Οι οδοί που εξαρτώνται από τον υποδοχέα υδρογονάνθρακα αρυλίου και ανεξάρτητες μεσολαβούν στα αντιγηραντικά αποτελέσματα της κουρκουμίνης

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Ο υποδοχέας αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ενεργοποιείται από συνδέτη του οποίου η δραστηριότητα μπορεί να ρυθμιστεί από πολυφαινόλες, όπως η κουρκουμίνη. Το AhR και η κουρκουμίνη έχουν εξελικτικά συντηρημένες επιδράσεις στη γήρανση. Εδώ, ερευνήσαμε εάν και πώς το AhR μεσολαβεί στις αντιγηραντικές επιδράσεις της κουρκουμίνης σε όλα τα είδη. Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό αναλύσεων in vivo, in vitro και in silico, δείξαμε ότι η κουρκουμίνη έχει επιδράσεις εξαρτώμενες ή ανεξάρτητες από το AhR με συγκεκριμένο πλαίσιο. Βρήκαμε ότι στο Caenorhabditis elegans, το AhR μεσολαβεί στην επέκταση της διάρκειας ζωής που προκαλείται από την κουρκουμίνη, πιθανότατα μέσω ενός ανασταλτικού μηχανισμού ανεξάρτητου από συνδέτη που σχετίζεται με την αντιοξειδωτική του δράση. Η κουρκουμίνη έδειξε επίσης αντιγηραντικές δραστηριότητες ανεξάρτητες από το AhR, όπως προστασία έναντι πρωτεϊνών με τάση συσσωμάτωσης και οξειδωτικού στρες στο C.elegans και προαγωγή της μεταναστευτικής ικανότητας των ανθρώπινων πρωτογενών ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτά τα ανεξάρτητα από το AhR φαινόμενα διαμεσολαβούνται σε μεγάλο βαθμό από την οδό Nrf2/SKN-1.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Λέξεις-κλειδιά:υποδοχέας υδρογονάνθρακα αρυλίου; κουρκουμίνη? οξειδωτικό στρες? Caenorhabditis elegans; ποντίκια? ενδοθηλιακά κύτταρα; in vivo; in vitro? σε πυρίτιο

1. Εισαγωγή

Ο υποδοχέας αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) είναι ένας πανταχού παρών μεταγραφικός παράγοντας ενεργοποιημένος από συνδέτη που προσδιορίζεται ως καθοριστικός παράγοντας για την τοξικολογική απόκριση στην 23,7,8-τετραχλωροδιβενζο-π-διοξίνη (TCDD) στα θηλαστικά [1]. Οι οδοί σηματοδότησης AhR έχουν περιγραφεί καλά σε κύτταρα θηλαστικών. Εν συντομία, το μη δεσμευμένο AhR εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και σταθεροποιείται από διάφορους συμπαράγοντες, όπως η πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90-kDa (Hsp90), η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με AHR (AIP) και ο συνοδός p23. Η δέσμευση σε εξωγενείς (π.χ., TCDD) ή ενδογενείς (π.χ., κυνουρενίνη) συνδέτες προάγει τη μετατόπιση αυτού του συμπλόκου στον πυρήνα, όπου το AhR διαχωρίζεται από τους συμπαράγοντες του και συγκεντρώνεται σε ένα ετεροδιμερές με τον πυρηνικό μετατοπιστή AHR (ARNT). Το προκύπτον σύμπλεγμα AHR/ARNT συνδέεται με τα ξενοβιοτικά αποκρινόμενα στοιχεία (XREs) μιας μπαταρίας αποκρινόμενων γονιδίων αποτοξίνωσης φάσης Ι και ΙΙ, οδηγώντας τελικά στην υποβάθμιση των προσδεμάτων [2]. Εκτός από το ρόλο του στην ξενοβιοτική απόκριση, λειτουργεί για το AhR σε μια ποικιλία παθοφυσιολογικών διεργασιών, που κυμαίνονται από ανοσία [3,4], φλεγμονή [5,6], μεταβολισμό λιπιδίων και γλυκόζης [7,8] έως καρδιαγγειακά, ηπατικά και άλλες ασθένειες οργάνων [9-12], έχουν ανακαλυφθεί τις τελευταίες δεκαετίες. Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδεικνύουν επίσης ανόμοιους και φαινομενικά αντιφατικούς ρόλους του AhR στη διαδικασία γήρανσης, οι οποίοι θα μπορούσαν ωστόσο να συμβιβαστούν, λαμβάνοντας υπόψη τις επιδράσεις που σχετίζονται με τον ιστό, τη δόση και το είδος [13].Cistanche Genghis KhanΈνας αρνητικός ρόλος για το AhR στη γήρανση και τα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την ηλικία έχει περιγραφεί σε όλα τα είδη [14,15]. Σε σύγκριση με το άγριου τύπου Caenorhabditis elegans, το μεταλλαγμένο στέλεχος AhR,ahr-1(ju145), έχει εκτεταμένη διάρκεια ζωής και υγείας. Στα ποντίκια, η ανεπάρκεια AhR βελτιώνει τη λειτουργία των αγγείων και αυξάνει τη δραστηριότητα της συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου και, επομένως, τη βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ. και, τέλος, βρέθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης AhR και της ακαμψίας των αγγείων σε άτομα μέσης και ηλικίας [14]. Επιπλέον, σε μια επιδημιολογική μελέτη σε κινεζικό πληθυσμό, η έκφραση AhR σχετιζόταν με τη συχνότητα εμφάνισης στεφανιαίας νόσου [16].

