάτι, το ΑΑ από μόνο του μπορεί να είναι αντιπροσωπευτικό άλλων διαταραγμένων μεταβολιτών.

Ανταγωνιστικός μαγνητοηλεκτροχημικός αισθητήρας (cMES) για ανίχνευση ΑΑ στο πλάσμα

Στη συνέχεια ξεκινήσαμε να προωθήσουμε ένα γρήγορο, επιτόπιο σύστημα ανάλυσης για ανίχνευση ΑΑ. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε την τεχνολογία μαγνητοηλεκτροχημικής ανίχνευσης [12-17]. Συνδυάζει τον εμπλουτισμό και την ανίχνευση στόχου σε μια ενιαία πλατφόρμα: μαγνητικά σφαιρίδια (MBs) χρησιμοποιούνται για τη σύλληψη και την επισήμανση μοριακών στόχων και οι στόχοι που συνδέονται με σφαιρίδια ανιχνεύονται μέσω ηλεκτροχημικής ανίχνευσης. Αυτή η προσέγγιση έχει πολλά πρακτικά πλεονεκτήματα: i) τα φυσικά δείγματα (πλάσμα ή αίμα) μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας χωρίς να απαιτείται καθαρισμός δείγματος. ii) η ανάλυση επιτυγχάνει υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης μέσω μαγνητικού εμπλουτισμού και ενίσχυσης ενζυματικού σήματος. iii) με βάση το σχήμα ηλεκτρικής ανίχνευσης, οι αισθητήρες μπορούν εύκολα να μικροποιηθούν ως φορητή συσκευή (Εικ. 3α).

Ωστόσο, η ανίχνευση ΑΑ μέσω της μαγνητοηλεκτροχημικής ανίχνευσης αποτελούσε μια τεχνική πρόκληση. Δεδομένου ότι το ΑΑ είναι ένα μικρό μόριο (~304,5 Da), οι ανοσοδοκιμασίες που χρησιμοποιούν ένα ζεύγος αντισωμάτων ΑΑ ήταν δύσκολο να εφαρμοστούν. Εξερευνήσαμε έτσι μια ανταγωνιστική μορφή δοκιμασίας (cMES, ανταγωνιστικός μαγνητοηλεκτροχημικός αισθητήρας) που απαιτούσε μόνο ένα μόνο αντίσωμα ΑΑ (Εικ. 3β). Για τη σύλληψη του στόχου, επικαλύψαμε τα MB με αντισώματα ΑΑ (MBAb). Παρασκευάσαμε επίσης έναν ανταγωνιστικό παράγοντα (AA-HRP) με σύζευξη ΑΑ με ένα οξειδωτικό ένζυμο (υπεροξειδάση χρένου, HRP). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε μια μορφή απτενίου. ΑΑ συζευγνύεται σε αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) και περαιτέρω συζευγμένη HRP με τον φορέα BSA (Εικ. S3). Για τον προσδιορισμό cMES, δείγματα αίματος αναμίχθηκαν με MBAb και AA-HRP. Η ποσότητα του AA-HRP ήταν αρκετή για να κορεσθούν οι θέσεις δέσμευσης ΑΑ στο MBAb (Μέθοδοι). Αυτό θα οδηγούσε σε διαφορική φόρτωση HRP στα MB, ανάλογα με τις ενδογενείς ποσότητες ΑΑ στα δείγματα. Η διαδοχική προσθήκη ενός χρωμογόνου μεσολαβητή ηλεκτρονίων (3,3',5,5'-τετραμεθυλβενζιδίνη, TMB) παρήγαγε ένα ηλεκτρικό ρεύμα που διαβάστηκε από ένα επίπεδο ηλεκτρόδιο. Ο χρόνος αντίδρασης για τη σύλληψη ΑΑ και την επώαση TMB βελτιστοποιήθηκε για να μεγιστοποιηθεί το επίπεδο σήματος (Εικ. S4).

Σχήμα 3. Ανταγωνιστικός μαγνητοηλεκτροχημικός αισθητήρας (cMES) για τον προσδιορισμό ΑΑ. (Α) Σχηματικό σχέδιο συσκευής. Η συσκευή cMES έχει μικρό αποτύπωμα και προσφέρει

επιτόπιες λειτουργίες. (Β) Επινοήσαμε έναν ανταγωνιστικό ηλεκτροχημικό προσδιορισμό για την ανίχνευση ΑΑ. Τα μαγνητικά σφαιρίδια (MBAb) συζεύχθηκαν με αντισώματα κατά του ΑΑ.

