Επιδράσεις αντιμελανογένεσης εκχυλίσματος φύλλων και φυτοχημικών από την ελιά Κεϋλάνης (Elaeocarpus Serratus) στο μοντέλο Zebrafish
Mar 23, 2022
Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Chi-Ya Huang 1, I-Hsuan Liu 2, Xiang-Zhe Huang 1, Hui-Jen Chen 1, Shang-Tzen Chang 1, Mei-Ling Chang 3, Yu-Tung Ho 1 και Hui-Ting Chang 1,*
Αφηρημένη:ομελανογένεσηανασταλτικό αποτέλεσμα σε ζέβρα (Danio rerio) καιαντιτυροσινάσηδραστηριότητα του αιθανολικούεκχύλισμακαι τα φυτοχημικά της από φύλλα ελιάς Κεϋλάνης (Elaeocarpus serratus Linn.) διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Μεταξύ του εκχυλίσματος φύλλων και των τεσσάρων διαλυτών κλασμάτων, το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα παρουσιάζει την καλύτερη αντιτυροσινάση καιαντιμελανογένεσηδραστηριότητες. Ένα φαινολικό οξύ, γαλλικοξύ και δύο φλαβονοειδή, η μυρικετίνη και σημαίνει κασσίτερος, απομονώνονται από τα ενεργά υποκλάσματα μέσω της απομόνωσης που καθοδηγείται από τη βιοδοκιμασία. Οι δομές τους διευκρινίζονται με βάση τις φασματοσκοπικές αναλύσεις 1D και 2D NMR, FTIR, UV και MS. Αυτές οι ενώσεις έχουν σημαντικέςαντιτυροσινάσηδραστηριότητα είτε χρησιμοποιεί L-τυροσίνη είτε L-DOPA ως υπόστρωμα. Η mearnsentin δείχνει τη βέλτιστη δραστηριότητα. Στην ενζυμοκινητική έρευνα, τόσο το γαλλικό οξύ όσο και η μεαρνσετίνη είναι οι ανταγωνιστικού τύπου αναστολείς κατά της τυροσινάσης των μανιταριών και η μυρικετίνη δρα ως μικτού τύπουτυροσινάσηανασταλτικός παράγοντας. Φύλλοεκχύλισμακαι το διαλυτό κλάσμα οξικού ανιθυλίου παρουσιάζουν αποτελεσματική απόδοση στην αναστολή του σχηματισμού μελανίνης σε έμβρυα ζέβρα. Η μεαρνσετίνη έχει επίσης μια πολλά υποσχόμενη αντιμελανογενετική δράση, η οποία είναι ανώτερη από τον θετικό έλεγχο,αρμπουτίνη. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι το εκχύλισμα φύλλων ελιάς Κεϋλάνης και τα φυτοχημικά του, ιδιαίτερα η μεαρνσετίνη, έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν ωςαντιμελανογένεσηκαι συστατικά λεύκανσης του δέρματος.
Λέξεις-κλειδιά: αντιμελανογενετική επίδραση; Ελαιόκαρπος οδοντωτός; μελανίνη; αναστολέας τυροσινάσης; ζέβρα
Βότανα κιστάνιααναστέλλει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης.
1. Εισαγωγή
Η μελανίνη παίζει ουσιαστικό ρόλο σε πολλές βιοχημικές λειτουργίες. παρέχει προστασία στο δέρμα από βλάβες από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV), την εξάλειψη των ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) και άλλες βιοχημικές αντιδράσεις [1-3]. Η υπερβολική συσσώρευση μελανίνης επιφέρει επίσης υπερμελάγχρωση, μέλασμα, κηλίδες ηλικίας, σκουρόχρωμο δέρμα κ.λπ. [4,5]. Στον ανατολικό κόσμο, οι άνθρωποι ενδιαφέρονται για το θέμα της λευκαντικής επίδρασης στο δέρμα. η βιομηχανία καλλυντικών είναι αφιερωμένη στην ανάπτυξη καλλυντικών για τη λεύκανση του δέρματος κατά της μελανογένεσης. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί, μεταξύ των οποίωντυροσινάσηανασταλτική δραστηριότητα, απομάκρυνση μελανοκυττάρων και παρεμβολή στη σύνθεση μελανίνης για να επιδειχθεί ανασταλτική δράση μελανογένεσης. Τα πολλά υποσχόμενα αντιδραστήρια που αναστέλλουν τη μελανογένεση έχουν ερευνηθεί από τη δεκαετία του 1940 [2,4,6,7]. Ωστόσο, μέροςμελανογένεσηΟι αναστολείς έχουν κάποιες παρενέργειες, π.χ., η υδροκινόνη μπορεί να προκαλέσει εξωγενή ωχρόνωση και μόνιμη υπομελάνωση [5,8]. Η υπερβολική ποσότητα κοτζικού οξέος μπορεί να οδηγήσει σε αλλεργίες και όγκους του θυρεοειδούς [9,10].