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Αξίζει να σημειωθεί ότι πολλές ενώσεις που επηρεάζουν τη γήρανση ή τις ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία [17-19] μπορούν να ρυθμίσουν τη δραστηριότητα AhR [20-22]. Ενώ η ενεργοποίηση του AhR από ξενοβιοτικά οδηγεί σε διαφορετικούς καρκίνους στα θηλαστικά [23,24], οι διατροφικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες αποδείχθηκε ότι έχουν αντίθετες εξαρτώμενες από το AhR επιδράσεις στο διάστημα υγείας του C.elegans [25]. Μεταξύ των διατροφικών ρυθμιστών AhR, οι πολυφαινόλες όπως η κουρκουμίνη έχουν μελετηθεί σε μεγάλο βαθμό για τις επιδράσεις τους υπέρ της υγείας. Η κουρκουμίνη είναι μια κίτρινη χρωστική ουσία από το Curcuma longa, με πολυάριθμες εξελικτικά διατηρημένες ευεργετικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών, αντιφλεγμονωδών και αντιγηραντικών δραστηριοτήτων [26]. Η κουρκουμίνη αποτρέπει τη συσσώρευση πρωτεϊνών και αυξάνει τη μακροζωία στο C.elegans και στο Drosophila μέσω της ρύθμισης της ομοιόστασης των πρωτεϊνών [27-29].παράταση ζωής cistancheΕπιπλέον, όταν χορηγήθηκε σε μοντέλο διαγονιδιακού ποντικού της νόσου του Αλτσχάιμερ, μείωσε σημαντικά το συνολικό φορτίο αμυλοειδούς-βήτα(Α) [30]. Σε ηλικιωμένα ποντίκια, η κουρκουμίνη αποκατέστησε τη βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ, μειώνοντας έτσι το οξειδωτικό στρες και βελτιώνοντας τη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και τη δυσκαμψία της αρτηρίας που εκτιμάται από την ταχύτητα κύματος παλμού της αορτής (PWV) - μια από τις πιο σημαντικές κλινικές μετρήσεις ή δείκτες ακαμψίας μεγάλης ελαστικής αρτηρίας [31]. Αρκετές μελέτες σε ανθρώπους έδειξαν επίσης προστατευτική επίδραση της κουρκουμίνης στην καρδιαγγειακή υγεία [32]. Ωστόσο, ο τρόπος δράσης της κουρκουμίνης εξακολουθεί να είναι σε μεγάλο βαθμό ασαφής και, το πιο σημαντικό, δεν έχει διερευνηθεί εάν οι ευεργετικές της επιδράσεις στην υγεία προκαλούνται από το AhR [33.34]

