Ο αυτοφθορισμός ως μη επεμβατικός βιοδείκτης γήρανσης και προηγμένων τελικών προϊόντων γλυκαίωσης στο Caenorhabditis Elegans

Για να αξιολογήσουμε τη χρησιμότητα του αυτοφθορισμού ως μη επεμβατικού βιοδείκτη γήρανσης στο Caenorhabditis elegans, μετρήσαμε τον αυτοφθορισμό μεμονωμένων νηματωδών χρησιμοποιώντας φασματοφθορισμό. Ο φθορισμός κάθε σκουληκιού αυξήθηκε με την ηλικία. Τα ζώα με χαμηλότερη ένταση φθορισμού εμφάνισαν μεγαλύτερο προσδόκιμο ζωής. Όταν οι πρωτεΐνες που εξήχθησαν από τα σκουλήκια επωάστηκαν με σάκχαρα, η ένταση φθορισμού και η συγκέντρωση των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) αυξήθηκαν με την πάροδο του χρόνου. Η ριβόζη ενίσχυσε αυτές τις αλλαγές όχι μόνο in vitro αλλά και in vivo. Ο αναστολέας γλυκοζυλίωσης ριφαμπικίνη κατέστειλε αυτή την αύξηση του φθορισμού. Η φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης αποκάλυψε ότι οι βιτελογενίνες συσσωρεύτηκαν σε ηλικιωμένους σκουλήκια και οι γλυκοζυλιωμένες βιτελογενίνες εξέπεμπαν έξι φορές υψηλότερο φθορισμό από τις απλές βιτελογενίνες.Η αύξηση του φθορισμού με τη γήρανση προέρχεται από γλυκοζυλιωμένες ουσίεςκαι επομένως θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένας χρήσιμος μη επεμβατικός βιοδείκτης των AGEs.Cistancheμπορεί να χρησιμεύσει ως νέο μοντέλο για την αναζήτηση αντι-AGE παραγόντωνκαι να μελετήσει τη σχέση μεταξύ AGEs και γήρανσης.

Cistancβότανα για αντιγηραντικούς παράγοντες

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η μέση διάρκεια ζωής των ανθρώπων έχει παραταθεί δραματικά στις ανεπτυγμένες χώρες τον τελευταίο μισό αιώνα. Ωστόσο,Η προοδευτική βλάβη με τη γήρανση προκαλεί επιβλαβείς επιπτώσεις στις φυσιολογικές λειτουργίες, γνωστός ωςγηρασμός, καιασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανσηεπίσης αυξάνονται σεαναλογία με τη μακροζωία. Επέκταση του"διάστημα υγείας" είναι πλέον απαραίτητο αντί να παρατείνεται μόνο η διάρκεια ζωής. Είναι επιθυμητές παρεμβάσεις που επιβραδύνουν τη γήρανση και παρατείνουν το διάστημα της υγείας. Οι Brenner et al. εισήχθηCaenorhabditis elegans, που είναι ένας μικρός, ελεύθερα ζωντανός νηματώδης εδάφους που τρέφεται με βακτήρια, για χρήση σεμελέτες μοριακής γενετικής διαφοροποίησης και ανάπτυξης.

Στη συνέχεια, το σκουλήκι έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως πειραματικό σύστημα για βιολογικές μελέτες, συμπεριλαμβανομένης της έρευνας για τη γήρανση, εξαιτίας αυτού του ζώου'απλότητα, διαφάνεια, ευκολία καλλιέργειας, μικρή διάρκεια ζωής και καταλληλότητα για γενετική ανάλυση2. Στο σκουλήκι, η γήρανση μπορεί να εξεταστεί με την εξασθένηση της ικανότητας κίνησης, την αντίσταση στο στρες, τη γνωστική ικανότητα και τη φαρυγγική άντληση και με τη συσσώρευση της λεγόμενης χρωστικής λιποφουσκίνης.3–5 .