Τα δείγματα ελέγχου περιείχαν μόνο AA-HRP και αναμίχθηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια. Τα δείγματα δοκιμής αναμίχθηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια και AA-HRP. (Γ) Ηλεκτρικά ρεύματα

μετράται από τη φορητή συσκευή ανάγνωσης cMES. Στον προσδιορισμό cMES, το μέγεθος του ρεύματος μειώνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης AA [AA]. Το σήμα από το χειριστήριο

δείγμα όρισε τη γραμμή βάσης για [AA]=0 ng/mL. Ως αναλυτική μέτρηση χρησιμοποιήθηκε η τρέχουσα διαφορά (ΔI) μεταξύ του μάρτυρα και των στοχευόμενων δειγμάτων πλάσματος. (ΡΕ)

Γνωστές ποσότητες ΑΑ αυξήθηκαν στον ορό και μετρήθηκαν με το cMES. Το όριο ανίχνευσης ήταν ~ 126 ng/mL. (Ε) το cMES και το ELISA συγκρίθηκαν για

συμφωνία. Τα αποτελέσματα και από τις δύο μεθόδους έδειξαν καλή συμφωνία (R2=0.959). Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SEM από μετρήσεις εις τριπλούν.

Εικόνα 4. Μετρήσεις ΑΑ σε δείγματα πλάσματος. (Α) Ανάλυση χρονικής πορείας του επιπέδου ΑΑ ποντικού μετά την ένεση στο πλάσμα. Κάναμε ένεση 13{{1{{0}} μL πλάσματος (συγκέντρωση AA=7.2 μg/mL) σε ποντικούς (n=6) και συλλέξαμε αίμα ποντικών μετά από 3, 7 και 14 ημέρες. Στη συνέχεια παρακολουθήθηκαν τα επίπεδα ΑΑ στο αίμα ποντικών. Τα επίπεδα ΑΑ αυξήθηκαν σημαντικά την 3η ημέρα και επέστρεψαν στα φυσιολογικά επίπεδα μετά από 7 ημέρες. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (β)="" δείγματα="" πλάσματος="" ποντικού="" αναλύθηκαν.="" στην="" ομάδα="" ελέγχου="" (n="5)," νεαρά="" ποντίκια="" (ηλικίες,="" 5="" και="" 8="" μηνών)="" είχαν="" υψηλότερα="" επίπεδα="" αα="" από="" τα="" ηλικιωμένα="" ποντίκια="" που="" έλαβαν="" εικονική="" θεραπεία="" (ηλικίες,="" 20="" και="" 23="" μηνών,="" n="8)." για="" την="" ομάδα="" που="" έλαβε="" πλάσμα="" (n="5)," παρατηρήθηκε="" παρατεταμένη="" αύξηση="" της="" αα.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (γ)="" δείγματα="" πλάσματος="" από="" τις="" ίδιες="" κοόρτες="" όπως="" στο="" (β)="" αναλύθηκαν="" με="" φασματομετρία="" μάζας.="" τα="" επίπεδα="" αα="" έδειξαν="" παρόμοια="" τάση="" όπως="" μετρήθηκε="" από="" το="" cmes.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" τα="" δεδομένα="" εμφανίζονται="" ως="" μέσος="" όρος="" ±="">

Ως αποτέλεσμα της ανταγωνιστικής δοκιμασίας, το μέγεθος του ηλεκτρικού ρεύματος μειώθηκε με υψηλότερες συγκεντρώσεις AA στο πλάσμα ([AA]). Ως εκ τούτου, ετοιμάσαμε ένα δείγμα ελέγχου επωάζοντας το MBAb μόνο με AA-HRP. Το δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό της ανώτερης γραμμής βάσης (δηλ. [AA]=0 ng/mL) για τον υπολογισμό των διαφορών σήματος. Μετρήθηκαν τα ηλεκτρικά ρεύματα από τον έλεγχο και το δείγμα πλάσματος και η καθαρή διαφορά |∆I |=|Icontrol - Iplasma|ελήφθη (Εικ. 3γ). Τέτοιος

Οι διαφορικές μετρήσεις αντιστάθμισαν επίσης το κοινό σήμα φόντου.

Το πείραμα τιτλοδότησης (Εικ. 3δ) με τη χρήση δειγμάτων με ακίδα με ποικίλες ποσότητες ΑΑ αποκάλυψε το όριο ανίχνευσης (LOD) ως -125,9 ng/mL. Το LOD της δοκιμασίας ήταν ~300- φορές χαμηλότερο από την τυπική συγκέντρωση ΑΑ των (38 μg/ml) στο πλάσμα νεαρών ποντικών (5 μήνες, n=2). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, αραιώσαμε τα αρχικά δείγματα πλάσματος (100-πλάσιο) προσθέτοντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα (βλ. Μέθοδοι). Το σήμα από τη μη ειδική δέσμευση ήταν κοντά σε ένα εγγενές επίπεδο υποβάθρου (~43 nA), δυνητικά επωφελούμενο από τον υψηλό παράγοντα αραίωσης. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι τα αποτελέσματα της ανάλυσης ταιριάζουν με αυτά από τη συμβατική ELISA (R2=0.961, Εικ. 3e). Η δοκιμασία cMES, ωστόσο, ήταν ταχύτερη (1 ώρα) από την ELISA (4 ώρες), κυρίως λόγω της κινητικής ταχείας δέσμευσης. στο cMES, τα MB συλλαμβάνουν AA σε ολόκληρο τον όγκο του δείγματος (3-διαστατική διάχυση), ενώ η σύλληψη AA βασίζεται σε 1-διάχυση διαστάσεων στην ELISA που βασίζεται σε πλάκες.

