Αντιοξειδωτικό και αντιγηραντικό δυναμικό μιας πεπτιδικής σύνθεσης (Gal2–Pep) συζευγμένο με γαλλικό οξύ

Το δέρμα είναι πολύ ευάλωτο στην πρόωρη γήρανσηλόγω εξωτερικού στρες, επομένως, σε αυτή τη μελέτη, μια σύνθεση πεπτιδίου, (γαλλοϋλ)2–KTPPTTP (Γαλ2–Pep) συντέθηκε με συνδυασμό TPPTTP πεπτιδίου και γαλλικούοξύ (GA). Όλα τα πεπτίδια συντέθηκαν σε ρητίνη 2-χλωροτριτυλοχλωριδίου χρησιμοποιώντας πεπτίδιο στερεάς φάσηςσύνθεσης (SPPS) και αναλύθηκε σε ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI)/τετραπολικό-χρόνος-του-flflight (Q-TOF) σύστημα φασματοσκοπίας μάζας (MS). Αρχικά ο Γαλ2–Το Pep δεν έδειξε τοξικότητα κάτω από τη συγκέντρωση 100mΜ με ποσοστό επιβίωσης κυττάρων 88 τοις εκατό για τα κερατινοκύτταρα καιινοβλάστες. οαντιδραστικά είδη οξυγόνου(ROS) δραστηριότητα σάρωσης της Gal2–Ο Pep ήταν πιο σταθερός σε σύγκριση με το GA μόνο. και μετά από τέσσερις εβδομάδες στο δωμάτιοθερμοκρασία, τουΔραστηριότητα καθαρισμού ROSπαρέμεινε υψηλότερο από 50 τοις εκατό. Επιπλέον, το σκεύασμα πεπτιδίου,Gal2–Ο Pep επέδειξε επίσης ανασταλτικό αποτέλεσμα ελαστάσης στο CCD-1064Skινοβλάστηςκύτταρα. Με βάση τα αποτελέσματα της RT-qPCR, αποδείχθηκε σε αυτή τη μελέτη ότι η Gal2–Ο Pep αύξησε την έκφραση του PGC-1a προς τηναποτρέψειοξειδωτικό στρες, και επικύρωσε τις δυνατότητές του ωςαντιγηραντικό παράγονταμεαυξάνοντας την έκφραση τουκολλαγόνο τύπου Ικαι απόμείωση της έκφρασης της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας-1 (MMP1). οευρήματα που ελήφθη ενισχύουν την πρόταση ότι το σκεύασμα πεπτιδίου που συντέθηκε σε αυτή τη μελέτη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ωςφυσικό αντιοξειδωτικόκαιαντιγηραντικό παράγονταγια τις καλλυντικές της εφαρμογές.

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα προϊόντα αντιγήρανσης Cistanche

1. Εισαγωγή

Γήρανση του δέρματοςεμφανίζεται ως αποτέλεσμα της σταδιακής μείωσης και της τελικής διακοπής της κυτταρικής διαίρεσης των κερατινοκυττάρων και των αδερφώνεκρήξεις μέσα στο δέρμα. Οι ρυτίδες στο δέρμα αναπτύσσονται καθώς μειώνεται ο αριθμός των κυττάρων, με την προκύπτουσα μετουσίωση της εξωκυτταρικής μήτρας να οδηγεί σε ξηρότητα και απώλεια ελαστικότηταςδερματίτιδα.1 Βλάβη στο ενδοκυτταρικό μιτοχονδριακό DNAκαι εμφανίζεται επίσης μείωση του ρυθμού πρωτεϊνοσύνθεσηςκατά τη διαδικασία γήρανσης του δέρματος.2 Η γήρανση του δέρματος έχει δύο βασικούς δρόμουςτρόπους, ενδογενείς και εξωγενείς, με την υπεριώδη (UV) έκθεση