Μια ποικιλία χημικών ουσιών, συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών και πολλών φαρμάκων, είναι υποψήφιοι για την πρόληψη της γήρανσης6,7. Επιπλέον, δεδομένου ότι αναφέραμε ότι η διάρκεια της υγείας και η διάρκεια ζωής των νηματωδών θα μπορούσε να παραταθεί με τη διατροφή με προβιοτικά βακτήρια8,9, τα αποτελέσματα μακροζωίας των ωφέλιμων βακτηρίων έχουν επίσης αποδειχθεί από διάφορα εργαστήρια10–12. Τα αποτελέσματα της μακροζωίας έχουν εξεταστεί από καμπύλες επιβίωσης, αλλά τέτοιες μελέτες σε σκουλήκια απαιτούν περισσότερες από 3 εβδομάδες, παρά τη σχετικά σύντομη διάρκεια ζωής τουC. elegans. Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των παρεμβάσεων κατά της γήρανσης, είναι επιθυμητοί εύχρηστοι και μη επεμβατικοί δείκτες γήρανσης για τον εντοπισμό της επιρροής σε μεμονωμένα σκουλήκια και (τελικά) στους ανθρώπους ως τελικό στόχο.

Η λιποφουσκίνη, μια λεγόμενη χρωστική ουσία ηλικίας, έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως δείκτης γήρανσης. Ωστόσο, η ακριβής σχέση μεταξύ αυτοφθορισμού, γήρανσης και διάρκειας ζωής στο σκουλήκι παρέμεινε ασαφής. Οι Gerstbrein et al. ανέφεραν ότι οι ηλικιακές χρωστικές είναι έγκυρες αναφορές για την υγεία των νηματωδών13, ενώ οι Coburn et al. ανέφερε ότι ο μπλε φθορισμός (μήκη κύματος διέγερσης/εκπομπής με επίκεντρο 340/430 nm) χρησιμεύει ως δείκτης θανάτου για αρκετές ώρες πριν και μετά τον θάνατο σεC. elegans14. Έχει προταθεί ότι οι αυξήσεις στον μπλε αυτοφθορισμό με την πάροδο του χρόνου παρατηρούνται σε πληθυσμούς γήρανσηςC. elegansμπορεί να αντικατοπτρίζει όχι το ποσοστό γήρανσης ή την κατάσταση της υγείας του πληθυσμού, αλλά το ποσοστό των νεκρών ή σχεδόν νεκρών ατόμων στο δείγμα15.

Τα προηγμένα τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (AGEs) έχουν προσελκύσει την επιστημονική προσοχή16 γιατί σχηματίζονται σε μεγάλες ποσότητες σε περιπτώσεις διαβήτη, αλλά και κατά τη φυσιολογική γήρανση και οδηγούν σε οξειδωτικό στρες. Τα AGEs είναι πολύπλοκες ενώσεις που σχηματίζονται από μη ενζυματικές αντιδράσεις μεταξύ αναγωγικών σακχάρων και αμινομάδων σε πρωτεΐνες, λιπίδια ή νουκλεϊκά οξέα. Στη συνέχεια, οι βάσεις Schiff και τα προϊόντα Amadori σχηματίζονται μέσω αντιδράσεων Maillard, αποδίδοντας AGEs. Η περιεκτικότητα σε AGE είναι υψηλή σε ασθενείς με διαβήτη, ρευματοειδή αρθρίτιδα, Αλτσχάιμερ'ασθένεια και άλλες ασθένειες17–19. Σε ασθενείς με διαβήτη, η συσσώρευση AGE συσχετίζεται καλά με τη σοβαρότητα της μικροαγγειακής νόσου και αυξάνεται με την ηλικία. Ωστόσο, το εάν τα AGEs αντιπροσωπεύουν μια αιτία παθογένεσης ή είναι μόνο δευτερογενή προϊόντα μένει να διευκρινιστεί. Τα AGEs θεωρούνται επίσης ως πιθανές αιτίες γήρανσης20,21, όπως προτείνεται από ευρήματα στο αC. elegansμοντέλο τοξικότητας ζάχαρης22,23.

Μια μέθοδος συστηματικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας συνδεδεμένης με ένζυμο (ELISA) έχει αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας αντισώματα με ειδικότητα για αρκετές ενώσεις AGE24–26. Ωστόσο, απαιτούνται επίσης μη επεμβατικές μέθοδοι για να επιτρέψουν χονδρικές εκτιμήσεις των επιπέδων AGE. Δεδομένου ότι αρκετές AGEs αναφέρονταιFLuorescent και τα συναφή τουςFLη ένταση του ουρισμού δείχνει ένα σημάδιΦιφήδεν μπορεί να συσχετιστεί με τα επίπεδα που μετρήθηκαν με ELISA27, εξετάσαμε αν αυτόFLο ουρισμός θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτικός δείκτης για την ανίχνευση της κατάστασης των AGEs και της γήρανσης σεC. elegansμοντέλο.

Για να εξακριβωθεί εάν το παρατηρούμενοφθορισμόςαντικατοπτρίζει απλώς τον θάνατοφθορισμόςπου αναφέρθηκε από τους Coburn et al., τα σκουλήκια εξετάστηκαν με ιχνηλάτηση τουFLουρανισμός μεμονωμένων σκουληκιών ενώχρονοδιάγραμμα θανάτου των αντίστοιχων ζώων. Επιπλέον, τοεπιδράσεις των αναστολέων του σχηματισμού AGE σεφθορισμόςκαι η συσσώρευση AGE διερευνήθηκαν επίσης για να επικυρωθεί η χρησιμότητα τουC. elegansως ζώο πρότυπο για την έρευνα AGE.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αυτοφθορισμός εκχυλισμένων πρωτεϊνών ως βιοδείκτης γήρανσης και AGEs σε σκουλήκια

Η φασματοφωτομετρία φθορισμού των εκχυλισμένων πρωτεϊνών έδειξε ότι η διέγερση στους 325–Τα 365 nm δημιούργησαν 17-σκουλήκια μιας ημέραςFLuoresce με την υψηλότερη εκπομπή στους 400–Διάστημα 430 nm (αιχμής 420 nm) (Εικ.1ένα). Το μπλεFLο ουρισμός ήταν συγκριτικά χαμηλότερος κατά τη νεαρή ενήλικη ζωή (3-ημέρας έως 5-ημέρας) αλλά αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου (σε 7-ζώα ημέρας) (Εικ.1σι). Η λιποφουσκίνη, μια λεγόμενη χρωστική ουσία ηλικίας, εκπέμπει κόκκινοFLουρανισμός (διέγερση στο 530–560 nm, εκπομπή στα 585–645 NM)15; στην προηγούμενη μελέτη μας, αυτός ο δείκτης ανιχνεύθηκε σε σκουλήκια όψιμης ζωής (πάνω από 13-ημέρας)9. 

Από το αυτοFLο ουρισμός που βρέθηκε στην παρούσα μελέτη εμφανίστηκε σε προγενέστερο στάδιο και αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου, μπλε αυτόματοFLΟ ουρισμός αναμενόταν να είναι καλύτερος βιοδείκτης για τον εντοπισμό της γήρανσης. Δεδομένου ότι πολλές ενώσεις AGE είναι γνωστό ότι είναι αυτοφθορίζουσες27, εξετάσαμε τη σχέση μεταξύ των περιεχομένων AGE και του μπλεflουρισμό με στύπωμα western κατά την οποία ένα αντίσωμα στο Νε- Χρησιμοποιήθηκε (καρβοξυμεθυλ) λυσίνη (CML), ένα αντιπροσωπευτικό AGE. Το στύπωμα έδειξε ότι μια εξαιρετική ζώνη ενισχύθηκε με την πάροδο του χρόνου (Εικ.1γ και Συμπληρωματικό Σχ. 1). Πράγματι, η ποσοτικοποίηση της περιοχής έδειξε αυξημένη AGE (Εικ.1δ), αν και η CML δεν είναι αυτόματηFLουορίζουσα.

Για να προσδιορίσετε εάν το αυτόFLουορισμός έδειχνε έμμεσα anαύξηση των AGEs που σχηματίζονται από την αντίδραση Maillard, πρωτεΐνεςπου εξήχθησαν από ομογενοποιήματα σκουληκιών επωάστηκαν ασηπτικά για έως και 4 εβδομάδες με αναγωγικά σάκχαρα όπως γλυκόζη, ριβόζη και φρουκτόζη. οFLο ουρισμός των πρωτεϊνών αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου παρουσία σακχάρων, ενώ δεν υπήρξε αξιοσημείωτη αύξηση σεFLουρισμός σε αντιδράσεις που πραγματοποιούνται χωρίς σάκχαρα (Εικ.2ένα). Οι πρωτεΐνες σκουληκιών έγινανFLουορισμού μέσω γλυκοζυλίωσης ακόμη και in vitro. Μεταξύ των αντιδράσεων που πραγματοποιήθηκαν με καθένα από τα τρία σάκχαρα, εκείνα με ριβόζη παρήγαγαν το υψηλότεροFLουρισμό, ακολουθούμενο από τα άλλα δύο σάκχαρα. ΑυτόΦιΑυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από μια αναφορά των Bunn και Higgins στην οποία η αντιδραστικότητα κάθε μονοσακχαρίτη με αμινομάδες για να σχηματίσει δεσμούς βάσης Schiff εξαρτάται από την έκταση στην οποία υπάρχει στην ανοιχτή (καρβονυλική) δομή παρά σε έναν δακτύλιο ( δομή ημιακετάλης ή ημικετάλης και οι ρυθμοί αντιδραστικότητας αυξήθηκαν κατά την τάξη της ριβόζης (10.0), της φρουκτόζης (4,5) και της γλυκόζης (0,6) (×10)−3 mM−1 h−1 ), αντίστοιχα28.

Εικ. 1 Φασματοφωτομετρία φθορισμού και τα AGE δειγμάτων πρωτεΐνης σκουληκιών. έναΔιαγράμματα αυτοφθορισμού μήτρας εκπομπής διέγερσης (EEM) από σκουλήκια που έχουν υποστεί λύση σε ηλικία 3-ημέρας και 17-ημέρας. οFLΤα επίπεδα ουρισμού στο μήκος κύματος εκπομπής στα διαγράμματα EEM εμφανίζονται ως έγχρωμοι χάρτες θερμότητας. Εκατό σκουλήκια (άγριου τύπου N2) έκαστος από 3-ημέρας και 17-ημέρας λύθηκαν σε 3 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και 4 μL 15 τοις εκατό SDS. Οι πρωτεΐνες απελευθερώθηκαν με κύκλους κατάψυξης-απόψυξης και τα φάσματα φωτοφωταύγειας συλλέχθηκαν μεFLφασματοφωτόμετρο ουρισμού (Hitachi FL-4500). Οι ιδιότητες φθορισμού των λυμένων νηματωδών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας EEMFLφασματοσκοπία ουρισμού. Διέγερση στο 325–Τα 365 nm δημιούργησαν 17-σκουλήκια μιας ημέραςFLμε τις υψηλότερες εκπομπές στους 400–Διαστήματος 430 nm αντίστοιχες τροχιές ως σειρά απόFLεντάσεις ουρισμού, ενώ 3-τα νεαρά σκουλήκια μιας ημέρας όχιFLuoresce. Πολυμεταβλητή ανάλυση (διέγερση ενός μήκους κύματος με εκπομπή πολλαπλού μήκους κύματος και σύγχρονη σάρωσηFLορομετρία) απέδωσε διαγράμματα EEM που αποτελούνται από διέγερση μονής σάρωσης.b Επίπεδα αυτοκινήτουflουρανισμός (πρώην 340/em 360–600) από δείγματα πρωτεΐνης σκουληκιού που εξήχθησαν από ζώα κάθε ηλικιακής ομάδας (3–13 ημερών). Τα σκουλήκια (άγριου τύπου Ν2) συλλέχθηκαν σε σωλήνες, πλύθηκανπέντεφορές, και λύθηκε σε κάθε σωληνάριο. Τα δείγματα στη συνέχεια αλέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Τόκιο, Ιαπωνία) για να απελευθερωθεί πρωτεΐνη. Τα περιεχόμενα πρωτεΐνης μετρήθηκαν ποσοτικά όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. ΕΝΑFLπροσδιορίστηκε το φάσμα του ουρισμού για κάθε 30-μL δείγμα (που περιέχει 1,5μg ολικής πρωτεΐνης) χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών με τρίψιμο πολλαπλών λειτουργιών, μοντέλο SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Ιαπωνία). Κάθε μέτρηση πραγματοποιήθηκε τρεις φορές.c Ανάλυση Western blotting της AGE CML σε δείγματα που εξήχθησαν από πληθυσμούς σκουληκιών (άγριου τύπου N2) διαφορετικών ηλικιών. Παρουσιάζεται μια αντιπροσωπευτική φωτογραφία τριών αναπαραγώγιμων πειραμάτων. Οι κηλίδες προήλθαν από διαφορετικά μέρη της ίδιας γέλης (που φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία παράλληλα.δ ΠοσοτικοποίησηAGEs σε στυπώματα western χρησιμοποιώντας πυκνομετρία. Οι ταινίες που περιβάλλονται από ορθογώνια πλαίσια στο Σχ.1c ποσοτικοποιήθηκαν και τα δεδομένα από τρία αναπαραγώγιμα πειράματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE.