Παρακολούθηση ΑΑ σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με πλάσμα

Εφαρμόσαμε cMES για να αναλύσουμε τα επίπεδα ΑΑ σε ποντίκια μετά από μία μόνο θεραπεία με πλάσμα. Δεδομένου ότι το ΑΑ υπάρχει φυσικά στο ανθρώπινο ομφάλιο αίμα, η ένεση πλάσματος θα αυξήσει επιπρόσθετα τα επίπεδα ΑΑ ποντικού. Η μέση συγκέντρωση ΑΑ από έξι διαφορετικά πλάσμα ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος ήταν 7,2 ± 0,5 μg/mL (μέση τιμή ± SEM). Κάναμε ένεση 130 µL πλάσματος ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε ποντίκια (n=6) και παρακολουθήσαμε τα επίπεδά τους ΑΑ (Εικ. 4α). Η ένεση στο πλάσμα αύξησε αμέσως τα επίπεδα ΑΑ στο αίμα (ημέρα 3, p < 0,01,="" σε="" σύγκριση="" με="" όλα="" τα="" άλλα="" χρονικά="" σημεία),="" αλλά="" το="" αποτέλεσμα="" ήταν="" προσωρινό.="" τα="" επίπεδα="" αα="" επέστρεψαν="" στο="" φυσιολογικό="" 7="" ημέρες="" μετά="" τη="" θεραπεία="" (p="0.34," σε="" σύγκριση="" με="" το="" χρονικό="" σημείο="" πριν="" από="" την="" ένεση="" στο="">

Στη συνέχεια παρακολουθούμε τα επίπεδα ΑΑ στο πλάσμα μετά το πλήρες πρόγραμμα θεραπείας (Εικ. S1). Χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές κοόρτες ποντικιών: μια ομάδα ηλικιωμένων που έλαβαν θεραπεία με πλάσμα (n {= 8) και μια εικονική (n=8) ηλικιακές ομάδες (20-23 μηνών) και μια νεαρή ομάδα ελέγχου (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Θεραπεία με πλάσμα που οδηγεί σε βελτίωση της γνωστικής και της συμπεριφοράς σε ηλικιωμένα ποντίκια

Αξιολογήσαμε περαιτέρω τους φαινοτύπους συμπεριφοράς των ζωικών κοορτών, ιδιαίτερα αξιολογώντας τις λειτουργίες κινητικής μάθησης και μνήμης. Πραγματοποιήσαμε {{0}}δοκιμαστικές δοκιμές rotarod 1 και 4 μήνες μετά τη θεραπεία με πλάσμα ή εικονική θεραπεία (Εικ. 5α). Η καθυστέρηση (χρόνος λειτουργίας) ενός ποντικιού πριν πέσει σε μια περιστρεφόμενη ράβδο χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της κινητικής απόδοσης του ζώου. Σε 1 μήνα μετά τη θεραπεία (20-μηνών), η λανθάνουσα περίοδος τόσο της εικονικής όσο και της ομάδας που έλαβαν πλάσμα ήταν σημαντικά χαμηλότερη (p < 0,0001)="" από="" αυτή="" των="" νέων="" (5-μηνών="" )="" ομάδα="" (εικ.="" 5β).="" η="" ομάδα="" που="" έλαβε="" πλάσμα,="" ωστόσο,="" έδειξε="" σταδιακή="" βελτίωση="" στην="" κινητική="" μάθηση="" και="" στη="" μνήμη,="" ενώ="" η="" ίδια="" ικανότητα="" μειώθηκε="" στην="" ψευδή="" ομάδα.="" οι="" αλλαγές="" στα="" επίπεδα="" αα="" προχώρησαν="" σε="" αλλαγές="" συμπεριφοράς,="" οι="" οποίες="" θα="" μπορούσαν="" να="" χρησιμεύσουν="" ως="" πρώιμος="">αντι γήρανσηεπίδραση θεραπείας (Εικ. 5γ).

Οι αναλύσεις ιστού εγκεφάλου (Εικ. 5d, 5e) έδειξαν ότι τα ηλικιωμένα ποντίκια (η εικονική ομάδα) είχαν μικρότερη περιοχή θετικών στο DCX κυττάρων στην υποκοιλιακή ζώνη από τα νεαρά ποντίκια. Αντίστροφα, η περιοχή των θετικών σε DCX κυττάρων αυξήθηκε στο ζώο που έλαβε πλάσμα και παρέμεινε αμετάβλητη (ρ=0.04) υποδεικνύοντας ότι το πλάσμα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος με ένεση διέγειρε τη νευρογένεση του παλιού εγκεφάλου. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν το πιθανό όφελος της θεραπείας με πλάσμα στη διαρκή νευρογένεση που είχε ως αποτέλεσμα βελτιωμένη κινητική λειτουργία στην ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία.