βασικός μοχλός τηςεξωγενής γήρανση. Το υπεριώδες φως αντιδρά με κύρια συστατικά του δέρματος, συμπεριλαμβανομένων λιπιδίων, πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, για την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) που οδηγούν σε κύτταραθάνατος.3–5 Τα υπερβολικά επίπεδα ROS οδηγούν επίσης στη διάσπαση καιμη φυσιολογική σύνδεση αλυσίδων κολλαγόνου ή ελαστίνης και προάγουν την έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), όπως το MMP-1, που διασπούν το κολλαγόνο, οδηγώντας σε ρυτίδες του δέρματος καιεπιτάχυνση της γήρανσης του δέρματος.6,7 Ως εκ τούτου, αντιοξειδωτική θεραπεία για την αφαίρεσηΤο ROS και η ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού δυναμικού έχει τα πλεονεκτήματα να προστατεύει το δέρμα από τη γήρανση.

Εκτός από το ROS, η ελαστάση έχει σημαντικό ρόλο στην απώλειατην ελαστικότητα του δέρματος, η οποία διασπά την ελαστίνη, μια σημαντική πρωτεΐνη τουεξωκυτταρική μήτρα.8 Η ελαστίνη, λόγω της σημαντικής ελαστικής ανάκρουσής τηςχαρακτηριστικά, παρέχουν ελαστικότητα στο δέρμα, ενώ η ελαστάση έχειτην ικανότητα διάσπασης της ελαστίνης και άλλων πρωτεϊνών.8 Επομένως, αναστέλλετεη χρήση του ενζύμου ελαστάσης θα μπορούσε να είναι μια βασική στρατηγική για τη χαλάρωση του δέρματος μέσω αποτρέποντας την απώλεια της ελαστικότητας του δέρματος.

Σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάσαμε ένα νέο υλικό που συνδυάζει τοσυνενεργοποιητής γάμμα υποδοχέα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος1-άλφα (PGC-1aπεπτίδιο προερχόμενο από TPPTTP και γαλλικό οξύ (GA)για χρήση σε αντιγηραντικά καλλυντικά. Το GA είναι ένα φυτοχημικό που βρίσκεται σε διάφορα φρούτα και λαχανικά, συμπεριλαμβανομένων των σταφυλιών, των ντοματών και του πράσινου τσαγιού, που είναι γνωστό ότι έχει υψηλή αντιοξειδωτική και αντιβακτηριακή effects.9 Αν και το GA χρησιμοποιείται στις βιομηχανίες καλλυντικών και τροφίμων λόγω αυτών των ευεργετικών π.χffects, η διατύπωσή του τείνει να είναι ασταθής.10 Αναπτύξαμε έτσι (γαλλοϋλ)2–KTPPTTP (Γαλ2–Pep) προκειμένου να αυξηθεί η σταθερότητα του GA δεσμεύοντάς το στο PGC-1a-προερχόμενο πεπτίδιο TTPTTP.

Σε αυτή τη μελέτη, συνθέσαμε ένα (γαλλοϋλ)2–KTPPTTP (Γαλ2– Pep) σκεύασμα πεπτιδίου σε σύζευξη με γαλλικό οξύ και επιβεβαιώθηκετις δυνατότητές του ως αντιοξειδωτικό και αντιγηραντικό παράγοντα.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Υλικά

Dulbecco's ModifiedEagle's Medium (DMEM), πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS), φωσφορικό άλαςffέριξεαλατούχο διάλυμα (PBS) και θρυψίνη αγοράστηκαν από την Gibco (Carls

κακό, CA). Υδροξυβενζοτριαζόλη (HOBt), διισοπροπυλκαρβοδιιμίδιο (DIC), 1,8-διαζαδικυκλο[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-διισοπροπυλαιθυλαμίνη (DIEA), γαλλικό οξύ καιN-ηλεκτρυλο-τρι-αλανυλο-pνιτροανιλίδια ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).L-Σχηματίζουν αμινοξέα (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH και Fmoc-Pro–OH) αγοράστηκαν από την Bead-Tech (Σεούλ,Κορέα).

2.2. Σύνθεση πεπτιδίων και πεπτιδίων συζευγμένων με γαλλικό οξύ

Όλα τα πεπτίδια συντέθηκαν σε ρητίνη 2-χλωροτριτυλοχλωριδίου (200mmol κλίμακα, τιμή υποκατάστασης¼ 1,46 mmol g 1) χρησιμοποιώντας HOBt–Πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης με μεσολάβηση DIC (SPPS).