Πρότυποι οργανισμοί, όπως ο νηματώδης C.elegans, έπαιξαν καθοριστικό ρόλο στον εντοπισμό των γενετικών και περιβαλλοντικών καθοριστικών παραγόντων της γήρανσης. Αυτό οφείλεται στις πολλές πλεονεκτικές του ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένου του εύκολου εργαστηριακού χειρισμού, της μικρής διάρκειας ζωής και της παραγωγής μεγάλου αριθμού απογόνων με αυτογονιμοποίηση. Το γονιδίωμα του C.elegans έχει ολοκληρωθεί η αλληλουχία και τα περισσότερα από τα γονίδια και τα μονοπάτια του διατηρούνται εξελικτικά. Η πρωτεϊνική αλληλουχία του AhR διατηρείται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και στο C.elegans, τα ορθόλογα του AhR και ARNT κωδικοποιούνται από τα συσχετισμένα με AhR (ahr{-1) και ahr-1 (aha{{4 }})γονίδια, αντίστοιχα [35]. Οι αντίστοιχες πρωτεΐνες, AHR-1 και AHA-1, μοιράζονται περίπου το 40 τοις εκατό της ταυτότητας της αλληλουχίας τους με τις θηλαστικές και σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές (επίσης με τις αντίστοιχες των θηλαστικών), το οποίο μπορεί να δεσμεύσει τα XRE του στόχου γονίδια in vitro [36].cistanche nzΤο AHR-1 εκφράζεται κυρίως σε τύπους νευρωνικών κυττάρων, όπως οι GABAergic νευρώνες [37l, και παίζει βασικό ρόλο στον έλεγχο της νευρωνικής ανάπτυξης [38]. Σε αντίθεση με το AhR των σπονδυλωτών, το AHR-1 δεν δεσμεύει το TCDD και άλλα σχετικά ξενοβιοτικά [35,39], ωστόσο μοιράζεται κοινά χαρακτηριστικά με τα AhR των θηλαστικών στη ρύθμιση των νευρωνικών διεργασιών, της ανάπτυξης και της γονιμότητας [37,38, {8}}], υποδηλώνοντας τελικά ότι το προγονικό AhR δεν εμπλέκεται άμεσα στον έλεγχο των γονιδίων για την αποδόμηση των τοξικών προσδεμάτων [44,45]. Έτσι, αναγνωρίσαμε το C.elegans ως ένα μοναδικό και ισχυρό σύστημα μοντέλου για τον εντοπισμό και τη μελέτη των προγονικών λειτουργιών του AhR που πιθανώς δεν σχετίζονται με την ξενοβιοτική του απόκριση.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον ρόλο του AhR στις αντιγηραντικές επιδράσεις της κουρκουμίνης σε όλα τα είδη. Μέσω ενός συνδυασμού αναλύσεων in vivo, in vitro και in silico, διαπιστώσαμε ότι η κουρκουμίνη εμφανίζει διαφορετικά ευεργετικά αποτελέσματα κατά της γήρανσης μέσω μη συζευγμένων μηχανισμών που εξαρτώνται από το ahr-1-και ανεξάρτητους. Διαπιστώσαμε ότι τα εξαντλημένα ζώα του C.elegans ahr-1-είναι μακρόβια αλλά πιο ευαίσθητα στο οξειδωτικό στρες. Ενώ η κουρκουμίνη δεν επέκτεινε περαιτέρω τη διάρκεια ζωής των μεταλλαγμάτων C.elegans ahr{-1, προώθησε την αντοχή τους στο οξειδωτικό στρες. Η κουρκουμίνη προώθησε επίσης την αντιοξειδωτική απόκριση και τη μεταναστευτική ικανότητα των ανθρώπινων πρωτογενών ενδοθηλιακών κυττάρων (EC) ανεξάρτητα από το AhR, μια επίδραση που βασιζόταν κυρίως στο Nrf2/SKN-1 σε όλα τα είδη. Το SKN-1 είναι ο ορθολόγος C.elegans του ανθρώπινου παράγοντα μεταγραφής οξειδοαναγωγικού παράγοντα Nrt2 (πυρηνικός παράγοντας ερυθροειδής 2-σχετιζόμενος με τον παράγοντα 2), ο οποίος παίζει έναν εξελικτικά διατηρημένο ρόλο στην ομοιόσταση των κυττάρων και των οργανισμών και την απόκριση στο οξειδωτικό στρες [ 46,47]Αποτελέσματα σύζευξης από μια δοκιμασία κυτταρικού ανταποκριτή και σε μοντελοποίηση πυριτίου του τομέα δέσμευσης συνδέτη AHR-1 δεσμευτικό-ανεξάρτητο τρόπο. Συγκεκριμένα, και σύμφωνα με τα δεδομένα στο C.elegans και το EC, η κουρκουμίνη και τα προοξειδωτικά εμφάνισαν αντίθετα αποτελέσματα στη δραστηριότητα του AHR-1, υπονοώντας ότι η κουρκουμίνη μπορεί να ρυθμίζει τη δραστηριότητα του AHR-1 μέσω της αντιοξειδωτικής της ικανότητας είτε άμεσα ή έμμεσα μέσω της ρύθμισης του Nrf2/SKN-1 ή άλλων ρυθμιστικών πρωτεϊνών οξειδοαναγωγής.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. C.elegan1s

2.1.1. C. elegans Στελέχη και Καλλιέργεια

Χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα στελέχη C.elegans: N2 [wild-type], CZ2485 [ahr-1(Jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (αρχικό στέλεχος AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (Jul45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (αρχικό στέλεχος NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](αρχικό στέλεχος CL2166). Για συντήρηση, τα σκουλήκια διατηρήθηκαν συγχρονισμένα με ωοτοκία στις 20 μοίρες σε μέσα ανάπτυξης νηματωδών (NGM) πλάκες και τροφοδοτήθηκαν με E.coli OP50, σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στο [25]. Για τα πειράματα, τα σκουλήκια συγχρονίστηκαν σε πλάκες συμπληρωμένες με E.coli HT115(DE3) σε πλάκες συμπληρωμένες με 1 mM IPTG (Fisher Scientific, Geel, Βέλγιο).

2.1.2. Γονιδιακή σίγαση με παρεμβολή μέσω RNA (RNAi)

Η γονιδιακή σίγαση επιτεύχθηκε μέσω της τροφοδοσίας πλασμιδίων που εκφράζουν E.coli HT115(DE3) με dsRNA έναντι συγκεκριμένων γονιδίων [50]. Η σίτιση με RNAi εφαρμοζόταν συνεχώς από τη γέννηση μέχρι το θάνατο. Για τον προσδιορισμό αντοχής σε juglone με βακτήρια HT115(skn-1), εφαρμόστηκε τροφοδοσία RNAi από σκουλήκια L4 για 24 ώρες πριν μεταφερθούν σε φρέσκα τρυβλία juglone.

2.1.3. Στελέχη και ανάπτυξη E.coli

Τα βακτήρια αναπτύχθηκαν σε μέσο LB στους 37 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας. Κατά τη χρήση φορέων που φέρουν E.coli, το μέσο LB συμπληρώθηκε με 0.01 τοις εκατό αμπικιλλίνη και 0,0005 τοις εκατό τετρακυκλίνη. E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }), HT115(skn-1) και OP50 ελήφθησαν από τη βιβλιοθήκη RNAi Ahringer C. elegans [51].