Συζήτηση

Οι εξελίξεις στις θεραπείες αναζωογόνησης αυξάνουν ταυτόχρονα την ανάγκη για ένα αντικειμενικό και ποσοτικό μέτρο για την ανάγνωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Έτσι σχεδιάσαμε τη μελέτη μας για να εντοπίσουμε μοριακούς βιοδείκτες που μπορούν να εξηγήσουν καλύτερα τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της γήρανσης καιαντι γήρανσηθεραπευτική αγωγή. Τα πειράματά μας σε ζώα οδήγησαν στις ακόλουθες παρατηρήσεις: i) τα προφίλ μεταβολιτών κοορτών νεαρών και ενηλίκων ποντικών είναι προφανώς διαφορετικά. και ii) η έγχυση πλάσματος ανθρώπινου λώρου σε ηλικιωμένα ποντίκια αλλάζει τα πρότυπα μεταβολιτών τους πιο κοντά σε αυτά των νεαρών ποντικών. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε το αραχιδονικό οξύ (AA) ως τον πιο αποτελεσματικό υποκατάστατο βιοδείκτη γιααντι γήρανσηθεραπευτική αγωγή; Ο μεταβολισμός της ΑΑ ήταν εξαιρετικά μη ρυθμισμένος τόσο σε νεαρά ποντίκια όσο και σε ποντίκια που έλαβαν πλάσμα, και βρέθηκε να παίζει βασικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με άλλες μεταβολικές οδούς όπως ο μεταβολισμός του λινολεϊκού οξέος [10, 18].

Αναπτύξαμε περαιτέρω ένα γρήγορο, φορητό σύστημα αισθητήρων (cMES) για τη διευκόλυνση της ανίχνευσης AA σε συνήθεις έρευνες και κλινικές ρυθμίσεις. Ενσωματώσαμε συγκεκριμένα ένα ανταγωνιστικό σχήμα δοκιμασίας με ανοσομαγνητικό εμπλουτισμό σε μια προσπάθεια ανίχνευσης μικρών μοριακών στόχων (δηλαδή μεταβολιτών) απευθείας από δείγματα πλάσματος. Αυτός ο συνδυασμός φέρνει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα. (i) Ο προσδιορισμός επωφελείται από την κινητική ταχείας δέσμευσης, καθώς τα μαγνητικά σφαιρίδια συλλαμβάνουν ΑΑ σε ολόκληρο τον όγκο του δείγματος (3-διαστατική διάχυση). (ii) Οι διαδικασίες ανάλυσης (π.χ. βήματα πλύσης) απλοποιούνται με εξωτερικούς μαγνήτες που χρησιμοποιούνται για τη συλλογή σφαιριδίων. (iii) Συγκεντρώνοντας μαγνητικά σφαιρίδια συνδεδεμένα με ΑΑ κοντά στο ηλεκτρόδιο ανίχνευσης, το συνολικό αναλυτικό σήμα μπορεί να βελτιωθεί (~72 τοις εκατό ) [12]. Πράγματι, δείξαμε ότι η ανάλυση cMES χρησιμοποιεί<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Σχήμα 5. Συμπεριφορικές και μοριακές δοκιμασίες. (Α) 2-δοκιμαστικές δοκιμές Rotarod διεξήχθησαν 1 και 4 μήνες μετά την ένεση πλάσματος. (Β) Η ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με πλάσμα

έδειξε προοδευτική βελτίωση στον κινητικό συντονισμό. η απόδοση ήταν κοντά σε αυτή της νεαρής ομάδας στο τέλος (η δεύτερη δοκιμή στους 3 μήνες). Ο χρόνος λειτουργίας της εικονικής ομάδας μειώθηκε με τη γήρανση. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (γ)="" για="" την="" ομάδα="" που="" υποβλήθηκε="" σε="" θεραπεία="" με="" πλάσμα,="" η="" αύξηση="" των="" επιπέδων="" αα="" προηγήθηκε="" της="" βελτίωσης="" της="" κινητικής="" λειτουργίας.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (δ)="" εγκεφαλικά="" κύτταρα="" στην="" υποκοιλιακή="" ζώνη="" ανοσοχρωματίστηκαν="" για="" έναν="" δείκτη="" νευρογένεσης,="" τη="" διπλή="" κορτίνη="">

Η γραμμή κλίμακας είναι 50 μm. Σημειώστε ότι η εικονική ομάδα είχε σημαντική μικρότερη περιοχή θετικών σε DCX κυττάρων στην υποκοιλιακή ζώνη από τα νεαρά ποντίκια, ενώ η περιοχή αυξήθηκε στο ζώο που έλαβε πλάσμα και παρέμεινε αμετάβλητη. (Ε) Μετρήθηκε η περιοχή των θετικών σε DCX κυττάρων στην εικόνα (D). *p < 0.05;="" ***p=""><>

