Αντιοξειδωτικό και αντιγηραντικό δυναμικό μιας πεπτιδικής σύνθεσης (Gal2–Pep) συζευγμένο με γαλλικό οξύ Ⅱ

3. Αποτελέσματα και συζήτηση

3.1. Σύνθεση και σύζευξη γαλλικού οξέος με πεπτίδιο

Τα συντιθέμενα πεπτίδια TPPTTP, γαλλοϋλ-TPPTTP (Gal-Pep) και Gal2-Pep ελήφθησαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ημι-παρασκευαστική RP-HPLC. Το Σχ. 1α και το Σχήμα 1 δείχνουν τη στρατηγική σύζευξης του γαλλικού οξέος με το KTPPTTP ως Gal2–Pep. Στη μέθοδο SPPS, οι ακαθαρσίες που δημιουργούνται κατά τη σύνθεση πεπτιδίων συνήθως περιλαμβάνουν πεπτίδια που αντιδρούν πλευρικά, ομάδες προστασίας αμινοξέων και διαλύτες που χρησιμοποιούνται για σύνθεση και καθαρισμό. Το HOBt που χρησιμοποιείται στη σύνθεση πεπτιδίων είναι γνωστό ότι αναστέλλει τη ρακεμοποίηση και βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της σύνθεσης πεπτιδίων.17–19 Προκειμένου να αφαιρεθούν οι προστατευτικές ομάδες αμινοξέων και οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση, πραγματοποιήσαμε πλύση αρκετές φορές χρησιμοποιώντας διαλύτες όπως DMF και DCM κατά τη διάρκεια τη διαδικασία σύνθεσης πεπτιδίων. Ακόμη και μετά το τελευταίο στάδιο πλύσης, οι ακαθαρσίες συμπεριλαμβανομένων των ομάδων προστασίας των αμινοξέων εξακολουθούν να υπάρχουν σε ίχνη. Προκειμένου να επιτευχθεί η καθαρότητα πεπτιδίου άνω του 90 τοις εκατό που αναφέρθηκε από αρκετούς ερευνητές, πραγματοποιήθηκε 20-22 ημι-προπαρασκευαστική HPLC ως στάδιο στίλβωσης για να ληφθεί το τελικό πεπτίδιο καθαρότητας 99,2 τοις εκατό ως αποτέλεσμα της ανάλυσης HPLC (βλ. S1†). Το καθαρισμένο πεπτιδικό προϊόν αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Q-TOF για να επιβεβαιωθεί εκ νέου η επιτυχημένη σύνθεσή του (Εικ. 1b-d).

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το Cistanche Treat Anti-Aging

3.2. Δοκιμασίες βιωσιμότητας κυττάρων

3.3. Αντιοξειδωτική δράση των συντιθέμενων πεπτιδίων

Το TPPTTP δεν είχε δραστηριότητα δέσμευσης ριζών σε καμία συγκέντρωση, ενώ το GA, το Gal-Pep και το Gal2-Pep εμφάνισαν υψηλότερη δραστηριότητα σάρωσης ριζών με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση.

Σεσυγκεκριμένα, Γαλ2–Ο Πεπ έδειξε το πιο αποτελεσματικόαντιοξειδωτικόδραστηριότητα; σε συγκέντρωση 10mM, GA, Gal–Pep και Gal2–Ζωντάνιαείχε ριζική δραστηριότητα σάρωσης 13,6 τοις εκατό , 24,23 τοις εκατό και 26,0 τοις εκατό ,αντίστοιχα. Αυτό υποδεικνύει ότι η σύνδεση του TPPTTP στο GA συμβαίνεινα μην αναστέλλουν τη δραστηριότητα καθαρισμού ριζών. Εικ. 3β συνnfirms τοσταθερότητα των δειγμάτων ως συνΦιεξουδετερώθηκαν αξιολογώντας τη ριζοσπαστική τουςδραστηριότητα καθαρισμού όταν φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου. Η GA διατηρήθηκετη ριζική δραστηριότητά του σάρωση για έως και μία εβδομάδα αλλά, απόδιαδύο εβδομάδες, αυτή η δραστηριότητα μειώθηκε κατά περισσότερο από 60 τοις εκατό . Απο την άλληχέρι, Γαλ–Πεπ και Γκαλ2–Ο Πεπ διατήρησε τη δραστηριότητα καθαρισμούγια πάνω από δύο εβδομάδες. Ειδικότερα, ο Γαλ2–Ο Πεπ είχε ένα ριζοσπαστικό σκάψιμοδραστηριότητα κατά 50 τοις εκατό ακόμη και την τέταρτη εβδομάδα. Αυτά τα αποτελέσματαπροτείνουν ότι η δέσμευση του GA με το TPPTTP σταθεροποιεί τη ριζική σάρωση τουδραστηριότητα. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι το ασκορβικό οξύ σταθεροποιείταιδεσμεύοντάς το με πεπτίδια.12,25 Πιστεύουμε ότι το GA μπορεί να είναι σταθερόδεσμεύεται με ένα πεπτίδιο με τον ίδιο τρόπο.

οαντιοξειδωτική δράση των πεπτιδίωνδοκιμάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς DCF DA παρουσία ενδοκυτταρικού οξειδωτικού στρες που προκαλείται από H2O2 (Εικ. 4). Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας των δειγμάτων στα κύτταρα σε συγκέντρωση 100 mM, το DCF-DA φορτώθηκε στα κύτταρα και τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H2O2 για 30 λεπτά και η ένταση φθορισμού του DCF παρατηρήθηκε σε διέγερση μήκος κύματος 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 535 nm. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε οξειδωτικό στρες με 1 mM H2O2 εμφάνισαν ένταση φθορισμού που ήταν περισσότερο από τρεις φορές υψηλότερη από τον αρνητικό έλεγχο. Ωστόσο, η επεξεργασία Gal2-Pep παρήγαγε φθορισμό που ήταν μόνο το 67 τοις εκατό εκείνου που παρήχθη από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με H2O2. Παρουσία του TPPTTP, το οποίο δεν εμφάνισε ριζική δραστηριότητα σάρωσης (Εικ. 3α), το στρες ROS που προκαλείται από το H2O2 μειώθηκε κατά περίπου 20 τοις εκατό, υποστηρίζοντας προηγούμενη έρευνα που ανέφερε ότι το TPPTTP μειώνει τα επίπεδα ROS στα κύτταρα.24 Όταν τα κύτταρα έλαβαν θεραπεία μόνο με GA, δεν υπήρξε σημαντική αλλαγή στα επίπεδα ROS. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Gal2–Pep, το οποίο συνδυάζει δύο μόρια GA με ένα πεπτίδιο, είναι ένα σταθερό και αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό.

3.4. Επίδραση των συντιθέμενων πεπτιδίων στο δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκε βαφή JC-1 για τη διερεύνηση της επίδρασης των συντιθέμενων πεπτιδίων στο MmP (DJm). Το MmP δρα ως σημαντική παράμετρος για τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και είναι γνωστό ότι σχετίζεται με διάφορες ασθένειες όπως το Alzheimer και η νόσος Huntington.26 Η βαφή JC-1 παράγει ένα κόκκινο πουκάμισο από πράσινες εκπομπές συσσωρεύοντας στα μιτοχόνδρια και σχηματίζοντας συσσωματώματα J. Μετά την επεξεργασία των κυττάρων HaCaT και των ινοβλαστών με τα συντιθέμενα πεπτίδια για 24 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε βαφή JC-1 για 10 λεπτά και στη συνέχεια μετρήθηκε η ένταση φθορισμού χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (πράσινο lEx ¼ 475 nm και lEm ¼ 530 nm, κόκκινο lEx ¼ 475 nm και lEm ¼ 590 nm). Η αναλογία του κόκκινου προς τον πράσινο φθορισμό εκφράστηκε ως η αναδίπλωση-αλλαγή σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (Εικ. 5). Τα κύτταρα HaCaT που υποβλήθηκαν σε αγωγή με GA και το πεπτίδιο ανεξάρτητα δεν εμφάνισαν καμία σημαντική αλλαγή σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου, ενώ το Gal2-Pep εμφάνισε σημαντική διαφορά, αυξάνοντας κατά 1.{15}}πλάσια σε σύγκριση με τον έλεγχο. Τα κύτταρα ινοβλαστών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Gal2-Pep επίσης σημαντικά

Εικ. 4 Δοκιμασίες ενδοκυτταρικής αντιοξειδωτικής δραστηριότητας χρησιμοποιώντας DCF-DA σε συγκεντρώσεις γαλλικού οξέος και πεπτιδίου 100 mM. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, προστέθηκε H2O2 και επωάστηκε για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από μέτρηση της έντασης φθορισμού DCF. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

3.5. Ανασταλτική δράση ελαστάσης

3.6. Έκφραση γονιδίων κολλαγόνου τύπου Ι, MMP-1 και PGC-1a

Εικ. 7 Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης σε δερματικούς ινοβλάστες χρησιμοποιώντας RT-qPCR: (α) κολλαγόνο τύπου Ι, (β) MMP-1 και (γ) PGC-1α.

Η έκφραση του PGC-1a ήταν υψηλότερη μετά από 8 ώρες για όλες τις θεραπείες, με τα ποσοστά έκφρασης για GA, TPPTTP, Gal–Pep και Gal2–Pep να αυξάνονται κατά 2.06-, 1.{{6} }, 1.07- και 2.05-διπλώστε, αντίστοιχα. Ωστόσο, σε αντίθεση με τις άλλες θεραπείες, το Gal2–Pep αύξησε την PGC-1μια έκφραση κατά 1.27-πλάσια μετά από 24 ώρες. PGC-1αρυθμίζει τη σύνθεση και την αντιοξειδωτική δράση των μιτοχονδρίωνκαι αναφέρεται σεμειώνεται με τη γήρανση.29–32 Επομένως, το Gal2–Pep έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό που μπορεί να προστατεύσει αποτελεσματικά από τα ROS.

Συνολικά, το Gal2–Pep αύξησε την έκφραση του PGC-1a και του κολλαγόνου σε σύγκριση με τις επιδράσεις μόνο του GA και του TPPTTP, ενώη έκφραση του MMP-1 έτεινε να μειώνεται, απεικονίζοντας έτσι τις δυνατότητές του για χρήση σεαντιγηραντικά καλλυντικά. 

4. Συμπέρασμα

Συγκρούσεις συμφερόντων

Δεν υπάρχουν διενέξεις για δήλωση.

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση της Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS No. 1415165722) και την επιχορήγηση του Πανεπιστημίου Inha Research Grant.

βιβλιογραφικές αναφορές

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao and F. Ge, Nanomater. Nanotechnol., 2020, 10, 1–10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo and F. Formaggio, Amino Acids, 2012, 43, 1761–1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan and W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37–46.