Εφαρμογές Aptamer στη Νευροεπιστήμη Μέρος 2

Ένας άλλος νευροδιαβιβαστής, η σεροτονίνη, παίζει ρόλο στις δραστηριότητες νευροτροποποίησης που επηρεάζουν τον ύπνο, την επιθετικότητα, την όρεξη και τη σεξουαλική δραστηριότητα. Παράγεται σε διάφορα μέρη του σώματος, όπως ο εγκέφαλος, ο νωτιαίος μυελός, τα αιμοπετάλια και το έντερο [81-84].

Η σεροτονίνη είναι ένας νευροδιαβιβαστής που παίζει σημαντικό ρόλο στη σωματική και ψυχική υγεία του ανθρώπου. Στο ανθρώπινο σώμα, η σεροτονίνη ρυθμίζει τη διάθεση, ελέγχει την όρεξη και τον ύπνο και προάγει τα συναισθήματα σωματικής ευχαρίστησης και ευεξίας. Ωστόσο, η σεροτονίνη παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην επίδραση της μνήμης.

Η έρευνα έχει βρει ότι η σεροτονίνη μπορεί να προάγει την ενίσχυση της μνήμης ρυθμίζοντας τη σηματοδότηση μεταξύ των νευρώνων. Όταν οι άνθρωποι διεγείρονται θετικά, το σώμα απελευθερώνει σεροτονίνη, η οποία βοηθά στην ενίσχυση των συνδέσεων μεταξύ των νευρώνων και βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της μνήμης. Η σεροτονίνη μπορεί επίσης να κάνει τους ανθρώπους πιο δημιουργικούς, να βελτιώσει την πνευματική ευκινησία και να βοηθήσει τους ανθρώπους να μαθαίνουν και να σκέφτονται πιο γρήγορα.

Επιπλέον, η σεροτονίνη μπορεί να βοηθήσει στη μείωση των συμπτωμάτων του άγχους και της κατάθλιψης, προβλήματα διάθεσης που μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά τη συγκέντρωση και τη μνήμη των ανθρώπων. Μια χαρούμενη διάθεση και ψυχική κατάσταση μπορεί συχνά να προάγει την αναγνώριση και την ικανότητα εκμάθησης νέων πραγμάτων από τους ανθρώπους.

Συνοψίζοντας, η σεροτονίνη παίζει έναν απαραίτητο ρόλο στη μάθηση και τη μνήμη μας στη σωματική και ψυχική υγεία. Μπορούμε να αυξήσουμε την απελευθέρωση σεροτονίνης και [να βελτιώσουμε τη μνήμη] αλλάζοντας τις διατροφικές μας συνήθειες, την ποσότητα άσκησης, τις μεθόδους μάθησης κ.λπ., καλλιεργώντας μια θετική και υγιή νοοτροπία και προκαλώντας συνεχώς τους εαυτούς μας να προάγουμε συνεχώς την ενίσχυση της μνήμης. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola έχει αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και αντιγηραντικά αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στη μείωση της οξείδωσης και των φλεγμονωδών αντιδράσεων στον εγκέφαλο, προστατεύοντας έτσι τον υγεία του νευρικού συστήματος. Επιπλέον, το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη και την επισκευή των νευρικών κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τη συνδεσιμότητα και τη λειτουργία των νευρωνικών δικτύων. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στη βελτίωση της μνήμης, της μάθησης και της ταχύτητας σκέψης και μπορεί επίσης να αποτρέψουν την ανάπτυξη γνωστικής δυσλειτουργίας και νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Κάντε κλικ στα συμπληρώματα γνώσης για να ενισχύσετε τη μνήμη

Οι ανισορροπίες των επιπέδων της περιφερικής σεροτονίνης έχουν συνδεθεί με διάφορες ασθένειες, όπως η υπέρταση, η νεφρική νόσος και η κατάθλιψη. Έτσι, η χρήση σεροτονίνης για την πρόβλεψη της κατάστασης της νόσου και για την έναρξη της κατάλληλης θεραπείας έχει κλινική σημασία.

Αναπτύχθηκε μια πλασμονική δοκιμασία για τη σεροτονίνη με ένα συζυγές απταμερές-AuNP για το οποίο η συσσώρευση μεταβάλλεται λόγω της παρουσίας σεροτονίνης. Η αλλαγή στη συσσωμάτωση σωματιδίων μπορεί να μετρηθεί ως μετατόπιση στο μήκος κύματος κορυφής της απορρόφησης.

Η ανάλυση έδειξε ειδική απόκριση στη σεροτονίνη και δεν έδωσε στατιστικά σημαντικό σήμα με τους μεταβολίτες της, 5-υδροξυινδολεοξικό οξύ (5-HIAA), επινεφρίνη ή νορεπινεφρίνη όταν ο καθένας δοκιμάστηκε στο 1 μΜ.

Ο εμβρυϊκός ορός βοοειδών, ως μίμηση του ανθρώπινου ορού, επίσης δεν εκκίνησε κανένα σήμα [85]. Πρόσφατα, αναπτύχθηκαν νευροανιχνευτές εμφυτεύσιμου απταμερούς-φαινόμενου τρανζίστορ (FET) για την παρακολούθηση των επιπέδων σεροτονίνης στον εγκεφαλικό ιστό. Οι εξαιρετικά λεπτές επιφάνειες In2O3 των FET νανοκλίμακας τροποποιήθηκαν με απταμερή και αυτοί οι νευροανιχνευτές επέτρεψαν τα όρια ανίχνευσης σεροτονίνης fM in vivo με ελάχιστη βιοαπόθεση [86].

Με πρόσθετους νευροανιχνευτές, θα είναι δυνατές οι χωροχρονικές καταγραφές της νευρικής δραστηριότητας, έτσι ώστε οι λειτουργίες του εγκεφάλου να γίνουν κατανοητές σε πολύ βαθύτερο επίπεδο. Η επινεφρίνη είναι ένας νευροδιαβιβαστής κατεχολαμινών με ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών λειτουργιών για τις οποίες τα μη φυσιολογικά επίπεδα μπορεί να προκαλέσουν προβλήματα υγείας όπως αρρυθμία, έμφραγμα του μυοκαρδίου, αίμα αύξηση της πίεσης και πνευμονικό οίδημα.

Είναι σημαντικό να ποσοτικοποιηθεί η κυκλοφορούσα επινεφρίνη για την παρατήρηση αυτών των σχετικών ασθενειών. Με αυτόν τον στόχο, αναπτύχθηκε μια χρωματομετρική μέθοδος ανίχνευσης, βασισμένη στην αλληλεπίδραση της επινεφρίνης με το λειτουργοποιημένο με απταμερές Au-NP. Το σύστημα είναι λιγότερο ακριβό και πιο συγκεκριμένο από άλλες τεχνικές για τον ποσοτικό προσδιορισμό της επινεφρίνης, όπως με υγρή χρωματογραφία και φασματοφωτομετρία.

Επίσης, ένα όριο ανίχνευσης 0,9 nM προσδιορίστηκε με φασματοσκοπία UV-ορατής, το οποίο είναι το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης που έχει καταγραφεί για την επινεφρίνη χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε χρωματομετρική μέθοδο. Ανάλογα επινεφρίνης, 3,4-διυδροξυφαινυλοξικού οξέος (DOPAC), τρυπτοφάνης, ασκορβικού οξέος, ντοπαμίνης, τυροσίνης και ομοβανιλλικού οξέος, έδειξαν πολύ μικρή ή καθόλου ανταπόκριση, γεγονός που υποδηλώνει υψηλή ειδικότητα του απτααισθητήρα [87].

Μια αλλαγή στο επίπεδο ενός μεμονωμένου νευροδιαβιβαστή μπορεί να υποδεικνύει οποιαδήποτε από πολλές ασθένειες, γεγονός που καθιστά εξαιρετικά απίθανο να επιτευχθεί διάγνωση ασθένειας με βάση τη θεματική μέτρηση ενός μεμονωμένου νευροδιαβιβαστή. Ως εκ τούτου, η ικανότητα των περισσότερων απτααισθητήρων να ενσωματώνονται σε μια πλατφόρμα πολυπλεξίας θα έχει ως αποτέλεσμα διαγνωστικά εργαλεία πιο κατάλληλα για κλινικές και με τη δυνατότητα να υποστηρίζουν πιο ακριβείς ταυτοποιήσεις ασθενειών.

2.3. Ανίχνευση βιοδεικτών
Ένας βιοδείκτης είναι οποιαδήποτε ουσία, δομή ή διαδικασία στο σώμα που είτε έχει ως αποτέλεσμα ένα αποτέλεσμα είτε υποδεικνύει την παρουσία μιας συγκεκριμένης ασθένειας. Πολλοί βιοδείκτες είναι ουσίες που μπορούν να μετρηθούν σε βιορευστά όπως το αίμα, το σάλιο και τα ούρα.

Το κύριο πρόβλημα του χαρακτηρισμού βιοδεικτών για τις νευρολογικές παθήσεις είναι ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός (BBB) ​​μέσω του οποίου πολλά μόρια, συμπεριλαμβανομένων πολλών πρωτεϊνών, δεν μπορούν να περάσουν. Αν και οι πρωτεΐνες είναι οι κυρίαρχοι βιοδείκτες για ορισμένες ασθένειες, μικρά πεπτίδια, όπως το νευροπεπτίδιο Υ ή θραύσματα πρωτεϊνών, είναι πιο πιθανό να περάσουν από το BBB και να ανιχνευθούν στην κυκλοφορία.

Οι μεταβολίτες είναι μια άλλη σημαντική ομάδα βιοδεικτών για τις νευρολογικές διαταραχές. Η NeoVentures Biotechnology Inc. έχει αναπτύξει μια προσέγγιση επιλογής απταμερών που ονομάζεται FRELEX, η οποία επιτρέπει την επιλογή απταμερών με βάση τον ανταγωνισμό μεταξύ ενός βραχυολιγονουκλεοτιδίου που συνδέεται σε μια επιφάνεια και του στόχου. Όπως για το cell-SELEX και άλλες μορφές SELEX εναλλαγής δομής, αυτό το πρωτόκολλο μπορεί να εκτελεστεί με ένα δείγμα που περιέχει μείγμα συστατικών χωρίς προηγούμενη γνώση του στόχου (των) στους οποίους θα επιλεγούν τα απταμερή.

Με αυτές τις μορφές SELEX, πραγματοποιούνται μετρητικές επιλογές με συγκεκριμένα υποσύνολα συστατικών για να καθοδηγηθεί η επιλογή απταμερών που πληρούν τις επιθυμητές ιδιαιτερότητες. Χρησιμοποιώντας το FRELEX, επιλέχθηκαν απταμερή έναντι ορού από διαγονιδιακά ποντίκια που υπερέκφρασαν την ανθρώπινη πρωτεΐνη tau.

Για να οδηγηθεί η επιλογή απταμερούς προς την ανθρώπινη ταυ και τις συνέπειες της υπερέκφρασης ταυ, χρησιμοποιήθηκε ορός από ποντίκια άγριου τύπου στην αντιεπιλογή. Η ομάδα αναγνώρισε τις εμπλουτισμένες αλληλουχίες απταμερών χρησιμοποιώντας NGS και χαρακτήρισε ορισμένα απταμερή για διαγονιδιακά ποντίκια τελευταίου σταδίου και ποντίκια άγριου τύπου συγκρίνοντας τις σχετικές αφθονίες τους.

Υπέθεσαν ότι η διαφορά στην αφθονία αντανακλά την εκάστοτε συγκέντρωση των επιτόπων (αυξημένη ως απόκριση στην υπερέκφραση ταυ) με τα οποία τα απταμερή μπορούν να αλληλεπιδράσουν [29].

3. Διαγνωστικές και Θεραπευτικές Εφαρμογές

Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες (ΝΔ) περιλαμβάνουν τον εκφυλισμό των νευρώνων στον εγκέφαλο που έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια δομών και λειτουργιών του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η ND μπορεί να προκληθεί από γήρανση, γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες.

Η άνοια είναι μια από τις πιο κοινές ΝΔ που σχετίζονται με την ηλικία, όπως και η νόσος του Αλτσχάιμερ (AD). Η νόσος του Πάρκινσον (PD) μπορεί να οφείλεται σε γενετικές μεταλλάξεις ή/και περιβαλλοντικές τοξίνες. Η πλευρική αμυοτροφική σκλήρυνση (ALS), η σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ), η νόσος του Huntington (HD) και οι ασθένειες πριόν είναι άλλες κοινές ΝΔ με γενετικούς δεσμούς.

Δυστυχώς, ούτε αποτελεσματικές θεραπείες ούτε στρατηγικές έγκαιρης ανίχνευσης είναι διαθέσιμες για αυτές τις ασθένειες. Όπως τα ευρέως χρησιμοποιούμενα αντισώματα, τα απταμερή έχουν γίνει ελκυστικοί παράγοντες για εφαρμογή στην ανάπτυξη νέων βιοαισθητήρων για την έγκαιρη διάγνωση των ΝΔ και τη θεραπεία αυτών των ασθενειών [88].

3.1. Νόσος Αλτσχάιμερ

Ως προοδευτική διαταραχή του εγκεφάλου που σχετίζεται με την ηλικία και οδηγεί σε νοητικές ανεπάρκειες, η ΝΑ είναι η πιο κοινή μορφή άνοιας. Η παθολογία της χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση του αμυλοειδούς- (Α) που προέρχεται από την πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (APP) και ξεκινά στην περιοχή του εγκεφάλου του ιππόκαμπου.

Αν και οι επιστήμονες υπέθεσαν ότι η νευροτοξικότητα που προκαλείται από το Α συσχετίστηκε με τις αδιάλυτες πλάκες Α (ΑΡ) και τα ινίδια (AF), τα πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα διαλυτά ολιγομερή Α (AO) σχετίζονται επίσης με την έναρξη της AD.
Ως εκ τούτου, το AO έχει αναγνωριστεί ως ένας ελκυστικός βιοδείκτης για την έγκαιρη διάγνωση της AD και το A και το tau θεωρούνται σημαντικοί θεραπευτικοί στόχοι για τη θεραπεία της AD [89].

3.1.1. Διαγνωστικά AD

Τα αρχικά περιγραφέντα απταμερή έναντι του ΑΟ είχαν χαμηλές συγγένειες και ειδικότητες, αλλά οι μεταγενέστερες μελέτες ήταν πιο επιτυχημένες στον εντοπισμό απταμερών που αναγνώρισαν επιλεκτικά ινίδια μιας 40-υπολειμματικής μορφής πολυμερών Α (Α 40) αλλά όχι Α 40 [90].

Ωστόσο, το απταμερές δεν είχε υψηλή εξειδίκευση για τα ινίδια A 40 έναντι των ινιδίων πολλών άλλων αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών που δοκιμάστηκαν. Ένα απταμερές DNA που επιλέχθηκε για να αλληλεπιδράσει με ολιγομερές -συνουκλεΐνη ( -syn) με συγγένεια 68-nM φάνηκε επίσης να δεσμεύει ΑΟ με συγγένεια 25-nM [91]. Το 2019, χρησιμοποιώντας τα ίδια απταμερή που ελήφθησαν από τους Tsukakoshi et al., αναπτύχθηκε ένας ηλεκτροχημικός απτααισθητήρας χωρίς ετικέτα για πιο συγκεκριμένη αναγνώριση του AO [92].

Το απταμερές αυτοσυναρμολογεί τα παλιά ράβδο ηλεκτρόδια μέσω αλληλεπίδρασης θειόλης (-S) και το σύστημα έχει όριο ανίχνευσης 30 ppm, που καθορίζεται από το EIS. Αυτός ήταν ο πρώτος απταμερής που χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για την παρακολούθηση της συσσωμάτωσης πρωτεϊνών Α με βάση το EIS, κάτι που ήταν δυνατό λόγω της υψηλής εκλεκτικότητας του απταμερούς μεταξύ των ειδών Α. Με εύκολη κατασκευή και αποτελεσματική αναγέννηση, αυτός ο απτααισθητήρας μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο διαγνωστικό εργαλείο για την έγκαιρη ανίχνευση της AD και για την απόδειξη της συσσώρευσης πρωτεΐνης Α [92].

Ένας απτααισθητήρας για την ανίχνευση ολιγομερών Α αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το απταμερές DNA -syn [91] σε σύμπλοκο με μπλε του μεθυλενίου (MB) και προσαρτημένο σε νανοπορώδη ανοδικαλουμίνα. Ο υψηλός συντελεστής απορρόφησης MB για το λευκό φως είχε ως αποτέλεσμα μια χαμηλή ένταση ανακλώμενου λευκού φωτός.

Παρουσία ολιγομερών Α, το σύμπλοκο απταμερούς/ΜΒ διαχωρίστηκε και η αύξηση του ανακλώμενου φωτός ανιχνεύθηκε με συμβολομετρική φασματοσκοπία ανάκλασης (IRS) [93]. Ο απτααισθητήρας είχε ένα όριο ανίχνευσης 8 pM και μια καλή απόκριση στα ολιγομερή Α, στο εύρος συγκέντρωσης από 0.5 έως 50 nM. Τα νευροϊνίδια (NFTs) είναι παθολογικά χαρακτηριστικά της AD.

Ο σχηματισμός των NFTs ξεκινά στον ιππόκαμπο και η έκταση του σχηματισμού NFT σχετίζεται με τη σοβαρότητα της άνοιας στην AD. Η υπερφωσφορυλίωση της πρωτεΐνης που σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους, το tau προάγει την ικανότητά του να στρατολογεί και να οργανώνει το φυσιολογικό tau σε νήματα, τα οποία γίνονται τα NFT. Έτσι, η υπερφωσφορυλίωση της ταυ προτείνεται ως μία από τις κύριες αιτίες της AD.

Εκτός από τον κανονικό του ρόλο στην προώθηση της συναρμολόγησης μικροσωληνίσκων και στη σταθεροποίηση των συναρμολογημένων μικροσωληνίσκων, το tau παρατηρήθηκε με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση μη ισορροπίας (CE) για τη σύνδεση τριών τυχαία επιλεγμένων ολιγονουκλεοτιδίων ssDNA, ένα από τα οποία, ssDNA1, δεσμεύεται σε tau381 3}} ηΜ) [94].

Μια δοκιμασία απταμερούς/αντισώματος-σάντουιτς αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας ssDNA1 για την ανίχνευση των γυναικείων μοριακών συγκεντρώσεων πρωτεΐνης oftau στο ανθρώπινο πλάσμα με συντονισμό επιφανειακού πλασμονίου (SPR) [95].

Σε μια άλλη μελέτη, τα απταμερή DNA επιλέχθηκαν έναντι ολόκληρης της πρωτεΐνης tau των 441 αμινοξέων (tau441) με μια τεχνική ταχείας επιλογής που βασίζεται σε καταμερισμό τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης με τρεις κύκλους επιλογής που ολοκληρώθηκαν σε μία μόνο ημέρα. Πέντε απταμερή που επιλέχθηκαν από τα αποτελέσματα αλληλουχίας υψηλής απόδοσης αξιολογήθηκαν από το SPR για την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν ταυ.

Το αναλυτικό δυναμικό του απταμερούς με υψηλότερη συγγένεια αποδείχθηκε με μια δοκιμασία ανισοτροπίας ομογενούς φθορισμού φάσης. Αυτό το απταμερές υψηλής συγγένειας δεσμεύεται στην πρωτεΐνη tau441 και τις βραχύτερες ισομορφές, tau352, tau381 και tau383 με όρια ανίχνευσης 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM και 22 nM, αντίστοιχα, σε αυτόν τον προσδιορισμό [96].

3.1.2. AD Θεραπευτική

Ως μία από τις πιθανές θεραπείες, τα απταμερή RNA επιλέχθηκαν για την αναστολή της συσσωμάτωσης A 40. Κατά την επιλογή, ένα ολιγομερές Α συζεύχθηκε με νανοσωματίδια χρυσού (A-AuNPs) και δύο απταμερή αναγνωρίστηκαν ως υποψήφια απταμερή μετά το SELEX.