Η ΑΑ έχει αποδειχθεί ότι προάγει την ανάπτυξη των μυών και την ανάπτυξη του εγκεφάλου [19, 20]. Άλλες αναφορές τόνισαν επίσης τα πιθανά οφέλη του AA σεαντι γήρανση[21, 22]. Η τρέχουσα μελέτη είναι σύμφωνη με αυτά τα ευρήματα, αλλά το πεδίο εφαρμογής της περιορίστηκε στη δημιουργία μιας συσχετιστικής σχέσης μεταξύ των επιπέδων ΑΑ καιαντι γήρανσηφαινότυπους. Η σειριακή παρακολούθηση ΑΑ, ωστόσο, έδειξε ότι οι αυξήσεις ΑΑ σε ποντίκια που έλαβαν πλάσμα ήταν πιθανόν από ενδογενείς πηγές και όχι από πλάσμα που είχε μεταγγιστεί. Επιπλέον, διαρκήςαντι γήρανσηεπιδράσεις παρατηρήθηκαν σε ποντικούς λήπτες ακόμη και 4 μήνες μετά το τέλος της θεραπείας με πλάσμα. Η κινητική εκμάθηση και οι λειτουργίες μνήμης βελτιώθηκαν. και ο αριθμός των νευρωνικών πρόδρομων κυττάρων αυξήθηκε στον εγκέφαλο. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν έντονα φυσιολογικές αλλαγές σε ποντίκια που έλαβαν πλάσμα. ο ακριβής μηχανισμός δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί.

Αρκετοί άλλοι περιορισμοί αυτής της μελέτης θα πρέπει να εξεταστούν σε μελλοντική έρευνα. Πρώτον, η ανάλυση cMES πρέπει να τελειοποιηθεί για μεγαλύτερη ακρίβεια. Ειδικότερα, λόγω της έλλειψης αληθινών αρνητικών δειγμάτων (δηλ. δειγμάτων αίματος χωρίς ενδογενή ΑΑ), ήταν δύσκολο να ληφθούν υπόψη τα σήματα από μη ειδική δέσμευση. Ενδεχομένως, η επίδραση των μητρών αίματος μπορεί να είναι αμελητέα καθώς αραιώσαμε τα δείγματα κατά 100-πλάσια. Μια τέτοια υπόθεση, ωστόσο, πρέπει να επικυρωθεί χρησιμοποιώντας δείγματα πλάσματος που έχουν διαγραφεί από ΑΑ που θα μπορούσαν να παρασκευαστούν από μοντέλο ποντικού με έλλειψη ΑΑ [23] ή μέσω ανοσοεξάντλησης του ΑΑ. Δεύτερον, εστιάσαμε στην ανίχνευση ενός μεμονωμένου μεταβολίτη στον μεταβολισμό ΑΑ για απλότητα, αλλά αυτή η προσέγγιση μπορεί να αγνοήσει το βιολογικό πλαίσιο, όπως τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ μεταβολιτών σε μια δεδομένη οδό. Η συμπερίληψη μιας ομάδας μεταβολιτών θα καταγράψει καλύτερα τις μεταβολικές διαταραχές και θα αυξήσει επίσης τη διαγνωστική ακρίβεια. Το cMES μπορεί εύκολα να κλιμακωθεί για να ανιχνεύσει διαφορετικούς δείκτες ενώ καταναλώνει μικρές ποσότητες δείγματος. Τρίτον, η παρεμβολή των τρεχόντων ευρημάτων στους ανθρώπους θα ήταν πρόκληση. Αν και τα ποντίκια και οι άνθρωποι μοιράζονται παρόμοια μεταβολικά μονοπάτια, τα ποντίκια έχουν 7-πλάσια υψηλότερο μεταβολικό ρυθμό από τους ανθρώπους [24]. Απαιτούνται δοκιμές σε ανθρώπους για τον προσδιορισμό των βέλτιστων δόσεων πλάσματος για έγχυση και για τον καθορισμό των βασικών γραμμών για βιοδείκτες. ενημερωμένοι από μελέτες σε ζώα, σχεδιάζουμε τέτοιες μελέτες σε ανθρώπους. Αυτές οι προσπάθειες θα επιταχύνουν την ανάπτυξη τουαντι γήρανσηθεραπείες, βελτιώνοντας την ποιότητα της ατομικής ζωής καθώς και μειώνοντας τα κοινωνικά βάρη.

Μέθοδοι

Πειραματικό σχέδιο

Το πλάσμα διαχωρίστηκε από το αίμα του ανθρώπινου ομφάλιου λώρου που συλλέχθηκε κατά την παράδοση. Το πλάσμα του αίματος του ομφάλιου λώρου χορηγήθηκε με ενδοφλέβια έγχυση σε ηλικιωμένα ποντίκια (18-μηνών) και εικονικό έλεγχο (18-μηνών) και νεαρά ποντίκια (3-μηνών ως θετικά ελέγχου) εγχύθηκε με φυσιολογικό ορό. Τον 1 και 4 μήνες μετά τη μεταμόσχευση, 2-διεξήχθησαν δοκιμαστικές δοκιμές rotarod για την αξιολόγηση του κινητικού συντονισμού και της μακροπρόθεσμης μνήμης (Εικ. S1). Το μη στοχευμένο προφίλ μεταβολίτη πραγματοποιήθηκε στο αίμα από τις τρεις ομάδες και η βιοπληροφορική ανάλυση προσδιόρισεαντι γήρανσησχετική οδό (μεταβολισμός αραχιδονικού οξέος). Ο βιοαισθητήρας αναπτύχθηκε για την ανίχνευση του αραχιδονικού οξέος που κυκλοφορεί στο αίμα εύκολα και αποτελεσματικά.