2.1.4.Διάρκεια ζωής

Η ανάλυση της διάρκειας ζωής ξεκίνησε από έναν συγχρονισμένο πληθυσμό σκουληκιών, ο οποίος μεταφέρθηκε σε φρέσκες πλάκες NGM καθημερινά κατά τη διάρκεια της γόνιμης περιόδου. Μετά τη γόνιμη φάση, τα ζώα μεταφέρονταν κάθε μέρα. Κατά τη διαδικασία μεταφοράς βαθμολογήθηκαν νεκρά, ζωντανά και λογοκριμένα ζώα. Τα ζώα μετρήθηκαν ως νεκρά όταν δεν έδειξαν κίνηση, ούτε ανταπόκριση σε ένα χειροκίνητο ερέθισμα με σύρμα πλατίνας, ούτε δραστηριότητα άντλησης του φάρυγγα. Ζώα με εσωτερική εκκόλαψη (σακούλες) και εκραγμένο αιδοίο ή που πέθαναν αποξηραμένα στον τοίχο λογοκρίθηκαν. Ο αριθμός των νεκρών και λογοκριμένων ζώων χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση επιβίωσης στο OASIS[52] ή στο OASIS 2[53]. Για τον υπολογισμό της μέσης διάρκειας ζωής και της καμπύλης επιβίωσης στο OASIS και το OASIS 2, χρησιμοποιήθηκε ο εκτιμητής Kaplan-Meier και οι τιμές p υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή log-rank μεταξύ ομαδοποιημένων πληθυσμών ζώων.

2.1.5. Διάστημα κίνησης/υγείας

Η κίνηση ορίστηκε ως παράμετρος για την υγιή γήρανση και η φάση της ενεργητικής κίνησης αναφέρεται ως το διάστημα της υγείας. Αξιολογήθηκε στους πληθυσμούς που χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία διάρκειας ζωής. Τα ζώα, τα οποία είτε σέρνονταν αυθόρμητα είτε μετά από χειροκίνητο ερέθισμα, θεωρήθηκαν κινούμενα, ενώ νεκρά ζώα ή ζώα χωρίς συμπεριφορά έρπωσης θεωρήθηκαν ότι δεν κινούνταν. Η στατιστική ανάλυση έγινε όπως περιγράφεται για τη διάρκεια ζωής.

2.1.6. Θεραπεία κουρκουμίνης C. elegans

Η κουρκουμίνη (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) διαλύθηκε σε DMSO (Carl Roth, Καρλσρούη, Γερμανία) σε συγκέντρωση 100 mM και τροφοδοτήθηκε στο NGM μετά την αποστείρωση σε αυτόκλειστο. Η τελική συγκέντρωση κουρκουμίνης στα μέσα ήταν 100 μM (0,1 τοις εκατό DMSO). Οι πλάκες ελέγχου περιείχαν 0,1 τοις εκατό DMSO. Τα σκουλήκια αντιμετωπίζονταν συνεχώς ξεκινώντας από τα αυγά.

2.1.7. Ποσοτικοποίηση αδρανών PolyQ

Τα συσσωματώματα PolyQ40 οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (μεγέθυνση 100x) σε σκουλήκια 10- ημέρας αναισθητοποιημένα με αζίδιο του νατρίου 15 mM (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία). Για να εκτιμηθεί ο αριθμός των αδρανών, οι εικόνες συρράφτηκαν χρησιμοποιώντας το πρόσθετο συρραφής ζευγών Φίτζι [54] για τη δημιουργία ολόκληρων σκουληκιών και ο αριθμός των συσσωματωμάτων προσδιορίστηκε ποσοτικά στα Φίτζι [55] χρησιμοποιώντας το πρόσθετο "Analyze Particles".

2.1.8. Ποσοτικοποίηση συσσωματωμάτων x-Συνουκλεΐνης

-συσσωματώματα συνουκλεΐνης στους μυς της κεφαλής 7-σκουληκιών μιας ημέρας οπτικοποιήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού (400× μεγέθυνση) σε σκουλήκια αναισθητοποιημένα με αζίδιο του νατρίου 15 mM (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία, S2002 ). Οι εικόνες τμηματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Plastik (έκδοση 1.3.0) (Εργαστήριο της Anna Kreshuk στο Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) (διαθέσιμο στη διεύθυνση https://www.ilastik.org/, πρόσβαση στις 10 Απριλίου 2018)[56] . Οι τμηματικές εικόνες χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση του αριθμού των αδρανών στα Φίτζι [55] χρησιμοποιώντας το πρόσθετο "Analyze Particles".