Πρόσφατα, οι ερευνητές έχουν αφοσιωθεί στην εύρεση πολλά υποσχόμενων μελανογόνων αντιδραστηρίων χωρίς/ήπιες παρενέργειες από φυτικά φυσικά προϊόντα [11-13]. ΦυσικόςτυροσινάσηΑναστολείς από φυτικές πηγές έχουν αναφερθεί, όπως απλές φαινόλες, φαινολικά οξέα, στιλβένια, φλαβονοειδή, λιγνάνες, τερπενοειδή, κινοειδή κ.λπ. [2,14-16]. Solano et al. ανέφερε ότι οι φαινολικές ενώσεις και οι άλλες φυσικές ενώσεις έχουν τη μεγάλη δυνατότητα αναστολής της φορμαλανίνης, π.χ. η αρβουτίνη (ένας γλυκοζίτης φαινόλης που βρίσκεται στο Arctostaphylos uva-ursi), το εκχύλισμα πράσινου τσαγιού, το άλφα υδροξυλικό οξύ (AHA), το ασκορβικό οξύ, και ούτω καθεξής [5 ].Αρμπουτίνηχρησιμοποιείται ευρέως ως βασικό συστατικό εμπορικών προϊόντων λεύκανσης στην αγορά [4,17]. Gallocatechin-3-O-gallate (GCG), epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG) και epicatechin {{6 }}Ο-γαλλικό (ΗΚΓ) εντοπίστηκε στο πράσινο τσάιεκχύλισμα; Αυτές οι ενώσεις έχουν καλή ανασταλτική αποτελεσματικότητα της τυροσινάσης [17]. Η Arctigenin, μια λιγνάνη που απομονώθηκε από το εκχύλισμα Fructus arctic, θα μπορούσε να μειώσει την περιεκτικότητα σε μελανίνη των εμβρύων zebrafish (Danio rerio) [18]. Οι Lee et al. ανέφεραν ότι οι ginsenosides από το Panax ginseng φύλλο και μούρο αναστέλλουν τηνμελανογένεσητου εμβρύου zebrafish? οι ενεργές τζινσενοσίδες είναι η ginsenoside Rh6, η vina-ginsenoside R4, η vina-ginsenoside R13, η ginsenoside Rh23 και η floralginsenoside A [19-21].
Elaeocarpus serratus Linn. (Tiliaceae), που συνήθως ονομάζεται ελιά Κεϋλάνης, διανέμεται στην Αφρική, την Αυστραλία και τη Νοτιοανατολική Ασία. Το τουρσί από τον βρώσιμο καρπό της ελιάς Κεϋλάνης είναι κοινό στη Σρι Λάνκα [22]. Χρησιμοποιείται παραδοσιακά για την πρόληψη των ψειρών και της πιτυρίδας στη Σρι Λάνκα. Οι βιοδραστηριότητες του εκχυλίσματος E. serratus αξιολογήθηκαν στις σχετικές μελέτες [22,23]. Το εκχύλισμα φύλλων E.serratus κατείχε αντιβακτηριδιακή δράση έναντι των Plesiomonas, Salmonella typhi και Proteus spp. σε συγκέντρωση 400 μg/mL με τη δοκιμασία διάχυσης πλάκας-οπής [23].Ε. Το εκχύλισμα φύλλων δακτυλίου είχε τη δυνατότητα να είναι ένα αντινεοπλασματικό, αντιμικροβιακό και παρασιτοκτόνο αντιδραστήριο στην έρευνα κυτταροτοξικότητας της δοκιμασίας θνησιμότητας γαρίδας άλμης (Artemia salina). το LC50 του φύλλουεκχύλισμαήταν 40 μg/mL έναντι της γαρίδας άλμης [23]. Αντιοξειδωτικές φλαβονολογλυκοσίδες, συμπεριλαμβανομένης της μυρικιτρίνης, της μεαρνσετίνης 3-Ο- -D-γλυκοπυρανοσίδης, της μεαρνσιτρίνης και της ταμαριξετίνης 3-Ο- -L-ραμνοπυρανοσίδης, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από το εκχύλισμα φύλλων E. serratus [22].