Προετοιμασία δείγματος αίματος ομφάλιου λώρου

Αίμα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου συλλέχθηκε στο πλαίσιο της επιτροπής θεσμικής αναθεώρησης του Γενικού Νοσοκομείου CHA (Σεούλ, Κορέα, IRB No. CHAMC-2015- 08-130-009). Αίμα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου δωρήθηκε από 4 δότες και υποβλήθηκε σε θεραπεία με κιτρική-φασφορική-δεξτρόζη με αντιπηκτικό αδενίνης (CPDA-1). Το πλάσμα ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος απομονώθηκε με φυγοκέντρηση στα 2,000 g για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα απομονωμένα δείγματα πλάσματος αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό και χρησιμοποιήθηκαν με έναν μόνο κύκλο κατάψυξης-απόψυξης σε θερμοκρασία δωματίου.

Πειράματα σε ζώα

Τα πρωτόκολλα για τα ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου CHA (IACUC). Χρησιμοποιήσαμε 18-θηλυκά ποντίκια C57BL/6 μηνών για να αξιολογήσουμε τις μεταβολικές διαταραχές και τους φαινοτύπους συμπεριφοράς που σχετίζονται με τη γήρανση καιαντι γήρανση. Οι θετικοί μάρτυρες ήταν 3-θηλυκά ποντίκια C57BL/6 μηνών. Όλα τα ποντίκια εκτράφηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε τυπικό κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών. Για τα ενήλικα ποντίκια, το πλάσμα ή το αλατούχο ορό (130 μL) εγχύθηκε ενδοφλεβίως 12 φορές για 4 εβδομάδες. Το απομονωμένο πλάσμα ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος δεν συγκεντρώθηκε και ένα δεδομένο ζώο έλαβε πλάσμα αίματος ομφάλιου λώρου από τον ίδιο δότη. Ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιούνται σε κάθε πείραμα περιγράφεται στις αντίστοιχες ενότητες της μεθόδου. Το πλάσμα συλλέχθηκε μέσω φυγοκέντρησης (3,000 g, 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου).

Απόκτηση μεταβολιτών και ανάλυση δεδομένων

Για τον προσδιορισμό του προφίλ των μεταβολιτών που μεταδίδονται στο αίμα, συλλέχθηκε αίμα από τα ποντίκια με καρδιακή παρακέντηση στα καθορισμένα χρονικά σημεία: η ομάδα νεαρών (3-μηνών, n=10), η ψευδής ομάδα ({{ 4}}month-old, n=10; 23-month-old, n=12), η ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με πλάσμα (20-month-old, n {{13 }}; 23-month-old, n=5). Τα δείγματα αίματος αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC-MS) (Agilent). Μετατρέψαμε αρχεία LC/MS σε τυπική μορφή mzXML (ProteoWizard) [25] και στη συνέχεια τα επεξεργαστήκαμε χρησιμοποιώντας MAIT (εργαλειοθήκη αυτόματης αναγνώρισης μεταβολίτη) [26] για ανίχνευση χαρακτηριστικών, στατιστική ανάλυση και αναγνώριση μεταβολιτών. Στατιστικά σημαντικά χαρακτηριστικά (δηλαδή, ιονισμένοι και/ή κατακερματισμένοι μεταβολίτες) αναγνωρίστηκαν μέσω ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA). Αυτά τα χαρακτηριστικά αντιστοιχίστηκαν με όλους τους πιθανούς υποτιθέμενους μεταβολίτες στη βάση δεδομένων μεταβολιτών [9] με βάση την αναλογία μάζας/φόρτισης του φασματικού ιόντος μάζας (ανοχή m/z 0.005). Χαρακτηρίσαμε τις παγκόσμιες μεταβολές του μεταβολίτη μέσω ιεραρχικής ανάλυσης ομαδοποίησης και των εγγενών δομών των δεδομένων μεταβολομικής μέσω ανάλυσης κύριου συστατικού (PCA). Δύο ή τρία τεχνικά αντίγραφα (εξασφαλίζοντας ότι η τεχνική διαφοροποίηση είναι πολύ μικρότερη από τη βιολογική παραλλαγή) ανά ποντίκι συμπεριλήφθηκαν στην μάθηση χωρίς επίβλεψη, όπως η PCA και η ιεραρχική ομαδοποίηση. Η ιεραρχική ομαδοποίηση στα κύρια συστατικά (HCPC) πραγματοποιήθηκε από το FactoMineR, ένα πακέτο R [27]. Για μια λειτουργική ανάλυση, οι πιο πιθανές μεταβολικές οδοί που θα διαταραχθούν από τη γήρανση και τη θεραπεία με πλάσμα προσδιορίστηκαν μέσω ανάλυσης οδού KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. Η υπεργεωμετρική κατανομή χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της υπερεκπροσώπησης των ταιριασμένων μεταβολιτών σε συγκεκριμένα μονοπάτια KEGG.