Η σύνθεση πεπτιδίων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο SPPS πραγματοποιήθηκε με ελαφρούς τρόπουςκατιόντα που αναφέρονται σε προηγούμενες μελέτες.11–13 το 2-Η ρητίνη χλωροτριτυλοχλωριδίου (CTC) διογκώθηκε σε διχλωρό

μεθάνιο (DCM, 8 mL) για 30 λεπτά. Η ρητίνη πλύθηκε μεδιμεθυλοφορμαμίδιο (DMF). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Fmoc προστατευμένα παράγωγα αμινοξέων (2 ισοδύναμα(Εξοδ.), για τοfiΤο πρώτο συνδεδεμένο αμινοξύ ή 5 ισοδύναμα, για τα άλλα αμινοξέα) συζεύχθηκαν είτε με DIEA (5 ισοδύναμα, για ένα συνδεδεμένο αμινοξύ) είτε με HOBt/DIC (6 ισοδύναμα/5 ισοδύναμα) σε DMF aπόδιαεεεεκτέλεση αποπροστασίας του Fmoc χρησιμοποιώντας 2 τοις εκατό (ν/ν) DBU σε DMF (2 φορές, 2 λεπτά τη φορά, 8 mL). Και όλα τα βήματα πλύθηκαν 5 φορές με DMF. Το τελικό γαλλικό οξύ συζεύχθηκε με πεπτίδια συνδεδεμένα με λυσίνη.Μετά τη σύζευξη του γαλλικού οξέος, η ρητίνη ήτανaλιωμένο, πλυμένο,και στέγνωσε υπό υψηλό κενό. Το διάλυμα διάσπασης (TFA:απιονισμένο νερό [DI]: TIS¼ 95: 2,5: 2,5, ο/ο/ο τοις εκατό) υποβλήθηκε σε αγωγή για 2 ώρεςγια να ληφθούν τα ακατέργαστα πεπτίδια. Τα ακατέργαστα πεπτίδια καταβυθίστηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό διαιθυλαιθέρα.

Αναλυτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης(RP-HPLC) διεξήχθη σε Waters 2695 SeparationsΜονάδα με στήλη Capcell Pak C18 (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Η κινητή φάση αποτελούνταν από 0,05 τοις εκατό TFA σε H2O (κινητή φάση Α) και 0.05 τοις εκατό TFA σε ακετονιτρίλιο (κινητή φάση Β).

Η έκλουση επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση για κινητάφάση Β από 5 τοις εκατό έως 65 τοις εκατό σε διάστημα 30 λεπτών σε αποσοστό ow 1.0 mL ελάχ 1. Οι κορυφές πεπτιδίου ανιχνεύθηκαν σε μήκος κύματος 230 nm. Η ημιπροπαρασκευαστική RP-HPLC διεξήχθη σε σύστημα Waters HPLC (Pump 600E, Detector UV-484) με Gemini RP-C18στήλη (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Η κινητή φάση αποτελούνταν από 0,05 τοις εκατό TFA σε H2O (κινητή φάση Α)και 0.05 τοις εκατό TFA σε ακετονιτρίλιο (κινητή φάση Β). Η έκλουση επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση για την κινητή φάση Β του7 τοις εκατό έως 22 τοις εκατό σε 15 λεπτά σε αlρυθμός ow 10 mL min 1. οκορυφές πεπτιδίου ανιχνεύθηκαν φασματοφωτομετρικά σε μήκος κύματος 230 nm.

Τα συντιθέμενα πεπτίδια διαλύθηκαν σε 5 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό και αναλύθηκαν σε ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI)/τετραπολικός-χρόνος-του-light (Q-TOF) διαδοχική φασματοσκοπία μάζας(MS) σύστημα (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Τα δείγματα εγχύθηκαν στο σύστημα Q-TOF εξοπλισμένο μεμια πηγή νανο-ψεκασμού στο αlποσοστό ow 1mL min 1. Το ιόν ESIΟι παράμετροι της πηγής ήταν οι εξής: τάση ψεκασμού ιόντων 1,5 kV, αέριο παραπετάσματος στα 10 psi και αέριο περιβλήματος στα 5 psi. Τα φάσματα σελειτουργία πλήρους σάρωσης και MS/MS συλλέχθηκαν στο εύρος τωνm/z

100–1200 Da σε χρόνο συσσώρευσης 25 ms ανά φάσμα.Η ενέργεια σύγκρουσης αυξήθηκε από 10 σε 80. Το προκύπτονΤα δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το Analyst TF έτσιεμπορευμάτων και αυτόματαεκχωρείται από κεντροειδές 80 τοις εκατό με ελάχιστη κορυφή, μείωση θορύβου 10 τοις εκατό, μεσαία αποϊσότοπο με όριο 3 τοις εκατό, χωρίς μείωση θορύβου και χωρίς εξομάλυνση. Τα συντιθέμενα πεπτίδια ταυτοποιήθηκανμε μαζική ανοχή του 0.05 Da και αλληλουχία χειροκίνητα χρησιμοποιώντας μια ανοχή MS/MS του 0.01 Da.

2.3. Κυτταρικές καλλιέργειες και δοκιμασίες βιωσιμότητας

Ανθρώπινα, ενήλικα, κύτταρα χαμηλού ασβεστίου, υψηλής θερμοκρασίας (HaCaT).και CCD-1064Sk (κανονικό ανθρώπινο δέρμαινοβλάστες) κύτταρα ήτανκαλλιεργείται σε DMEM με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37°C C σε θάλαμο υγροποιημένου αέρα με 5 τοις εκατό CO2.Για τις αναλύσεις βιωσιμότητας χρησιμοποιήθηκε κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Πεκίνο, Κίνα). Κύτταρα HaCaT και CCD-1064Skσπάρθηκαν σε μικροπλάκες 96-πηγαδιού (5 103 κύτταρα ανά φρεάτιο) και επωάστηκαν στους 37°C C σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των συντιθέμενων πεπτιδίων ή GA και επωάστηκαν στους 37°C C σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Βιωσιμότητα κυττάρωνστη συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα CCK-8 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.4. Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης

2.4.1. Δοκιμασία DPPH.Η αντιοξειδωτική δράση του συντιθέμενουπεπτίδια και GA αξιολογήθηκαν μεμονωμένα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία DPPH. Οι αναλύσεις DPPH πραγματοποιήθηκαν μετά από μια προηγουμένως αναφερθείσα

μεθοδολογία με δευτερεύουσες τροποποιήσειςκατιόν.12,14–16 Πρώτον, ένα 0,12 mg mL 1 Το διάλυμα DPPH παρασκευάστηκε σε μεθανόλη, μετά 100mL διαλύματος DPPH και 100mL από τα συντιθέμενα πεπτίδια ή GA αναμίχθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM και 1mM) σε μικροπλάκες 96-πηγαδιού. Σε έναν τροχιακό ανακινούμενο επωαστήρα, τοτα μίγματα αντέδρασαν για 30 λεπτά στους 37°C C και 100 στροφές χωρίςφως. Η απορρόφηση στη συνέχεια μετρήθηκε στα 517 nm και υπολογίστηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα.

2.4.2. Δραστηριότητα καθαρισμού ROS.

Η ενδοκυτταρική δραστηριότητα σάρωσης ROS αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ 20,{1}}διχλωροφλουορεσκεΐνης διοξικής(DCF-DA, Abcam, ΗΠΑ). Τα κύτταρα HaCaT σπάρθηκαν σε 96-μικροπλάκες φρεατίων (5 103 κύτταρα ανά φρεάτιο) και επωάστηκαν στους 37°C C για 24 ώρες.Aπόδιαμετά την επώαση, οι καλλιέργειες εκτέθηκαν στα συντιθέμενα πεπτίδια ή GA (100mΜ) και επωάστηκε στους 37°C C για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 10mΔιάλυμα M DCF-DA και επωάστηκε για 30 λεπτά. ΕΝΑπόδιαμετά την επώαση, το διάλυμα πλύθηκε με PBS. οΤα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών κατά τη διέγερση και

μήκη κύματος εκπομπής 485 nm και 530 nm, αντίστοιχα.

Εικ. 1Συνθετικό στάδιο και επιβεβαίωση αλληλουχίας πεπτιδίων χρησιμοποιώντας τετραπολικό χρόνο τουπτήση(Q-TOF) φασματομετρία μάζας: (α) λεπτομερής συνθετική διαδικασία (β) TPPTTP, (γ) γαλλοϋλιο–TPPTTP και (δ) (γαλλοϋλ)2–KTPPTTP.

2.5. Δοκιμασία δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης

Χρησιμοποιήθηκε βαφή JC-1 (Thermo Fisher, ΗΠΑ) για το μιτοχόνδριοδοκιμασία δυναμικού μεμβράνης (MmP). Κύτταρα CCD-1064Sk και HaCaT σπάρθηκαν σε μικροπλάκες 96-πηγαδιού (5 10 3κύτταρα ανά φρεάτιο)

και επωάστηκε στους 37 C και σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Πίσωη επώαση,οι καλλιέργειες εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των συντιθέμενων πεπτιδίων και επωάστηκαν στους 37°C C σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες.Η βαφή JC-1 προστέθηκε στα κύτταρα CCD-1064Sk και HaCaT γιαπαράγω α τελική συγκέντρωση 10mM. AπόδιαΜετά από 10 λεπτά επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 37 C PBS. Πράσινο και κόκκινοφθορισμόςμετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Varioskan LUXMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, ΗΠΑ) σε exciTation (lΠρώην)/εκπομπή (lΕμ) των 475/530 nm και αlΠρώην/lΕμαπό 475/590 nm, αντίστοιχα.

2.6. Δοκιμασία ανασταλτικής δραστηριότητας ελαστάσης

Τα κύτταρα CCD-1064Sk σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων και επωάστηκαν στους 37°C C σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια εκτέθηκαν σε συγκέντρωση 100mΜ των συντεθέντων πεπτιδίων ή GA και επωάστηκε στους 37°C C σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με dPBS δύο φορές και συλλέξαμε κάθε κύτταρο χρησιμοποιώντας ξύστρα κυττάρων. ΕΝΑπροσθέτοντας 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) με 0.1 τοις εκατό Triton-X στο συλλεχθένκύτταρα, τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν με υπερήχους. Το ομογενοποιημένο διάλυμα φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά στις 3000 rpmκαι 4 Γ. Στη συνέχεια, απόδιαλαμβάνοντας το υπερκείμενο, ποσότητες πρωτεΐνης-κατιόν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτεΐνης BCA. Πρωτεΐνη για το καθένατο δείγμα διανεμήθηκε στοfiεθνική συγκέντρωση 100mgmL 1, καιN-ηλεκτρυλο-τρι-αλανυλο-p-νιτροανιλίδη προστέθηκε στοτελική συγκέντρωση 1,6 mM και αντέδρασε στους 36°C C για 1 ώρα.Στη συνέχεια, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας.

2.7. RT-qPCR

Τα επίπεδα mRNA των δεικτών αντιγήρανσης στα κύτταρα CCK-1064Skαξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας RT-qPCR. Το συνολικό RNA συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) και αντίστροφη

μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Ιαπωνία). Ένα σύστημα CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) και iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tories) χρησιμοποιήθηκαν για RT-qPCR.b-Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για την ομαλοποίηση των επιπέδων mRNA του κολλαγόνου τύπου Ι, MMP-1 και PGC-1a. 

2.8. Στατιστική ανάλυση

 Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος τυπική απόκλιση απότρεις ανεξάρτητες μετρήσεις και αναλύθηκαν με χρήση Student'st-δοκιμές, με αp < 0.05 considered to be a signiδεν υπάρχει διαφορά.

Ζήτα περισσότερα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: συν 86 15292862950