Τα παιδιά των 10–20 nM. Αυτά τα απταμερή ανέστειλαν το σχηματισμό πλάκας Α και ινιδίων, όπως αποκαλύφθηκε από την ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης και έναν ανοσοπροσροφητικό προσδιορισμό συνδεδεμένου με ένζυμο A 40 (ELISA) [97].

Το πεπτίδιο δόλωμα της αφυδρογονάσης της αλκοόλης (ABAD), το οποίο αλληλεπιδρά με το Α, ανταγωνίζεται την κυτταροτοξικότητα του πεπτιδίου Α. Η αλληλουχία ABAD-DP εισήχθη ανάμεσα σε δύο θειόλες που σχηματίζουν δισουλφιδικό δεσμό στη θειορεδοξίνη (TRX) για τη δημιουργία του απταμερούς πεπτιδίου TRX1-ABAD-DP-TRX2. Η σταθερή έκφρασή του σε κύτταρα NIH 3T3 χρησιμοποιώντας αδενο-σχετιζόμενους ιούς επαληθεύτηκε με χρώση ανοσοφθορισμού.

Το εκφρασμένο απταμερές θα μπορούσε να δεσμεύσει το πεπτίδιο Α και να βελτιώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Αυτή η έρευνα επιβεβαίωσε την αποτελεσματική αναστολή της κυτταροτοξικής δράσης του πεπτιδίου Α από πεπτιδικά απταμερή [98]. Οι πρωτεΐνες Tau συνήθως συνδέονται και σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους, αλλά η υπερφωσφορυλίωση τους μπορεί να οδηγήσει σε συσσωματώματα πρωτεϊνών που ονομάζονται «ταυοπάθεια», η οποία είναι τοξική.

Το απταμερές DNA Tau-1, το οποίο επιλέχθηκε έναντι του ανθρώπινου tau441, αναστέλλει τον ολιγομερισμό Tau1 in vitro [99]. Αυτή η αναστολή επικυρώθηκε επίσης σε μελέτες κυτταροκαλλιέργειας χρησιμοποιώντας κύτταρα HEK293 [100]. Η βήτα-εκκριτάση (BACE1) παίζει ρόλο στην παραγωγή Α και η αναστολή της έκφρασης του BACE1 είναι θανατηφόρα στα ποντίκια. Η θεραπεία για AD μπορεί να περιλαμβάνει τροποποίηση BACE1.

Ωστόσο, η μεγάλη ενεργή του θέση καθιστά το BACE1 έναν απαιτητικό στόχο για αναστολείς μικρών μορίων. Για να παρακαμφθεί αυτό, τα απταμερή νουκλεϊκών οξέων μπορεί να είναι νέα εργαλεία για την αναστολή της δραστηριότητας του BACE1. Αυτό το ένζυμο έχει μια κυτταροπλασματική ουρά, το B1-CT, που χρησιμεύει ως σημείο σύνδεσης για πρωτεΐνες όπως ο συνοδηγός χαλκού για την υπεροξειδική δισμουτάση-1 (CCS) και την πρωτεΐνη σύνδεσης παράγοντα ριβοζυλίωσης ADP (GGA1).

Ο φυσιολογικός ρόλος του B1-CT είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Το απταμερές RNA που στόχευε το B1-CT που δέσμευε στο εγγύς μισό μεμβράνης του C άκρου του BACE1 απέτρεψε τη στρατολόγηση CCS ενώ επέτρεψε τη δέσμευση του GGA1 στο BACE1 και ρυθμίζοντας τη μεταφορά του BACE1 σε ανακυκλώσιμα ενδοσώματα [101].

Για να στοχεύσουμε συγκεκριμένα το BACE1, τα απταμερή DNA, BI1 και BI2, δημιουργήθηκαν έναντι του BACE1, το οποίο ανέστειλε το BACE1 αλλά ούτε την άλφα ούτε τη γαμμα-εκκριτάση. Χρησιμοποιώντας μια σταθερά διαμολυνθείσα κυτταρική σειρά HEK293, εξέφρασαν τον πρόδρομο αμυλοειδούς πρωτεΐνης (APP) και, χρησιμοποιώντας μια in vitro ανάλυση μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET), έδειξαν ότι το επίπεδο Α μειώθηκε και η κυτταρική ανεπάρκεια διασώθηκε σε μια πρωτογενή καλλιεργημένη νευρωνική σειρά [102]. Η αποτελεσματικότητα του απταμερούς βελτιώθηκε περαιτέρω με την προσθήκη χοληστερυλοτετρααιθυλενογλυκόλης (TEG).

3.2. Νόσος Πάρκινσον

Η νόσος του Πάρκινσον (PD) είναι η δεύτερη πιο συχνή νευροεκφυλιστική νόσος, που επηρεάζει περίπου επτά εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως. Ενώ είναι μια προοδευτική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από κινητικά και μη κινητικά χαρακτηριστικά, έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις στους ασθενείς λόγω της απώλειας κινητικότητας και ελέγχου των μυών τους.

Η απώλεια των ραβδωτών ντοπαμινεργικών νευρώνων και η νευρωνική απώλεια σε μη ντοπαμινεργικές περιοχές χαρακτηρίζουν την PD. Η απώλεια νευρώνων σχετίζεται γενικά με το χαρακτηριστικό σχηματισμό σώματος Lewy. Έτσι, η παρουσία σωμάτων Lewy που περιέχουν -syn ολιγομερή στον εγκέφαλο θεωρείται πιθανός θεραπευτικός και διαγνωστικός στόχος για την PD.

3.2.1. Διαγνωστικά PD

Το πρώτο απταμερές, "M5-15", που επιλέχθηκε έναντι του -syn δεν είχε ειδικότητα για ολιγομερή και θα μπορούσε επίσης να συνδεθεί με μονομερή -syn [103]. Τα απταμερή DNA, τα οποία στη συνέχεια επιλέχθηκαν, δείχθηκε ότι αλληλεπιδρούν με ολιγομερή -syn και όχι με μονομερή -syn, αλλά δέσμευσαν τα ολιγομερή A 1-40.

Οι ερευνητές διερεύνησαν επίσης την εξειδίκευση του απταμερούς για -syn ολιγομερή έναντι άλλων πρωτεϊνών με δομές που είναι κυρίως φύλλο, όπως η δομή προπέλας φύλλου της αφυδρογονάσης γλυκόζης πυρρολοκινολίνης κινίνης (PQQH) και απέδειξαν ότι το απταμερές δεν δεσμεύει την ποικιλία [91]PQ.AH. των απτα-αισθητήρων έχει αναφερθεί ότι είναι ικανοί να ποσοτικοποιήσουν τα συνολιγομερή.

Ένας χρωματομετρικός απτααισθητήρας, που χρησιμοποιεί ένα απταμερές DNA έναντι του -συνολιγομερούς, προσροφήθηκε σε νανοσωματίδια χρυσού (AuNPs), τα οποία απέτρεψαν τη συσσωμάτωση των νανοσωματιδίων που προκλήθηκε από το άλας. Η σύνδεσή του με το ολιγομερές -syn εμποδίζει την απορρόφηση του απταμερούς στην επιφάνεια των AuNPs, γεγονός που επιτρέπει τη συσσώρευση των AuNPs να ενεργοποιηθεί σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος και οδηγεί σε αλλαγή χρώματος.

Αυτό το σύστημα αναφέρθηκε με LoD 10 nM. Ωστόσο, ο ορός (ακόμη και στο 2%) συνέβαλε στην απορρόφηση ενώσεων στο εύρος της αλλαγής χρώματος στον προσδιορισμό και παρενέβη στην εξαρτώμενη από το άλας συσσωμάτωση των απταμερών-Αυ-ΝΡ.

Οι απτααισθητήρες που χρησιμοποιούν EIS και SPR ήταν πιο ευαίσθητοι, με LoDs 1 pM και 8 pM, αντίστοιχα [104]. Ένας απτααισθητήρας EIS βρέθηκε εξαιρετικά ειδικός για ολιγομερή έναντι μονομερών και δεν επηρεάστηκε από την παρουσία ορού [104]. Ένας περίτεχνος σχεδιασμός για έναν ηλεκτροχημικό αισθητήρα για την ανίχνευση -syn ολιγομερές περιλάμβανε ένα υβρίδιο που σχηματίζεται από τη συμπληρωματική αλληλουχία σε ένα απταμερές ολιγομερές -syn συνδεδεμένο με μια επιφάνεια χρυσού μέσω ενός δεσμού θειόλης και περιλάμβανε τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράση (TdT) και dTTP για να επεκτείνει τα 30 άκρα του απταμερούς συμπλήρωμα με επιπλέον πολύποδα.

Το εκτεταμένο ssDNA συνέδεσε το μπλε του μεθυλενίου και προώθησε τη συσχέτισή του με την επιφάνεια του χρυσού, δημιουργώντας έτσι ένα ανηλεκτροχημικό σήμα. Επιπλέον, το σύστημα περιείχε εξωνουκλεάση Ι (Exo I), η οποία είναι ειδική για το ssDNA. Όταν το απταμερές απομακρύνθηκε από το δυαδικό σύμπλοκο με το συμπλήρωμά του μέσω της δέσμευσής του στο ολιγομερές -syn, οι συμπληρωματικοί κλώνοι χωνεύτηκαν από το Exo I, εμποδίζοντας τη συσσώρευση μπλε του μεθυλενίου στην επιφάνεια του χρυσού και έτσι μειώνοντας το ηλεκτροχημικό σήμα.

Το όριο ανίχνευσης ήταν 10 PM (S/N=3) και η ανάκτηση του σήματος παρουσία 10% και οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις ορού ήταν ένα πολύ αποδεκτό 95,3–107% [105]. Ωστόσο, η πολυπλοκότητά του και η ενσωμάτωση ενζύμων καθιστούν αυτό το σύστημα λιγότερο πιθανό να είναι σταθερό για αποθήκευση και να αναπαραχθεί στο πεδίο. Ένας συνδυασμός τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης-φασματομετρίας μάζας (CE-MS) με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) για προ-συγκέντρωση του στόχου με ένα μικροφυσίγγιο τροποποιημένο με απταμερές σε μεγάλο όγκο δειγμάτων με έγχυση μείωσε το όριο ανίχνευσης 100-πλάσιο σε σύγκριση με τα συστήματα CE-MS.

Σε αυτό το νέο σύστημα, το δείγμα καθαρίζεται και ο όγκος ελαχιστοποιείται για βελτιωμένη ανάλυση με τη χρήση μικροφυσιγγίου που συγκρατεί επιλεκτικά τον στόχο. Ένας ροφητής συγγένειας απταμερούς (AA) στο φυσίγγιο βρέθηκε να είναι μια ανώτερη εναλλακτική λύση έναντι του αντισώματος Ροφητικό με βάση την ανοσοσυγγένεια (IA) καθώς οι ηλεκτρολύτες υποβάθρου που απαιτούνται για την έκπλυση του συστήματος μετουσιώνουν επίσης τα αντισώματα.

Η ανάπτυξη ενός AA-SPE-CE-MS επιτεύχθηκε με την τροποποίηση του μικροφυσιγγίου με το απταμερές DNA M5-15. Το σύστημα επέδειξε LoD 2,8 nM και είχε εύρος γραμμικής ανίχνευσης μεταξύ 7 και 140 nM -syn στο δείγμα αίματος.

Επίσης, η ταυτοποίηση ελεύθερων και N-ακετυλιωμένων πρωτεομορφών-syn ήταν δυνατή ως αποτέλεσμα της υψηλής ακρίβειας ανίχνευσης μάζας και ικανότητας διάλυσης του MS. Τέλος, το μικροφυσίγγιο βρέθηκε σταθερό ακόμη και με όξινο BGE και μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για περίπου 20 αναλύσεις με χαμηλή πιθανότητα λανθασμένου ποσοτικού προσδιορισμού του στόχου [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com