2.1.9.Microarray και GO Term Analysis

Συλλέχθηκαν δείγματα από πέντε ανεξάρτητα αντίγραφα με περίπου {{0}}σκουλήκια ημέρας ανά συνθήκη και το RNA εξήχθη και φορτώθηκε σε ένα τσιπ Affymetrix. Τα ακατέργαστα δεδομένα μικροσυστοιχίας σε μορφή CEL αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό R (έκδοση 3.4.2) (R Foundation, Βιέννη, Αυστρία) και Bioconductor (The Bioconductor Project, Bioconductor is open source and open development) [57]. Διόρθωση υποβάθρου, κανονικοποίηση και υπολογισμός έκφρασης πραγματοποιήθηκαν με το oligo πακέτο58] και τη μέθοδο RMA. Για τον ποιοτικό έλεγχο του πίνακα, χρησιμοποιήθηκε το πακέτο arrayQualityMetrics 3.34.0 [59]. Λόγω των μέτρων ποιότητας, το δείγμα ahr{11}}C5 εξαιρέθηκε από περαιτέρω ανάλυση. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο limma και ένα γραμμικό μοντέλο και μετριοπαθή t-statistic με FDR για τον έλεγχο πολλαπλών συγκρίσεων [6{{20}}]. Εφαρμόστηκε τιμή p 0,1. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια αναλύθηκαν για εμπλουτισμό όρων γονιδιακής οντολογίας χρησιμοποιώντας Cytoscape(έκδοση 3.6.0) (The Cytoscape Consortium, ένας ανεξάρτητος μη κερδοσκοπικός οργανισμός)[61] με την προσθήκη ClueGo (έκδοση 2.5.0) (Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Παρίσι, Γαλλία)[62]. Τα δεδομένα μικροσυστοιχίας είναι προσβάσιμα μέσω του Gene Expression Omnibus accession no. GSE195769.

2.1.10. Ποσοτικοποίηση ROS

Τα MtROS ανιχνεύθηκαν σε ζωντανούς wt και ahr-1 μεταλλαγμένους σκουλήκια χρησιμοποιώντας MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Γερμανία). Τα νηματώδη συγχρονίστηκαν με ωοτοκία σε πλάκες IPTG χρησιμοποιώντας βακτήρια HT115 (L4440) ως τροφή. Στη συνέχεια, 48 ώρες αργότερα, 50 ζώα στο στάδιο L4 μεταφέρθηκαν σε πρόσφατα παρασκευασμένα τρυβλία 10μM MitoSOX Red που σπάρθηκαν με HT115 (L4440) που σκοτώθηκε με υπεριώδη ακτινοβολία. Τα σκουλήκια επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 20 βαθμούς. Μετά από επώαση 16 ωρών, μεταφέρθηκαν σε νέες πλάκες NGM που απλώθηκαν με ζωντανό HT115(L4440) για 1 ώρα για να αφαιρεθεί η υπολειμματική χρωστική από τα έντερα. Για απεικόνιση, τα νηματώδη τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες αγαρόζης 2 τοις εκατό, αναισθητοποιήθηκαν με την προσθήκη 10 mM λεβαμιζόλης και στερεώθηκαν με ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Γερμανία). Οι εικόνες ελήφθησαν αμέσως με ένα μικροσκόπιο Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Inc., Κολωνία, Γερμανία) χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό 40× και ένα φίλτρο DsRed. Στη συνέχεια, η περιοχή της κεφαλής του σκουληκιού επιλέχθηκε χειροκίνητα και η ενσωματωμένη ένταση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό απεικόνισης Fij 55.

2.1.11. Δοκιμασία αιθυλεστέρα τετραμεθυλροδαμίνης (TMRE).

Για να εκτιμηθεί το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, τα νηματώδη συγχρονίστηκαν με ωοτοκία σε πλάκες IPTG που είχαν σπαρθεί με βακτήρια HT115 (L4440). Την ημέρα του πειράματος, το TMRE (Invitrogen, Eugene, OR, USA) διαλύθηκε σε DMSO σε συγκέντρωση 5 mM και στη συνέχεια αραιώθηκε στα 30 μΜ με αδρανοποιημένο με θερμότητα HT115 (L4440) (30 λεπτά, 65 μοίρες). Προστέθηκαν συνολικά 150 μL αυτού του διαλύματος ανά πλάκα και αφέθηκαν να στεγνώσουν στο σκοτάδι για περίπου 30 λεπτά. Εξήντα ενήλικα σύγχρονα σκουλήκια σε 1, 3 ή 5 ημέρες ενηλικίωσης επιλέχθηκαν στις πλάκες TMRE που προετοιμάστηκαν και αφέθηκαν στον λεκέ για απορρόφηση για 2 ώρες στο σκοτάδι στους 20 βαθμούς. Μετά τη χρώση, τα σκουλήκια μεταφέρθηκαν σε πλάκες IPTG που σπάρθηκαν με αδρανοποιημένο με θερμότητα HT115 (L4440) και επωάστηκαν για 1 ώρα στο σκοτάδι στους 20 βαθμούς, για να απομακρυνθεί η υπολειμματική βαφή από τα έντερα.cistanche μέγεθος πέουςΓια απεικόνιση, 10 νηματώδεις τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες αγαρόζης 2 τοις εκατό, αναισθητοποιήθηκαν με προσθήκη 10 mM λεβαμισόλης και σταθεροποιήθηκαν με ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Γερμανία). Για κάθε πειραματική εκτέλεση, ετοιμάστηκαν 5 διαφάνειες ανά ομάδα. Οι εικόνες ελήφθησαν αμέσως με ένα μικροσκόπιο Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Κολωνία, Γερμανία) χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό 2,5× και ένα φίλτρο DsRed. Η ένταση φθορισμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τα Fiji [55].