αντίστοιχα.

Για να εκτιμηθεί άμεσα εάν οι αυξήσεις σεFLΟ ουρισμός παρουσία σακχάρων οφειλόταν στον σχηματισμό AGE, χρησιμοποιήθηκε ELISA για την ανίχνευση της αντιπροσωπευτικής ένωσης AGE CML. Η ΧΜΛ αυξήθηκε σε αυτές τις αντιδράσεις και το επίπεδο σε δείγματα που επωάστηκαν με ριβόζη ήταν σχεδόν επτά φορές υψηλότερο από εκείνα σε μάρτυρες που επωάστηκαν χωρίς σάκχαρα για 4 εβδομάδες (Εικ.2σι). Σε σύγκριση με τη ριβόζη, οι ποσότητες της ΧΜΛ που παρήχθησαν με γλυκόζη ή φρουκτόζη ήταν χαμηλές, παρόμοια με τη ΧΜΛ στον έλεγχο. Αυτόεύρεσηείναι σύμφωνη με προηγούμενη αναφορά29.

Ο αυτοφθορισμός ως βιοδείκτης γήρανσης και AGEs in vivo

Στη συνέχεια δοκιμάσαμε αν τοFLΟ ουρισμός μπορούσε να ανιχνευθεί όχι μόνο από εξαγόμενες πρωτεΐνες αλλά και σε ζωντανά σκουλήκια. Όταν ο αυτοφθορισμός μεμονωμένων σκουληκιών διαβάστηκε σε μεμβράνη πλαστικού περιτυλίγματος τεντωμένο σε 384-πλάκες φρεατίου με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών με τρίψιμο πολλαπλών λειτουργιών, τα αποτελέσματα της φασματοφωτομετρίας ήταν παρόμοια με εκείνα των εκχυλισμένων πρωτεϊνών (Εικ.3ένα). Η ατομική ένταση του μπλεFLο ουρισμός αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου (Εικ.3β και Συμπληρωματικό Σχ. 2), ενώ όχι κόκκινοFLΟ ουρισμός ανιχνεύθηκε με αυτή τη μέθοδο. Από μπλεFLο ουρισμός (340/430 ή 350/460 nm) έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι σχετίζεται με θάνατο14,15, η ανάλυση διεξήχθη με εξαίρεση δεδομένων που ελήφθησαν εντός 2 ημερών πριν από ένα ζώο'ο θάνατος. Ωστόσο, το μπλεFLο ουρισμός των σκουληκιών εξακολουθούσε να αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου: η αύξηση τωνFLΟ ουρισμός πρέπει επομένως να είναι εν μέρει ανεξάρτητος από τον θάνατοFLουρανισμός. Για να ελέγξουμε εάν ο αυτοφθορισμός θα μπορούσε να είναι ένας βιοδείκτης γήρανσης, εξετάσαμε πόσες ημέρες τα σκουλήκια θα μπορούσαν να επιβιώσουν μετά τη μέτρηση του αυτοφθορισμού σε σκουλήκια 13-ημέρας. Το προσδόκιμο ζωής κάθε σκουληκιού συσχετίστηκε αντιστρόφως με την ένταση του αυτοφθορισμού (Εικ.3c).

οflΗ ένταση του ουρισμού ήταν επίσης αυξημένη σε σκουλήκια που αναπτύχθηκαν με ριβόζη (Εικ.4ένα); η διάρκεια ζωής αυτών των σκουληκιών ήταν signiΦιφήπολύ πιο κοντό από αυτό των σκουληκιών ελέγχου (Εικ.4σι). Αντίθετα, τα σκουλήκια που αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιέχει ριφαμπικίνη, έναν αναστολέα AGEs, εκπέμπουν λιγότεροFLουρανισμός σε σύγκριση με σκουλήκια ελέγχου που αναπτύχθηκαν χωρίς ριφαμπικίνη (Εικ.4ντο); η επίδραση της ριφαμπικίνης στη μακροζωία έχει αναφερθεί προηγουμένως30. Επί πλέον,νταφ-2, ένα αντιπροσωπευτικό μετάλλαγμα υπέρ της μακροζωίας, που επίσης αυτοφθορίστηκε λιγότερο σε σύγκριση με το άγριου τύπου (Εικ.4δ), ενώ τοFLΗ ένταση του ουρισμού του άγριου τύπου αυξήθηκε με τη γήρανση.

Ένα μέρος τουFLΟ ουρισμός αναμένεται να προέρχεται από ενώσεις που παράγονται σε συνδυασμό με τον θάνατο των ζώων. Το μπλεFLο ουρισμός θα μπορούσε να είναι ο δείκτης θανάτου που ο Coburn et al. παρατηρήθηκε σεC. elegansγια αρκετές ώρες πριν και μετά το θάνατο. το μπλε φως θα προέρχεται από το ανθρανιλικό οξύ που σχηματίζεται αμέσως μετά το θάνατο των σκουληκιών14. Σύμφωνα με πληροφορίες, θάνατοςFLο ουρισμός εκπέμπεται από τη γλυκοζυλιωμένη μορφή του ανθρανιλικού οξέος που παράγεται από την οδό κυνουρενίνης14. kyu-1Τα μεταλλαγμένα σκουλήκια, τα οποία δεν έχουν την κυνουρενάση, αναμενόταν συνεπώς να μην εκπέμπουν το θάνατοFLουρανισμός. Ωστόσο, ακόμη και με την παρουσία αυτής της μετάλλαξης, τα ηλικιωμένα σκουλήκια εξακολουθούσαν να εμφανίζονται να εκπέμπουν υψηλότεραφθορισμόςαπό τα νεότερα σκουλήκια (Εικ.5α) και τα σκουλήκια που αναπτύχθηκαν σε μέσο ανάπτυξης νηματωδών (NGM) συμπληρωμένο με ριβόζη εμφάνισαν σημάδιαΦιφήπολύ ψηλότεραFLουρισμό από εκείνα που αναπτύσσονται απουσία συμπληρωματικής ριβόζης ή με το σάκχαρο ελέγχου σορβιτόλη (Εικ.5σι). Η διάρκεια ζωής των σκουληκιών που διατηρήθηκαν με ριβόζη ήταν προφανώς μικρότερη από αυτή των άλλων (Εικ.5γ), υποδηλώνοντας επιδράσεις προ-γήρανσης των AGEs σε σκουλήκια.

Αναγνώριση των αυτοφθορισμένων υλικώνΓια τον εντοπισμό ουσιών πουFLσε ηλικιωμένα ζώα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση LC MALDI στις εκχυλισμένες πρωτεΐνες. Οι έξι πιο άφθονες πρωτεΐνες που βρέθηκαν σε κάθε δείγμα παρατίθενται στον Πίνακα1; Συγκεκριμένα, οι βιτελογενίνες και οι παράγοντες επιμήκυνσης εμπλουτίστηκαν μεταξύ των κορυφαίων-45flπρωτεΐνες σε ηλικιωμένα σκουλήκια. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας MS υψηλής ανάλυσης και το υπολογιστικό περιβάλλον Mascot, αναζητήσαμε πρωτεΐνες που ήταν πιο άφθονες σε 15-σκουλήκια ημέρας παρά σε 3-σκουλήκια ημέρας και εντοπίσαμε 180 πρωτεΐνες (Συμπληρωματικοί πίνακες 1–3). Αν και οι βιτελογενίνες εμπλουτίστηκαν και πάλι (παρούσες σε έξι φορές υψηλότερα επίπεδα στους ηλικιωμένους σκουλήκια από ότι στους νεαρούς ενήλικες), τα επίπεδα των παραγόντων επιμήκυνσης ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Για να επαληθευτεί εάν αυτές οι πρωτεΐνες θα μπορούσαν να γλυκοποιηθούν για να σχηματίσουν αυτοφθορίζοντα AGEs, ο καθαρισμένος παράγοντας επιμήκυνσης και η βιτελογενίνη επωάστηκαν με ριβόζη in vitro. Ο φθορισμός που εκπέμπεται από γλυκοζυλιωμένες βιτελογενίνες εμφάνισε φάσματα παρόμοια με εκείνα που ελήφθησαν με ακατέργαστα εκχυλίσματα που ανακτήθηκαν από τα 17- σκουλήκια μιας ημέρας (Εικ.6ένα). Αν και η ριβοφλαβίνη είναι γνωστό ότιfluoresce, βρήκαμε ότι το μήκος κύματος εκπομπής της ριβοφλαβίνης ήταν διακριτό απόαυτό των εκχυλισμάτων σκουληκιών. Ο φθορισμός FL της γλυκιωμένης βιτελογενίνης και ο παράγοντας επιμήκυνσης ήταν εξαπλάσιοι και τριπλάσιοι (αντίστοιχα) των μη γλυκοζυλιωμένων πρωτεϊνών κατά 23 ημέρες in vitro (Εικ.6b).

Τα AGEs που ανιχνεύθηκαν με western blotting με αντισώματα κατά της CML αυξήθηκαν επίσης με την πάροδο του χρόνου από σκουλήκια 3-ημέρας σε 13-ημέρες in vivo (Εικ.1ντο). Με ταυτόχρονο στύπωμα western με αντισώματα κατά της βιτελογενίνης, βρήκαμε ότι τα σήματα anti-CML ήταν λωρίδες ίδιου μεγέθους με τις βιτελογενίνες (Εικ.6ντο). Αν και οι βιτελογενίνες YP170 και YP115 συσσωρεύτηκαν με την ηλικία κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, η ένταση των σημάτων AGE ενισχύθηκε υψηλότερα από την αύξηση της ποσότητας της βιτελογενίνης YP170 (Εικ.6ρε). Η μικροσκοπία φθορισμού αποκάλυψε ότι 13-σκουλήκια μιας ημέρας (Εικ.7d–f, οι στήλες 2 και 3) εκπέμπουν σήματαΦιφήπολύ πιο έντονο μπλε φως από τους νεαρούς ενήλικες 3- μιας ημέρας (Εικ.7a–γ, στήλες 2 και 3. Σύκο.7σολ); οι γονάδες φαίνονται επίσης πιο φωτεινές (Εικ.7d–στ, στήλες 1 και 2). Η ΧΜΛ είναι αντιπροσωπευτική AGE, αν και η ίδια η ΧΜΛ δεν είναι φθορίζουσα. Η πεντοσιδίνη, μια άλλη AGE, είναι γνωστό ότι είναι φθορίζουσα. Ωστόσο, η ανοσοχρώση ούτε με αντισώματα κατά της CML ούτε με αντι-πεντοσιδίνη παρείχε εξέχουσες διαφορές μεταξύ ηλικιωμένων και νεαρών σκουληκιών (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Ωστόσο, η αντι-CML έδειξε διάχυτη εξάπλωση στους ιστούς, ενώ η αντι-πεντοσιδίνη δεν το έδειξε σχεδόν καθόλου.