Οι στόχοι αυτής της μελέτης είναι η αξιολόγηση των επιδράσεων του φύλλου E. serratusεκχύλισμακαι τα κλάσματά του επάνωαντιτυροσινάσηδραστηριότητα (in vitro) καιμελανογένεσηανασταλτική δραστηριότητα inzebrafish (in vivo). Διεξήχθησαν τεχνικές κλασμάτωσης και απομόνωσης καθοδηγούμενες από βιοδοκιμές για να βρεθούν οι πολλά υποσχόμενες ενώσεις ως πιθανά συστατικά αντιμελανογένεσης. Η ανάπτυξη αποτελεσματικών συστατικών κατά της μελανογένεσης μπορεί να αυξήσει τη βέλτιστη χρήση των φυτικών φυσικών προϊόντων στη φαρμακευτική και καλλυντική βιομηχανία.
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Φυτικό Υλικό και Εκχύλιση
Τα φύλλα ελιάς Κεϋλάνης (Elaeocarpus serratus), ηλικίας περίπου 50 ετών, συλλέχθηκαν από το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, στην Ταϊπέι, στην Ταϊβάν τον Σεπτέμβριο. Φρέσκα φύλλα (3,95 kg) εκχυλίστηκαν με 95 τοις εκατό αιθανόλη για 7 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το φιλτραρισμένοεκχύλισμαξηράνθηκε υπό μειωμένη πίεση από έναν περιστροφικό εξατμιστή με θερμοκρασία λουτρού 50 ◦C [24]. Η απόδοση εκχυλίσματος φύλλων (0.32 kg) ήταν 12,0 τοις εκατό (β/β ξηρού βάρους).
κιστανάκιεκχύλισμα
2.2. Διαμέρισμα υγρού-υγρού
οεκχύλισμαυποβλήθηκε σε διαδοχική εκχύλιση με οργανικό διαλύτη με αύξουσα σειρά πολικότητας με διαχωρισμό υγρού-υγρού [24,25]. Το εκχύλισμα των φύλλων κλασματοποιήθηκε σε διαλυτό σε εξάνιο κλάσμα (HF, 9,1 τοις εκατό), διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα (EF, 11,3 τοις εκατό), κλάσμα διαλυτό σε η-βουτανόλη (BF, 17,3 τοις εκατό) και υδατοδιαλυτό κλάσμα (WF, 31). {13}} τοις εκατό ).
2.3. Χρωματογραφία στήλης και χρωματογραφία λεπτής στιβάδας
Το βιοδραστικό διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα κλασματοποιήθηκε περαιτέρω με χρωματογραφία στήλης πυριτικής πηκτής (CC). Η χρωματογραφία ανοιχτής στήλης πραγματοποιήθηκε με σταδιακή έκλουση με διαφορετική αναλογία η-εξανίου και οξικού αιθυλεστέρα [26]. Δεκαεννέα υποκλάσματα (E1-E19) ελήφθησαν με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) [27]. Οι αποδόσεις των υποκλασμάτων ήταν Ε1(1.05 τοις εκατό ), Ε2 (8,21 τοις εκατό ), Ε3 (1,64 τοις εκατό ), Ε4 (0,74 τοις εκατό ), Ε5 (1,52 τοις εκατό ), Ε6 ({ {59}}.86 τοις εκατό ), E7 (1,51 τοις εκατό ), E8 (9,50 τοις εκατό ), E9 (7,78 τοις εκατό ), E10 (3,97 τοις εκατό ), E11 (2,65 τοις εκατό ), E12 (8,49 τοις εκατό ), E13 (5,58 τοις εκατό), E14 (4,43 τοις εκατό), E15 (5,31 τοις εκατό), E16 (1,14 τοις εκατό), E17 (1,87 τοις εκατό), E18 (0,76 τοις εκατό) και E19 (2,96 τοις εκατό).
2.4. Υγρη ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ
Τα ενεργά υποκλάσματα του διαλυτού κλάσματος οξικού αιθυλεστέρα αναλύθηκαν και απομονώθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC, L-2130, Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία) εφοδιασμένη με μια παρασκευαστική στήλη RP-18 (Purospher®, STAR RP{{{ 3}} με άκρο, 250 × 10 mm, 5 μm). Η βαθμιδωτή κινητή φάση αποτελούνταν από νερό (Α) και ακετονιτρίλιο (Β). Ο ρυθμός ροής ήταν 3 mL/min. Το πρόγραμμα έκλουσης περιελάμβανε γραμμική κλίση από 30 έως 35 τοις εκατό Β στο Α για 0-15 λεπτά, 35 έως 100 τοις εκατό Β στο Α κατά 15-25 λεπτά, και ακολουθήθηκε από 5 λεπτά ισορροπίας με 100 τοις εκατό Β. Οι κορυφές που εκλούστηκαν ανιχνεύθηκαν από έναν ανιχνευτή UV στα 254 nm [25,28].
2.5. Ταυτοποίηση Απομονωμένων Ενώσεων
Οι δομές των απομονωμένων ενώσεων προσδιορίστηκαν και χαρακτηρίστηκαν με φασματικές αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένης της φασματοσκοπίας υπεριώδους-ορατής (UV/VIS, V-550, Jasco, Τόκιο, Ιαπωνία), φασματοσκοπίας υπέρυθρου μετασχηματισμού Fourier (FTIR, FTS{2} }, Bio-rad, Hercules, CA, USA) και φασματοσκοπία μάζας (MS, MAT-958, Finnigan, MA, ΗΠΑ). Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), συμπεριλαμβανομένου 1D (1H-NMR, 500 MHz, 13C-NMR, 125 MHz) και 2D NMR (HSQC και HMBC), καταγράφηκε με ένα φασματόμετρο Bruker AVII NMR (Bruker Avance, R. 29–32].
2.6. Δοκιμασία αντιτυροσινάσης και ενζυμική κινητική μελέτη
In vitroαντιτυροσινάσηο προσδιορισμός ήταν μια φασματοφωτομετρική ανάλυση βασισμένη στις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [33-35]. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκαν L-DOPA (3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνη) και L-τυροσίνη, αντίστοιχα. Στις μικροπλάκες 96-πηγαδιού, αναμίχθηκαν 40 μL διαλύματος δείγματος και 70 μL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου (0,1 Μ, pH 6,8), το οποίο ακολούθησε προσθήκη 50 μL 200 μονάδων/mL τυροσινάσης μανιταριού ( EC1.14.18.1) μετά από επώαση στους 25 ◦C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, προσθέσαμε 40 μL υποστρώματος 2,5 mM (L-τυροσίνη/L-DOPA) στο φρεάτιο και το μίγμα επωάστηκε για 10 λεπτά. Μετά την επώαση, η απορρόφηση στα 475 nmof κάθε φρεατίου μετρήθηκε με τον αναγνώστη ELISA (ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία) (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Γερμανία). Ο θετικός έλεγχος ήταναρμπουτίνη, και ο αριθμός των επαναλήψεων ήταν τρεις. Η ποσοστιαία αναστολή τουτυροσινάσηΗ δραστηριότητα υπολογίστηκε με την ακόλουθη εξίσωση: Αναστολή ( ποσοστό )=[(Acontrol–Acontrol's Blank)–(Asample–Asample's Blank)/(Acontrol–Acontrol's Blank)] × 100. Στη συνέχεια, η μισή-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση ( IC50) του δείγματος υπολογίστηκε από την καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης.
Η ενζυμική κινητική μελέτη αναλύεται με την αμοιβαία γραφική παράσταση Lineweaver-Burk του ρυθμού της αντίδρασης και της συγκέντρωσης του υποστρώματος για να αξιολογηθεί η επίδραση του δείγματος στη συγγένεια του υποστρώματος και του ενζύμου. Η συγκέντρωση τουτυροσινάσηδιατηρήθηκε σταθερά 200 μονάδα/mL, ενώ η συγκέντρωση του υποστρώματος (L-τυροσίνη/L-DOPA) κυμαινόταν σε 0.5, 0.75,1.0 , 1,25 και 1,5 mM. Η αντίδραση ήταν παρόμοια με τη δοκιμασία αντιτυροσινάσης όπως περιγράφεται παραπάνω· 40 μL διαλύματος δείγματος και 70 μL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου (0,1 Μ, ρΗ 6,8) αναμίχθηκαν, η οποία ακολουθήθηκε από την προσθήκη 50 μL 200 μονάδες/mL τυροσινάσης, μετά από επώαση σε ◦ 2°C C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, προσθέσαμε 40 μL του υποστρώματος στο φρεάτιο και το αναμείξαμε επιμελώς και οι κινητικές μετρήσεις του διαλύματος μετρήθηκαν αμέσως για μια περίοδο 3 minat του μήκους κύματος που ανιχνεύτηκε (475 nm). Και οι δύο κινητικές παράμετροι, η σταθερά Michaelis–Menten (Km) και η μέγιστη ταχύτητα (Vmax), υπολογίστηκαν από τη γραμμική εξίσωση Lineweaver–Burk [36–38].
2.7. Αξιολόγηση της επίδρασης της αντιμελανογένεσης σε Zebrafish
Τα ψάρια ζέβρα (Danio rerio) του στελέχους ΑΒ άγριου τύπου διατηρήθηκαν σε υγιές υδάτινο περιβάλλον στους 26–30 ◦C, με κύκλο φωτός-σκότους 14:10 ωρών. Μετά από 9 ώρες μετά τη γονιμοποίηση (hpf), τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 24-πηγαδιού (3 έμβρυα ανά φρεάτιο), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες τελικές συγκεντρώσεις δειγμάτων διαλυμένων σε 1 τοις εκατό DMSO και επωάστηκαν στους 28 ◦C για 48 ώρες (σε 57 hpf). Η ψηφιακή εικόνα ενός ζωντανού εμβρύου ζέβρα λήφθηκε μέσω στερεοσκοπικού μικροσκοπίου (Olympus SZ61, Τόκιο, Ιαπωνία) σε συνολική μεγέθυνση 40×. Στη συνέχεια, η περιεκτικότητα σε μελανίνη του εμβρύου ψαριού ζέβρα αναλύθηκε με το λογισμικό ImageJ. Οι θετικοί έλεγχοι ήταναρμπουτίνη(συστατικό λεύκανσης του δέρματος του εμπορίου) και 1-φαινυλ-2-θειουρία (PTU, ένας αναστολέας σύνθεσης μελανίνης). Ο αριθμός των επαναλήψεων ήταν έξι [21,39,40].
2.8. Στατιστική ανάλυση
Τα δεδομένα που ελήφθησαν στη μελέτη αναλύθηκαν με Σύστημα Στατιστικής Ανάλυσης (SAS) v 9.2 (Cary, NC, ΗΠΑ) με τη δοκιμή του Scheffe, η οποία είναι μια post hoc μέθοδος πολλαπλής σύγκρισης. Το διάστημα εμπιστοσύνης ορίστηκε στο 95 τοις εκατό.
dr vita OPC στολεύκανση δέρματος
3. Αποτελέσματα και συζήτηση
3.1. Δραστηριότητα αντιτυροσινάσης του εκχυλίσματος φύλλων του E. serratus και των κλασμάτων του
Το σχηματικό διάγραμμα εξαγωγής, απομόνωσης, ταυτοποίησης,αντιτυροσινάσηδραστηριότητα καιαντιμελανογένεσηεπίδραση του φύλλου E. serratusεκχύλισμαφαίνεται στο σχήμα 1. Το εκχύλισμα φύλλων κλασματοποιήθηκε περαιτέρω σε διαλυτό κλάσμα ν-εξανίου (HF), διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα (EF), διαλυτό κλάσμα n-βουτανόλης (BF) και υδατοδιαλυτό κλάσμα (WF) με υγρό -υγρή κατανομή.
Η τυροσινάση, που παράγεται από κύτταρα μελανοκυττάρων, παίζει βασικό ρόλο στην κατάλυση της περίπλοκης σύνθεσης μελανίνης. η εξερεύνηση τουτυροσινάσηο αναστολέας είναι ένας από τους σημαντικότερους τρόπους επιβράδυνσηςμελανογένεση[2,5,41]. Δραστηριότητες αναστολής της τυροσινάσης του φύλλουεκχύλισμακαι τέσσερα κλάσματα φαίνονται στο Σχήμα 2. Όταν χρησιμοποιήθηκε L-τυροσίνη ως υπόστρωμα, μόνο το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα είχε την ανασταλτική δράση έναντι της τυροσινάσης σε συγκέντρωση 400 μg/mL. Το εκχύλισμα φύλλων, το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα και το διαλυτό κλάσμα η-βουτανόλης εμφάνισαν τη δράση αντιτυροσινάσης όταν άλλαξαν το L-DOPA ως υπόστρωμα. Μεταξύ εκχυλίσματος φύλλων και τεσσάρων κλασμάτων, το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα έδειξε το καλύτεροαντιτυροσινάσηδραστηριότητα με τις τιμές IC50 279,38 και 166,95 ug/mL όταν χρησιμοποιούνται L-τυροσίνη και L-DOPA ως υπόστρωμα, αντίστοιχα (Πίνακας 1).