2.1.12. Προσδιορισμός Ρυθμού άντλησης και Κινητικότητας Φάρυγγα

Τα νηματώδη N2 και CZ2485 συγχρονίστηκαν με λεύκανση [63] και τα αυγά αφέθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αυγών εκκόλαψης (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3) κατά τη διάρκεια της νύχτας, σε τροχιακό. Οι προνύμφες L1 εντοπίστηκαν σε NGM συμπληρωμένο με 1 mM IPTG και περιείχε 0,1 τοις εκατό DMSO ή 100 μM κουρκουμίνη. Τα βακτήρια HT115 (L4440) χρησιμοποιήθηκαν ως τροφή. Νεαρά ενήλικα σκουλήκια συλλέχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Μ9, φυγοκεντρήθηκαν (300 g x 3 λεπτά) και πλύθηκαν δύο φορές για να απομακρυνθούν τα βακτήρια. Τα σκουλήκια επωάστηκαν με0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) (100 σκουλήκια/100 μL), για 2 ώρες σε τροχιακή ανακίνηση. Τα σκουλήκια ελέγχου επωάστηκαν μόνο με ρυθμιστικό διάλυμα Μ9. Μετά από 2 ώρες, τα σκουλήκια μετακινήθηκαν σε NGM συμπληρωμένο με 1 mM IPTG και περιείχε 0,1 τοις εκατό DMSO ή 100 μM κουρκουμίνη και σπάρθηκαν με βακτήρια HT115 (L4440) ως τροφή. Ο ρυθμός άντλησης του φάρυγγα, βαθμολογημένος μετρώντας τον αριθμό των φορών που συσπάστηκε ο τερματικός βολβός του φάρυγγα σε διάστημα 1 λεπτού (αντλίες/λεπτό) και ο προσδιορισμός κινητικότητας, βαθμολογήθηκε μετρώντας τον αριθμό σωματικών σπασμών (καμψές σώματος/λεπτό) σε Το ρυθμιστικό διάλυμα Μ9 σε διάστημα 1 λεπτού βαθμολογήθηκε από 2 έως 20 ώρες αργότερα.

2.1.13. Δοκιμασία Οξείας Ευαισθησίας Juglone

Τα νηματώδη N2 και CZ2485 συγχρονίστηκαν με ωοτοκία σε πλάκες NGM είτε με DMSO είτε με 100 μM κουρκουμίνης. Οι πλάκες συμπληρώθηκαν με 1 mM IPTG και σπάρθηκαν με βακτήρια HT115(L4440) ή HT115(ugt-45) ​​ως τροφή. Για να αξιολογηθεί η επίδραση του δέρματος-1 RNAi, τα σκουλήκια συγχρονίστηκαν με ωοτοκία σε πλάκες DMSO ή κουρκουμίνης που είχαν σπαρθεί με βακτήρια HT115(L4440). Καθώς οι νηματώδεις έφτασαν στο στάδιο της προνύμφης L4, μεταφέρθηκαν για 24 ώρες σε DMSO ή πλάκες κουρκουμίνης που είχαν σπαρθεί με βακτήρια HT115(δέρμα-1). Τα ενήλικα σκουλήκια της ημέρας 1 (25 σκουλήκια) μεταφέρθηκαν σε φρέσκα τρυβλία NGM που περιείχαν 200 μM Juglone (Merck, Darmstadt, Γερμανία) και σπάρθηκαν με 25 μL 10× συμπυκνωμένων βακτηρίων ολονύκτια καλλιέργεια. Η επιβίωση των σκουληκιών κάτω από οξειδωτικό στρες που προκαλείται από γιουγκλόνη ελέγχθηκε με κίνηση που προκαλείται από την αφή κάθε ώρα, για 6 ώρες. Τα ζώα βαθμολογήθηκαν ως νεκρά όταν απέτυχαν να ανταποκριθούν στο άγγιγμα με ένα σύρμα από πλατίνα. Τα νηματώδη που είχαν αποξηρανθεί στον τοίχο λογοκρίθηκαν. Ο αριθμός των νεκρών και λογοκριμένων ζώων βαθμολογήθηκε και χρησιμοποιήθηκε η Online Application for Survival analysis OASIS2 για ανάλυση επιβίωσης [53].

2.1.14. Ποσοτικοποίηση του GST-4:Ένταση GFP

Τα NV35wt και NV35a συγχρονίστηκαν με ωοτοκία σε πλάκες NGM συμπληρωμένες με 1 mM IPTG και περιείχαν 0.1 τοις εκατό DMSO ή 100 μMκουρκουμίνη. Ως τροφή χρησιμοποιήθηκαν βακτήρια HT115(L4440), HT115(ugt-45) και HT115(skin-7). Για να απεικονιστεί ο φθορισμός GFP, ενήλικα σκουλήκια ημέρας 1 αναισθητοποιήθηκαν με διάλυμα υδροχλωρικής λεβαμισόλης 10 mM και τοποθετήθηκαν σε επιθέματα αγαρόζης 2 τοις εκατό. Οι εικόνες λήφθηκαν αμέσως με ένα μικροσκόπιο Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Κολωνία, Γερμανία), μεγέθυνση 2,5×) και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellProfiler (Η ομάδα έργου CellProfiler, Cimini Lab στο Broad Institute of MIT and Harvard, MA, ΗΠΑ). Εν συντομία, οι εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας μια διοχέτευση για να τμηματοποιηθούν τα σκουλήκια σε κάθε εικόνα από μικροσκοπία φωτεινού πεδίου και να τα διαχωριστούν από το φόντο. Στη συνέχεια, η ενσωματωμένη ένταση GFP μετρήθηκε ανά σκουλήκι.