Παρασκευή ανοσομαγνητικών σφαιριδίων

Μαγνητικά σφαιρίδια (5 mg) επικαλυμμένα με εποξειδικές ομάδες (Dynabeads Μ-270 Epoxy, Invitrogen) εναιωρήθηκαν σε 100 μL διαλύματος φωσφορικού νατρίου 0,1 Μ. Εκατό μικρογραμμάρια αντισώματος κατά του αραχιδονικού οξέος (Biomatik) προστέθηκαν και αναμίχθηκαν επιμελώς. Εκατό μικρολίτρα διαλύματος θειικού αμμωνίου 3 Μ προστέθηκαν και το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκε περαιτέρω στους 4 βαθμούς για όλη τη νύχτα με αργή περιστροφή κλίσης. Η αντίδραση σύζευξης διεξήχθη σε ρΗ=7.4. Αυτές οι διεργασίες προκαλούν το σχηματισμό ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ εποξειδικών (σφαιριδίων) και αμινών (αντισώματος), κάτι που επιβεβαιώσαμε προηγουμένως υποβάλλοντας τα συζεύγματα αντισώματος-σφαιριδίων σε προκλήσεις pH [29]. Κατά μέσο όρο ακινητοποιήθηκαν 2,4×104 αντισώματα ανά σφαιρίδιο. Τα συζευγμένα με αντίσωμα μαγνητικά σφαιρίδια διαχωρίστηκαν με μόνιμο μαγνήτη, πλύθηκαν δύο φορές με διάλυμα PBS και επαναιωρήθηκαν σε 200 μL PBS με 1 τοις εκατό BSA. Οι χάντρες αποθηκεύτηκαν σε 4 βαθμούς έως και ένα μήνα.

Σύζευξη HRP με αραχιδονικό οξύ

Το HRP στη συνέχεια συζεύχθηκε με BSA μέσω χημείας αναγωγικής αμίνωσης. Συγκεκριμένα, 100 μg συζευγμένου με BSA AA (RPU51089, Biomatik) διαλύθηκε σε 0,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού-βιοανθρακικού 0,2 Μ (ρΗ 9,4), προστέθηκε σε ένα χιλιοστόγραμμα λυοφιλοποιημένου EZ-link Plus Activated Peroxidase (Thermo Scientific), και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 10 μL κυανοβοροϋδριδίου του νατρίου (Thermo Scientific) και το μίγμα επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, προστέθηκαν 20 μL ρυθμιστικού διαλύματος Quenching (Thermo Scientific) και ακολούθησε επώαση 15 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Η ηλεκτροφόρηση γέλης και η ανάλυση ζώνης πρωτεΐνης επιβεβαίωσαν τη σύζευξη HPR με BSA-AA (Εικ. S3a). Τα συζευγμένα με HRP ΑΑ συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν με φυγόκεντρο φίλτρο Amicon Ultra 100Κ (Millipore). Η εναπομείνασα υπεροξειδάση και το BSA-AA ξεπλύθηκαν με PBS για τέσσερις φορές.

Ηλεκτροχημική ανίχνευση ΑΑ σε δείγματα πλάσματος

Για την ηλεκτροχημική ανίχνευση της ΑΑ, συλλέχθηκε αίμα από νεαρές (n {0}}), ψευδείς (n=8) και ομάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πλάσμα (n=5 για 1 μήνα και n=5 για 3 μήνες). Δείγματα πλάσματος ποντικού (0,5 μL) αραιώθηκαν σε 50 μL 1 τοις εκατό BSA σε PBS (×{{11}πλάσια αραίωση) και αναμίχθηκαν με διάλυμα ανοσομαγνητικού σφαιριδίου (50 μL) και συζευγμένο με HRP διάλυμα AA (50 μL). Η ποσότητα του AA-HRP ήταν αρκετά μεγάλη ώστε να κορεσθούν οι θέσεις δέσμευσης σε μαγνητικά σφαιρίδια. Χρησιμοποιήσαμε περίπου 8,4×107 σφαιρίδια ανά δοκιμή, γεγονός που καθιστά διαθέσιμες θέσεις δέσμευσης 2,0×1012 AA. Η ποσότητα του AA-HRP ήταν ~1,7×1013. η αναλογία μεταξύ AA-HRP και θέσεων δέσμευσης ήταν ~8:1. Το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με αργή περιστροφή κλίσης. Το σφαιρίδιο ελέγχου παρασκευάστηκε με ανάμιξη 1 τοις εκατό BSA σε PBS (50 μL) με διάλυμα ανοσομαγνητικού σφαιριδίου (50 μL) και συζευγμένο με HRP διάλυμα ΑΑ (50 μL). Όλα τα σφαιρίδια που αντέδρασαν διαχωρίστηκαν με μόνιμο μαγνήτη και πλύθηκαν δύο φορές με 80 μL PBS (1 τοις εκατό BSA). Τέλος, τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 7 μL PBS. Το παρασκευασμένο διάλυμα σφαιριδίων και 20 μL διαλύματος TMB (Biomatik) φορτώθηκαν στην κορυφή του ηλεκτροδίου. Μετά από 6 λεπτά, ξεκίνησε η χρονοαμπερομετρική μέτρηση. Χρησιμοποιήσαμε έναν μικροχημικό αισθητήρα (ένα πρωτότυπο σύστημα που αναπτύχθηκε από την AcurreHealth Inc.). Τα τρέχοντα επίπεδα στο εύρος των 40-45 δευτερολέπτων υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο. Χρησιμοποιήσαμε τον παράγοντα μετατροπής (×100) για να αναφέρουμε τις εκτιμώμενες αρχικές συγκεντρώσεις ΑΑ στο πλάσμα.

Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA)

Τα πειράματα ELISA πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA αραχιδονικού οξέος (AA) ποντικού (Biomatik) σύμφωνα με τις οδηγίες κατασκευής. Σε κάθε φρεάτιο προστέθηκαν σειριακά αραιωμένα ΑΑ και επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP ΑΑ στους 37 βαθμούς για 40 λεπτά. Μετά από πλύση με ρυθμιστικό πλύσης για τέσσερις φορές, προστέθηκε διάλυμα ΤΜΒ και επωάστηκε για 20 λεπτά. Η ανάπτυξη χρώματος σταμάτησε με την προσθήκη διαλύματος διακοπής. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Tecan).

Δοκιμή Rotarod

Τροποποιήσαμε τη δοκιμή Rotarod των Kong et al. [30] για την αξιολόγηση του κινητικού συντονισμού. Το περιστροφικό ράβδο με ράβδο διαμέτρου 3-cm ξεκίνησε στις 4 σ.α.λ. και επιτάχυνε κατά 4 σ.α.λ. ανά 30 δευτερόλεπτα για 5 λεπτά. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στη ράβδο και μετρήθηκε ο χρόνος που χρειάστηκε για να πέσουν τα ποντίκια από τη ράβδο. Σε κάθε ποντίκι δόθηκαν 3 δοκιμές την ημέρα και οι χρόνοι τρεξίματος κάθε ημέρας υπολογίστηκαν ως ο μέσος όρος των χρόνων εκπαίδευσης. Η πρώτη δοκιμή rotarod διεξήχθη 1-μήνα μετά τη θεραπεία με πλάσμα: η ομάδα νέων (n=29), η ψευδής ομάδα (n=17), η ομάδα που έλαβε πλάσμα (n {{ 11}}). Μια συνεδρία επανεκπαίδευσης ξεκίνησε 4-μήνες μετά τη θεραπεία με πλάσμα. Για να αποφευχθεί η υπερβολική προπόνηση, η επανεκπαίδευση πραγματοποιήθηκε για 2 ημέρες. Η άλλη διαδικασία ήταν η ίδια με την πρώτη συνεδρία.

Απεικόνιση εγκεφαλικού ιστού

1 μήνα (n=4) και 4 μήνες (n=3) μετά την ένεση πλάσματος ανθρώπινου ομφαλοπλακουντιακού αίματος ή ένεση φυσιολογικού ορού, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και στη συνέχεια εγχύθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (PFA) και PBS μέσω του αριστερή κοιλία. Οι νεαρές (n=5) και οι εικονικές ομάδες (n=4) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Το μυαλό τους ήταν

εξάγεται και κρυοπροστατεύεται. Κάθε εγκέφαλος τεμαχίστηκε σε κρυότομο πάχους 30 μm. Προς την

εκτελέστε την ανοσοϊστοχημεία, η μη ειδική δέσμευση αποκλείστηκε με 5 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας σε 0.3 τοις εκατό Triton X-100 για 40 λεπτά. Το πρωτογενές αντίσωμα κατά της Doublecortin (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) εφαρμόστηκε όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε PBS για πλύση [31]. Το δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #Α11008) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του DCX. Οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon Eclipse 80i) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Image J [32].

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις βασικές συναρτήσεις R και το lme4, ένα πακέτο R για κάθε Γραμμική

Μοντέλα μικτών εφέ ή γενικευμένο γραμμικό μοντέλο

(GLM) ακολουθούμενη από μια εκ των υστέρων δοκιμή LSD [33]. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα και η τιμή ap < 0,05="" θεωρήθηκε="">

Συμπληρωματικό υλικό

Συμπληρωματικά στοιχεία.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε την AccureHealth Inc. για την παροχή του μικροχημικού αισθητήρα. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από επιχορήγηση του Ινστιτούτου Προώθησης Τεχνολογίας Πληροφοριών και Επικοινωνιών (IITP) που χρηματοδοτήθηκε από την κυβέρνηση της Κορέας (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Ανταγωνιστικά Συμφέροντα

Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχει ανταγωνιστικό ενδιαφέρον.