Πίνακας 1. Τιμές IC50 των ενεργών υποκλασμάτων έναντι της τυροσινάσης μανιταριού.
Το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα υποβλήθηκε στην κλασματοποίηση καθοδηγούμενη από βιοδοκιμασία χρησιμοποιώντας παρασκευαστικές χρωματογραφικές τεχνικές στήλης και χρωματογραφικές τεχνικές λεπτής στιβάδας και ελήφθησαν δεκαεννέα υποκλάσματα (Ε1-Ε19). Μεταξύ αυτών των υποκλασμάτων, τα υποκλάσματα Ε7-Ε10 έδειξαν την υψηλότερη ανασταλτική δράση της τυροσινάσης και στις δύο δοκιμές υποστρώματος (L-τυροσίνη και L-DOPA). Οι τιμές ημι-μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC50) των ενεργών υποκλασμάτων έναντιτυροσινάσηδίνονται στον Πίνακα 1. Οι τιμές IC50 όλων των υποκλασμάτων Ε7–Ε10 ήταν κάτω από 200 μg/mL. Τα υποκλάσματα Ε7 και Ε9 έδειξαν ακόμη καλύτερη απόδοση σε σύγκριση μεαρμπουτίνη, το οποίο είναι συστατικό λεύκανσης του εμπορίου.
3.2. Απομόνωση και Ταυτοποίηση Ενώσεων από Βιοενεργά Υποκλάσματα
Τρεις ενώσεις (ES1-3) απομονώθηκαν από βιοενεργά υποκλάσματα (E7-E10) με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Γαλλικό οξύ (ES1): λευκή σκόνη; mp 257 μοίρες ; UV (MeOH) λmax (log ε) 215,5 (3,94), 268.0 (3,46) nm; IR (KBr) νmax 3495, 3416, 3285, 1647, 1542 και 1220 cm−1; EI-MS m/z 171 [Μ συν Η] συν, σε συμφωνία με τον μοριακό τύπο C7H6O5. Μυρικετίνη (ES2): κίτρινη βελόνα. mp 358 μοίρες ; UV (MeOH) λmax (log ε) 252,5 (4,43) και 374,0 (4,50) nm. IR (KBr) νmax 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202 και 1171 cm−1. EI-MS m/z 319,36 [Μ συν Η] συν, μοριακός τύπος C15H10O8. Μεαρνσετίνη (4'-Ο-μεθυλμυρικετίνη, ES3): κίτρινη σκόνη; mp 184 μοίρες ; UV (MeOH) λmax (log ε) 259,5 (4,21) και 364,5 (4,26) nm. IR (KBr) νmax 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208 και 1163 cm−1. EI-MS m/z 333,0 [Μ συν Η] συν, μοριακός τύπος C16H12O8. Τα δεδομένα NMR αυτών των ενώσεων συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Οι χημικές δομές των ταυτοποιημένων ενώσεων φαίνονται στο Σχήμα 3.
Πίνακας 2. Δεδομένα 1Η, 13C και HMBC NMR των ενώσεων.
Μεταξύ αυτών των ενώσεων, το γαλλικό οξύ είναι ένα φαινολικό οξύ. η μυρικετίνη και η μεαρνσετίνη ανήκουν στα φλαβονοειδή. Τα περιεχόμενα κάθε ένωσης σε διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα και υποκλάσματα Ε7–Ε10 παρατίθενται στον Πίνακα 3. Το υποκλάσμα Ε7 ήταν πλούσιο σε μεαρνσετίνη (433,38 mg/g). το πρωτεύον υποκλάσμα Ε8 περιείχε γαλλικό οξύ (417,64 mg/g). Το κύριο συστατικό των υποκλασμάτων Ε9 και Ε10 ήταν η μυρικετίνη (406,41 και 336,41 mg/g, αντίστοιχα). Τα περιεχόμενα τριών ενώσεων στο διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα ήταν 59,72 mg/g (γαλλικό οξύ), 45,21 mg/g (μυρικετίνη) και 22,66 mg/g (μεαρνσετίνη).
3.3. Δραστηριότητα αντιτυροσινάσης και ενζυμική κινητική μελέτη απομονωμένων ενώσεων
ΑντιτυροσινάσηΗ δραστικότητα αυτών των ενώσεων από ενεργά υποκλάσματα αναπαρίσταται στον Πίνακα 4. Όταν χρησιμοποιήθηκε η L-τυροσίνη ως υπόστρωμα, η σειρά της δραστικότητας αντιτυροσινάσης των εξεταζόμενων ενώσεων ήταν μεαρνσετίνη > μυρικετίνη > γαλλικό οξύ > αρμπουτίνη. Η μεαρνσετίνη είχε το καλύτερο ανασταλτικό αποτέλεσμα με την τιμή IC50 των 56,57 μg/mL (0,17 mM). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στο L-DOPA που χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα. η αποτελεσματικότητα τριών φυτοχημικών ήταν ανώτερη από αυτή τουαρμπουτίνη.
Ένας πραγματικός αναστολέας ενζύμου περιέχει τέσσερις τρόπους αναστολής, συμπεριλαμβανομένων ανταγωνιστικού, μη ανταγωνιστικού, μικτού τύπου (τόσο ανταγωνιστικό όσο και μη ανταγωνιστικό) και μη ανταγωνιστικό [12]. Οι κινητικές σταθερές, Km και Vmax, προσδιορίζονται από τον αρχικό ρυθμό ενζύμου στο διαφορετικό υπόστρωμα συγκεντρώσεις στο οικόπεδο Lineweaver-Burk. τέμνονται στον άξονα y ισοδυναμεί με 1/Vmax, και τέμνονται στον άξονα x είναι −1/Km. Στην ενζυμική κινητική μελέτη τερπενοειδών ενώσεων από το αιθέριο έλαιο φλούδας εσπεριδοειδών κατάτυροσινάση, η κιτραλακτή ως μη ανταγωνιστικός αναστολέας και το μυρσένιο ήταν ένας ανταγωνιστικός αναστολέας [36]. Ο μηχανισμός αναστολής της 3,7-διολεϋλκερκετίνης έναντι της τυροσινάσης των μανιταριών ήταν μέσω του ανταγωνιστικού μοντέλου αναστολής για την καταστολή της παραγωγής μελανίνης [42].
Πίνακας 4. Τιμές IC50 ενώσεων κατά της τυροσινάσης μανιταριού
Ο τύπος αναστολής στην τυροσινάση τριών φυτοχημικών αποσαφηνίστηκε με μια in vitroenzyme κινητική μελέτη. Το σχήμα 4 δείχνει την γραφική παράσταση Lineweaver-Burk (διπλή αμοιβαία γραφική παράσταση) της μεαρνσετίνης. Στις αναλύσεις και των δύο υποστρωμάτων, της L-τυροσίνης και της L-Dopa, η γραμμή γραμμικής παλινδρόμησης διαφορετικών συγκεντρώσεων μεαρνσετίνης είχε την ίδια τομή στον άξονα y και την αυξανόμενη κλίση. Οι κινητικές παράμετροι του γαλλικού οξέος, της μυρικετίνης και της μεαρνσετίνης συνοψίζονται στον Πίνακα 5. Παρουσία γαλλικού οξέος ή μεαρνσετίνης, παρατηρήθηκε μια αύξηση στα Km και μια σταθερά στο Vmax, υποδεικνύοντας ότι τόσο το γαλλικό οξύ όσο και η μεαρνσετίνη ήταν ο ανταγωνιστικός αναστολέας της τυροσινάσης. Έδειξε ότι το γαλλικό οξύ και η μεαρνσετίνη θα μπορούσαν να συνδεθούν ελεύθερατυροσινάσημε υψηλή συγγένεια και αποτρέπουν τη δέσμευση του υποστρώματος (L-τυροσίνη ή L-DOPA) στην ενεργό θέση της τυροσινάσης. Η μυρικετίνη βρέθηκε ότι είναι ένας αναστολέας μικτού τύπου, που περιέχει ανταγωνιστική και μη ανταγωνιστική αναστολή αφού το Km αυξήθηκε και το Vmax μειώθηκε. Η μη ανταγωνιστική αναστολή έδειξε ότι οι ενώσεις συνδέονται με το σύμπλεγμα τυροσινάσης-υποστρώματος αλλά όχι με την ελεύθερη τυροσινάση.
3.4. Αντιμελανογένεση Επιδράσεις Εκχυλίσματος, Κλασμάτων και Απομονωμένων Φυτοχημικών
Το Zebrafish (Danio rerio) είναι ένα νέο και έγκυρο πρότυπο οργανισμό για την έρευνα μελανογένεσης σε πρόσφατες μελέτες [18-21,40]. οαντιμελανογένεσητα αποτελέσματα του εκχυλίσματος φύλλων και των τεσσάρων κλασμάτων στην in vivo δοκιμασία zebrafish φαίνονται στο σχήμα 5. Το φύλλοεκχύλισμακαι το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλίου παρουσίασαν καλή απόδοση στην αναστολή του σχηματισμού μελανίνης εμβρύων inzebrafish. Σε συγκέντρωση 200 μg/mL, το εκχύλισμα φύλλων και το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα ανέστειλαν το 27,72 τοις εκατό και το 35,60 τοις εκατό της παραγωγής μελανίνης των εμβρύων ψαριών ζέβρα, αντίστοιχα. Όλες οι θεραπείες δεν επηρέασαν την ανάπτυξη των εμβρύων zebrafish με ποσοστό επιβίωσης 100 τοις εκατό.
Το Σχήμα 6 παρουσιάζει τις επιδράσεις των ενώσεων και των θετικών μαρτύρων, PTU και αρβουτίνης, στομελανογένεσηζέβρα σε συγκέντρωση 50 μΜ. Το PTU είναι ένα ισχυρότυροσινάσηαναστολέας για την πρόληψη της παραγωγής μελανίνης, ενώαρμπουτίνηείναι εμπορικός παράγοντας λεύκανσης του δέρματος. Και οι δύο θετικοί μάρτυρες θα μπορούσαν να μειώσουν το σχηματισμό μελανίνης στο ζέβρα. Μεταξύ των τριών φυτοχημικών, η μυρικετίνη έδειξε μια ελαφρά επίδραση αναστολής της μελανίνης, ενώ η μεαρνσετίνη είχε την καλύτερη ανασταλτική δράση της μελανογένεσης στα ψάρια ζέβρα.
Οι αποτελεσματικές συγκεντρώσεις τουμελανογένεση inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >μεαρνσετίνη >αρμπουτίνηκαι μυρικετίνη > γαλλικό οξύ. Η μεαρνσετίνη επέδειξε την καλύτερη αποτελεσματικότητα με τιμή IC50 121,01 μΜ μεταξύ των εξετασθέντων φυτοχημικών.
Για περισσότερες πληροφορίες, κάντε κλικ στην εικόνα.
4. Συμπεράσματα
ομελανογένεσηανασταλτικό αποτέλεσμα καιαντιτυροσινάσηΗ δραστηριότητα του εκχυλίσματος φύλλων από την ελιά Κεϋλάνης (E. serratus) αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Ανάμεσα σε φύλλαεκχύλισμακαι τα τέσσερα κλάσματα του, το διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα είχε το καλύτεροαντιτυροσινάσηδραστηριότητα. Τα φυτοχημικά, συμπεριλαμβανομένου του γαλλικού οξέος, της μυρικετίνης και της μεαρνσετίνης, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από τα ενεργά υποκλάσματα με χρωματογραφία και φασματικές αναλύσεις καθοδηγούμενη από βιοδοκιμασία. Η σειρά δραστικότητας αντιτυροσινάσης αυτών των ενώσεων ήταν μεαρνσετίνη > μυρικετίνη > γαλλικό οξύ. Η in vitro κινητική μελέτη ενζύμων αποκαλύπτει ότι το γαλλικό οξύ και η μεαρνσετίνη ήταν ανταγωνιστικοί αναστολείς της τυροσινάσης και η μυρικετίνη ήταν αναστολέας μικτού τύπου. Τα αποτελέσματα από την in vivo δοκιμασία zebrafish αποκάλυψαν ότι ένα διαλυτό κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα και τρία φυτοχημικά κατείχαν σημαντικήμελανογένεσηανασταλτικές επιδράσεις. Η αντιμελανογενετική δράση της μεαρνσετίνης ήταν ανώτερη από αυτή του θετικού μάρτυρα,αρμπουτίνη, σε ζέβρα.