2.1.15.Semi-Quantitative Real-Time PCR (qPCR) in C. elegans

Συλλέχθηκαν δείγματα από 3 ανεξάρτητα αντίγραφα με περίπου 1000 3-σκουλήκια ημέρας ανά συνθήκη και εκχυλίστηκε RNA. Μετά την πλύση και την έκλουση, η περιεκτικότητα σε RNA προσδιορίστηκε ποσοτικά με φασματοφωτομετρία και χρησιμοποιήθηκαν 1-2 ug RNA για τη σύνθεση cDNA (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία).σκόνη κιστάνιΤα ζεύγη εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1. Για την qPCR πραγματικού χρόνου, το cDNA αραιώθηκε σε 1:20 σε 10 mM TRIS (ρΗ 8,0). Για την αντίδραση, χρησιμοποιήθηκε το κιτ qPCR Green Core (Jena Biosciences, Jena, Γερμανία)) ή το κιτ GoTaq⑧ qPCR (Promega, Walldorf, Γερμανία). Τα δείγματα εκτελέστηκαν σε κυκλοποιητή MyiQ2 (BioRad, Feldkirchen, Γερμανία) και η έκφραση κάθε δείγματος μετρήθηκε εις διπλούν στην ίδια πλάκα πολλαπλών φρεατίων. Η έκφραση υπολογίστηκε σε σχέση με την πράξη γονιδίων αναφοράς-1 και το CDC-42 χρησιμοποιώντας το λογισμικό iO5. Όλα τα δεδομένα που συλλέχθηκαν ενεργοποιήθηκαν για γονιδιακή μελέτη σύμφωνα με τις οδηγίες χρήστη του BioRad και η έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την κανονικοποιημένη έκφραση (ddCr). Η αποτελεσματικότητα κάθε αντίδρασης ζεύγους εκκινητών προστέθηκε για τον σωστό ποσοτικό προσδιορισμό της κανονικοποιημένης έκφρασης. Η αποτελεσματικότητα εκτιμήθηκε με αραιώσεις 1:20, 1:100, 1:500 και 1:2500 του cDNA. Από κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης, η αναδίπλωση-αλλαγή σε σύγκριση με τον άγριο τύπο υπολογίστηκε για κάθε αντίγραφο.

2.2. Κύτταρα Θηλαστικών

2.2.1. Καλλιέργεια Κυττάρων Cos7

Κύτταρα Cos7 (ATTC, #CRL-1651) καλλιεργήθηκαν σε 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO, σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Γερμανία) με 1 τοις εκατό πυροσταφυλικό, 1 τοις εκατό Glutamax και 1 0 τοις εκατό εμβρυϊκός ορός βοοειδών (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Γερμανία) και επιπλέον πενικιλλίνη (10.{9}} μονάδες/mL)/Στρεπτομυκίνη (10.{11}} ug/). mL) Μόλις τα κύτταρα κατασκεύασαν ένα γρασίδι συρρέοντος κυττάρων, αποσπάστηκαν από τη βάση χρησιμοποιώντας 0,05 τοις εκατό Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Γερμανία).

2.2.2. Πλασμίδια επιμόλυνσης

Χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα πλασμίδια για τη διαμόλυνση των κυττάρων Cos7: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16, pcDNA3-AhA-1-VP16, pcDNA3-AhR -1(45 Ιουλίου)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Τα πλασμίδια περιγράφονται από τους Larigot et al. (υποβλήθηκε μαζί με αυτή τη μελέτη). Το πλασμίδιο p1A1-FL φέρει μια επαγόμενη από XRE λουσιφεράση, η Perl-TK φέρει μια λουσιφεράση ρενίλας και το pcDNA3-Ahr-1-VP16 και pcDNA3-AhA{{24 }}Αλληλουχίες μεταφοράς VP16 για την έκφραση των C.elegans AHR{-1 και AHA-1, αντίστοιχα. Για αυτήν τη μελέτη, δημιουργήσαμε pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16by κατευθυνόμενη από τοποθεσία μεταλλαξογένεση του pcDNA3-Ahr-1-VP16 πλασμιδίου με το QuikChange II Site-Directed Κιτ μεταλλαξογένεσης (Agilent, Santa Clara, CA, ΗΠΑ). Το ακόλουθο ζεύγος εκκινητών χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία μιας αντικατάστασης L σε A στο L363 και μιας αντικατάστασης H σε Q στο H365 του AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andLBD-R5'-CTCGTCGTCGTCGTCG} '. Υπερ-ικανά XL1-Μπλε κύτταρα μετασχηματίστηκαν με το ληφθέν πλασμίδιο για ενίσχυση. Η πλασμιδική αλληλουχία επαληθεύτηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger.

2.2.3. Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων Cos7

Στις 24 ώρες πριν από τη διαμόλυνση,20,000 κύτταρα/φρεάτιο σπάρθηκαν σε μια πλάκα 48-πηγαδιού σε 400 uL DMEM (συν 10 τοις εκατό FBS συν αντιβιοτικά) και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις πλασμιδίου χρησιμοποιώντας lipofectamine 200 (Invitrogen, Eugene, OR, USA): p1A1-FL(244ng/πηγάδι), Phil-TK(36ng/πηγάδι), pcDNA3- AhA-1-VP16 (5 ng/πηγάδι) και είτε pcDNA3-VP16 (10 ng/πηγάδι), pcDNA3-Ahr-1-VP16 (5 ng/πηγάδι) είτε pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16 (5 ng/πηγάδι) όπως περιγράφεται από τους Larigot et al. (υποβλήθηκε μαζί με αυτή τη μελέτη). Η Lipofectamine 2000 χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1 uL/φρεάτιο και προεπωάστηκε με τα αντίστοιχα πλασμίδια σε DMEM για 20 λεπτά πριν από τη χρήση. Για την παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα Cos7 επωάστηκαν με το μίγμα λιποφεκταμίνης/πλασμιδίου για 3hin DMEM (συν 10 τοις εκατό FBS) χωρίς αντιβιοτικά για να αποφευχθεί η επαγόμενη από αντιβιοτικά τοξικότητα. Στη συνέχεια, το μέσο επιμόλυνσης αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε από 400 μL/φρεάτιο DMEM (συν 10 τοις εκατό FBS συν αντιβιοτικά). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 βαθμούς. Σε κάθε πλάκα, 2 φρεάτια κυττάρων δεν επιμολύνθηκαν και έτσι χρησιμοποιήθηκαν για σκοπούς κανονικοποίησης. 2.2.4.Θεραπεία Κυττάρων Cos7

Παρασκευάστηκαν απόθεμα διαλύματα σε συγκεντρώσεις 1000-πλάσιες από την επιθυμητή συγκέντρωση επεξεργασίας για όλες τις ενώσεις. Η κουρκουμίνη (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία), το βενζο(α)πυρένιο (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία), η λεφλουνομίδη (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) και η λουτεΐνη (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία), διαλύθηκαν σε DMSO ( Carl Roth, Καρλσρούη, Γερμανία), ενώ η ρεσβερατρόλη (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) και η ροτενόνη (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) διαλύθηκαν σε αιθανόλη (Carl Roth, Καρλσρούη, Γερμανία). Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, το μέσο κυτταροκαλλιέργειας των κυττάρων αντικαταστάθηκε με ένα μέσο κυτταροκαλλιέργειας που περιείχε αραίωση 1:100 της αντίστοιχης ένωσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες πριν από την αξιολόγηση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης.

2.2.5. Δοκιμασία λουσιφεράσης (δραστηριότητα AhR)

Η μεταγραφική δραστηριότητα AhR αξιολογήθηκε μετρώντας τη δραστηριότητα μιας λουσιφεράσης που καθοδηγείται από XRE[64]. Για αυτό, χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα δοκιμασίας αναφοράς διπλής λουσιφεράσης (Promega, Wall Dorf, Γερμανία). Μετά από θεραπεία 24 ωρών, τα κύτταρα Cos7 πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια λύθηκαν για 15 λεπτά σε RT χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα παθητικής λύσης που περιλαμβάνεται στο κιτ Δοκιμασίας Αναφοράς Αναφοράς Διπλής Λουσιφεράσης. Συνολικά 20 μL των κυττάρων που λύθηκαν τοποθετήθηκαν σε μια λευκή πλάκα 96-πηγαδιού και χρησιμοποιήθηκαν για μετρήσεις φωταύγειας. Τα υποστρώματα λουσιφερίνης (LARII) και βανίλιας (Stop&cGlo) παρασκευάστηκαν σύμφωνα με την περιγραφή του κατασκευαστή. Τα δείγματα φορτώθηκαν σε ένα φωτόμετρο (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Γερμανία) και τα υποστρώματα προσαρτήθηκαν στο σύστημα σωλήνωσης του μετρητή φωταύγειας. Αρχικά, προστέθηκαν 65 uL LARII σε κάθε φρεάτιο του δείγματος και μετρήθηκε η φωταύγεια που παρήχθη από τη λουσιφεράση της πυγολαμπίδας, στη συνέχεια προστέθηκαν 65 μL αντιδραστηρίου Stop&clo και μετρήθηκε η φωταύγεια που παράγεται από τη λουσιφεράση Renilla. βήματα: Αρχικά, η φωταύγεια των μη επιμολυνθέντων κυττάρων αφαιρέθηκε από τη φωταύγεια κάθε δείγματος για διόρθωση υποβάθρου Στο επόμενο βήμα, κανονικοποιήσαμε τη φωταύγεια λουσιφεράσης στη φωταύγεια ρενίλας του ίδιου δείγματος για να εξαλειφθούν οι διαφορές στον ρυθμό διαμόλυνσης και στο κύτταρο Ένα άλλο βήμα κανονικοποίησης στα επιμολυσμένα κύτταρα με pcDNA-VP16 πραγματοποιήθηκε για κάθε ομάδα θεραπείας για την αφαίρεση του AhR-indep τελικές επιδράσεις στη λουσιφεράση που βασίζεται σε XRE.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants