Αντιμυκητιασικό δυναμικό δευτερογενών μεταβολιτών που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ παθογόνων εσπεριδοειδών και σιτανικής

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Τα εσπεριδοειδή έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην παγκόσμια οικονομία αφού έχουν τη μεγαλύτερη παραγωγή σε σύγκριση με άλλα φρούτα. για παράδειγμα, η παγκόσμια παραγωγή πορτοκαλιού για το 2018/19 προβλέπεται να φτάσει τους 54,3 εκατομμύρια τόνους. Ο κύριος παράγοντας που επηρεάζει την ποιότητα των εσπεριδοειδών είναι η μετασυλλεκτικήμυκητιασικές ασθένειες,Ειδικότερα, η πράσινη μούχλα που προκαλείται από το Penicillium digitatum που ευθύνεται για το 90 τοις εκατό των απωλειών εσπεριδοειδών κατά την περίοδο μετά τη συγκομιδή1,3. Για τον έλεγχο των ασθενειών μετά τη συγκομιδή, χρησιμοποιούνται ευρέως συνθετικά μυκητοκτόνα, προκαλώντας προβλήματα υγείας και περιβάλλοντος. Επιπλέον, ορισμένα στελέχη μυκήτων έχουν αναπτύξει αντοχή στα κοινώς χρησιμοποιούμενα μυκητοκτόνα. Οπως καιαντιμυκητιακόΗ αντίσταση γίνεται μια σημαντική ανησυχία, η αναζήτηση νέων βιοδραστικών ενώσεων έχει σημαντικό ρόλο στην παράκαμψη της εκτεταμένης χρήσης μυκητοκτόνων7. Οι μικροοργανισμοί είναι μια από τις κύριες πηγές για φυσικά προϊόντα με χρήσιμες βιολογικές δραστηριότητες, δηλαδή δυνατότητεςαντιμυκητιακά, αντιβιοτικά, αντικαρκινικοί παράγοντες, επιφανειοδραστικές ουσίες. Ωστόσο, εκτός από το γενετικό δυναμικό και την ποικιλομορφία των μικροβίων, πολλά μικροβιακά βιοσυνθετικά γονίδια δεν ενεργοποιούνται στις αφύσικές συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο και μόνο μερικά μέρη των μεταβολιτών είναι προσβάσιμα10. Εφαρμόζονται διάφορες στρατηγικές για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί στην ανακάλυψη φυσικών προϊόντων από μικροβιακές πηγές, π.χ., η προσέγγιση OSMAC10,11, η χρήση επιγενετικών τροποποιήσεων και η συγκαλλιέργεια14. Οι συνκαλλιέργειες που μιμούνται φυσικά περιβάλλοντα, παρουσιάζοντας μικροβιακό ανταγωνισμό για περιορισμένο χώρο και θρεπτικά συστατικά, έχουν αποκαλυφθεί ότι είναι μια σημαντική οικολογική δύναμη που θα μπορούσε να ενεργοποιήσει αθόρυβα γονίδια και αμυντικούς μηχανισμούς που μπορούν να οδηγήσουν στην παραγωγή βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών. Τα πειράματα συνκαλλιέργειας είναι εξαιρετικά 1 Institute of Chemistry, University of Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazil. 2 Κέντρο Φυσικών και Ανθρωπίνων Επιστημών, Ομοσπονδιακό Πανεπιστήμιο ABC, 09210-580, Santo André, SP, Βραζιλία. 3 Τμήμα Βιομοριακής Χημείας, Ινστιτούτο Leibniz για Έρευνα Φυσικών Προϊόντων και Βιολογία Λοιμώξεων – Ινστιτούτο Hans Knöll, Ιένα, Γερμανία. 4 Chair of Natural Product Chemistry, Friedrich Schiller University Jena, 07743, Jena, Germany. σημαντικό για να επιτρέπει όχι μόνο την ταυτοποίηση νέων ενώσεων αλλά και τη διερεύνηση χημικών γεγονότων που διέπουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ μικροοργανισμών στη φύση. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν πληροφορίες για το πώς αλληλεπιδρούν οι παθογόνοι μύκητες των εσπεριδοειδών με άλλους μικροοργανισμούς στο ίδιο περιβάλλον και ποιοι είναι οι μηχανισμοί επίθεσης και άμυνας έναντι ενδοφυτικών μικροοργανισμών ή άλλων φυτοπαθογόνων. Αυτές οι πληροφορίες μπορεί να οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων δευτερογενών μεταβολιτών που εμπλέκονται σε μικροβιακές αλληλεπιδράσεις και να παρέχουν καλύτερη γνώση σχετικά με τη σημασία της μικροβιακής οικολογίας κατά τη διαδικασία μόλυνσης. Εδώ δείχνουμε μια αλληλεπίδραση μεταξύ Penicillium digitatum και Penicillium citrinum, με στόχο την αναζήτηση νέωναντιμυκητιακόενώσεις που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο ασθενειών μετά τη συγκομιδή. Λαμβάνοντας υπόψη αυτόν τον σκοπό, εφαρμόστηκαν στρατηγική συν-καλλιέργειας και MSI για να προκαλέσουν την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών και να παρέχουν αρχικές γνώσεις σχετικά με τον βιολογικό τους ρόλο με βάση τη χωρική κατανομή τους στην αλληλεπίδραση. Οι μεταβολίτες που μας ενδιαφέρουν απομονώθηκαν και όλες οι δομές διευκρινίστηκαν με βάση πειράματα φασματομετρίας μάζας και NMR. Ακόμη,αντιμυκητιακόπραγματοποιήθηκαν αναλύσεις και αναλύσεις συνεστιακής μικροσκοπίας προκειμένου να διερευνηθεί η δυνατότητα των μυκητιακών μεταβολιτών ως νέοιαντιμυκητιακόπράκτορες.

ΒΟΤΑΝΟ ΚΙΣΤΑΝΣΙ

Υλικά και μέθοδοι

Καλλιέργεια μυκήτων.Το στέλεχος Te P. digitatum (PD) που χρησιμοποιείται στις μελέτες έχει κατατεθεί στην Spanish Type Culture Collection (CECT) με τον κωδικό πρόσβασης CECT20796. Το στέλεχος P. citrinum (PC) παρασχέθηκε από το Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Βραζιλία). Το P. digitatum και το P. citrinum καλλιεργήθηκαν σε άγαρ δεξτρόζης πατάτας του εμπορίου (PDA) (Acumedia). Το PDA αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο στα 103 KPa (121 βαθμοί) για 15 λεπτά. Οι πλάκες PDA αποθηκεύτηκαν στους 25 βαθμούς για 7 ημέρες στο σκοτάδι. Τα σπόρια συλλέχθηκαν με πλύσιμο της επιφάνειας του άγαρ με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και αραίωση σε τελική συγκέντρωση 106 ή 105 σπορίων mL−1.

Συνκαλλιέργεια συνθηκών ανάπτυξης μυκήτων Το διάλυμα σπορίων (106 σπορίων mL−1) εμβολιάστηκε, σε αντίθετες πλευρές. Οι πλάκες επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς για 7 ημέρες.

Για αναλύσεις MSI και συνεστιακή μικροσκοπία, η in vitro συν-καλλιέργεια παρασκευάστηκε τοποθετώντας μια στείρα αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου στο τρυβλίο Petri, ακολουθούμενη από έκχυση 11 ml PDA22 και τα εμβόλια έγιναν πάνω από την αντικειμενοφόρο πλάκα του μικροσκοπίου. Οι πλάκες επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς για 72 ώρες. Για in vivo συν-καλλιέργεια, τα ώριμα πορτοκάλια (Citrus sinensis) αποστειρώθηκαν επιφανειακά και τραυματίστηκαν23. Ένα μικρό κομμάτι PDA που περιέχει P. citrinum εμβολιάστηκε στο σημείο του τραύματος. Τα μολυσμένα πορτοκάλια και τα πορτοκάλια ελέγχου αποθηκεύτηκαν σε αποστειρωμένα ποτήρια ζέσεως των 500 mL, σε σκοτάδι στους 25 βαθμούς. Μετά από 10 ημέρες, οι καρποί τραυματίστηκαν στην απέναντι ισημερινή περιοχή του ενοφθαλμίσματος P. citrinum και μολύνθηκαν με διάλυμα σπορίων P. digitatum 106 mL−1. Οι καρποί αποθηκεύτηκαν για περισσότερες από 5 ημέρες στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς.

Ανάλυση φασματομετρίας μάζας (MSI) και δημιουργία εικόνων MS.

Μετά την περίοδο επώασης, οι αντικειμενοφόρες πλάκες του μικροσκοπίου αφαιρέθηκαν από τα τρυβλία Petri και τοποθετήθηκαν σε ξηραντήρα κενού, για 1 ώρα, για πλήρη αφυδάτωση με άγαρ (Angolini et al., 2015). Οι αναλύσεις MSI πραγματοποιήθηκαν απευθείας στο μικροσκόπιο που περιέχει τη συγκαλλιέργεια, σε θετική λειτουργία, χρησιμοποιώντας πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού εκρόφησης (DESI) Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) σε συνδυασμό με ένα Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Φασματόμετρο μάζας. Τα δεδομένα MSI αποκτήθηκαν με μάζα ισχύς ανάλυσης 70.000 σε m/z 200. Η διαμόρφωση DESI που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ίδια που είχε οριστεί από την προηγούμενη εργασία22. Οι εικόνες δημιουργήθηκαν με πλάτος κάδου Δm/z=± 0,07 χρησιμοποιώντας το λογισμικό μετατροπής δεδομένων Firefly (έκδοση 2.1.05) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό BioMap (έκδοση 3.8.0.4) που αναπτύχθηκε από τα Ινστιτούτα Βιοϊατρικής Έρευνας Novartis. Στο BioMap, η χρωματική κλίμακα προσαρμόστηκε σε μια σταθερή τιμή κατά την επεξεργασία κάθε εικόνας. Τα φάσματα MS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το λογισμικό Xcalibur (έκδοση 3.0.63) που αναπτύχθηκε από την Thermo Fisher Scientific.

Εκχύλιση μεταβολιτών από τα πειράματα συγκαλλιέργειας.

Ολόκληρο το περιεχόμενο της συνκαλλιέργειας in vitro κόπηκε σε μικρά κομμάτια και μεταφέρθηκε σε φιάλη Erlenmeyer. Η εκχύλιση έγινε με χρήση μεθανόλης. Οι φιάλες υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 1 ώρα σε λουτρό υπερήχων και διηθήθηκαν υπό κενό. Ο διαλύτης απομακρύνθηκε υπό μειωμένη πίεση και το τελικό εκχύλισμα αποθηκεύτηκε στους -20 βαθμούς.

Για in vivo συν-καλλιέργεια, οι φλούδες πορτοκαλιού κόπηκαν (2 cm×2 cm) στη ζώνη διεπαφής μεταξύ των μικροοργανισμών και η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με 5 mL μεθανόλης για 1 ώρα στο λουτρό υπερήχων. Τα εκχυλίσματα διηθήθηκαν, ξηράνθηκαν υπό Ν2 και αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς.

Ανάλυση Φασματομετρίας Μάζας (MS).

Τα εκχυλίσματα αραιώθηκαν σε μεθανόλη και αναλύθηκαν σε φασματόμετρο μάζας Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στη θετική λειτουργία με εύρος m/z 115–1500, τριχοειδική τάση 3,4 kV, θερμοκρασία τριχοειδούς εισόδου 280 μοίρες, φακός S 1{42}}0V. 5 μL του δείγματος εγχύθηκαν. Σταθερή φάση: Termo Scientific στήλη Accucore C18 2.6 μm (2,1 mm×100 mm). Κινητή φάση: 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (Α) και ακετονιτρίλιο (Β). Προφίλ υγρού έκλουσης (A/B): 95/5 έως 2/98 εντός 15 λεπτών, διατήρηση για 5 λεπτά, έως 95/5 εντός 1,2 λεπτών και διατήρηση για 7,8 λεπτά. Ο συνολικός χρόνος εκτέλεσης ήταν 29 λεπτά για κάθε εκτέλεση και ο ρυθμός ροής ήταν 0,2 mLmin−1. Όγκος έγχυσης: 5 µL.MS/MS διεξήχθησαν από τη διάσταση που προκαλείται από σύγκρουση (CID) με εύρος m/z 100–800 και η ενέργεια σύγκρουσης κυμαινόταν από 10 έως 50 V. Τα δείγματα εγχύθηκαν απευθείας με ηλεκτροψεκασμό με ταχύτητα ροής 5,0 µL min−1. Τα δεδομένα MS και MS/MS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το λογισμικό Xcalibur (έκδοση 3.0.63) που αναπτύχθηκε από την Thermo Fisher Scientific.

ΟΦΕΛΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ CISTANCHE: ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ

Διαχωρισμός μεταβολιτών (ανάλυση HPLC).

Οι διαχωρισμοί δευτερογενών μεταβολιτών επιτεύχθηκαν με τη χρήση στήλης Phenomenex Luna 5μm φαινυλ-εξυλίου (25{{1{0}}×4,6 mm) και HPLC προεξοχής SHIMADZU LC-20AT, εξοπλισμένη με CBM{{6} }Μια μονάδα διαύλου επικοινωνίας, ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδου SPD-M20A και SIL-20Αυτόματος δειγματολήπτης. Κινητή φάση: νερό (0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ) (Α) και ακετονιτρίλιο (Β). Προφίλ εκλούτη (A/B): 65/35 έως 50/50 εντός 50 λεπτών, έως 40/60 εντός 20 λεπτών. Ο συνολικός χρόνος εκτέλεσης ήταν 70 λεπτά και ο ρυθμός ροής 1,0 ml min−1. Ο όγκος της ένεσης ήταν 5 μL. Ο προπαρασκευαστικός καθαρισμός HPLC πραγματοποιήθηκε σε στήλη Phenomenex Luna 5 μm φαινυλ-εξυλίου (250×10 mm) χρησιμοποιώντας μια δυαδική αντλία HPLC Waters 1525 εξοπλισμένη με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδου Waters 2998 και συλλέκτη κλασμάτων Waters III χρησιμοποιώντας τις ίδιες βελτιστοποιημένες συνθήκες κλίσης. Ο ρυθμός ροής ορίστηκε στα 4,7 mLmin−1 και ο όγκος έγχυσης ήταν 200 μL.

Φασματοσκοπία NMR.

Πειράματα 1H NMR, 13C NMR και 2D πραγματοποιήθηκαν σε Bruker Avance III 500 (1H 500,13MHz και 13C 125,7MHz) και Bruker Avance III 600 (1Η 600,17MHz). Ως διαλύτης και εσωτερική αναφορά χρησιμοποιήθηκαν δευτεριωμένο χλωροφόρμιο (CDCl3, 7,23 ppm), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, 2,50 ppm και 39,51 ppm) και τετραμεθυλοσιλάνιο (TMS, 0,0 ppm). Οι χημικές μετατοπίσεις (δ) εκφράστηκαν σε (ppm) και οι σταθερές σύζευξης (J) σε Hertz (Hz).

Ανάλυση Μοριακής Δικτύωσης.

Ένα μοριακό δίκτυο για τους μεταβολίτες του P. citrinum δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη διαδικτυακή ροή εργασίας στο Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu). Τα δεδομένα φιλτραρίστηκαν αφαιρώντας όλες τις κορυφές MS/MS εντός συν /−17 Da του προδρόμου m/z. Τα φάσματα MS/MS φιλτραρίστηκαν παραθύρου επιλέγοντας μόνο τις 6 κορυφαίες κορυφές στο παράθυρο συν /−50Da σε όλο το φάσμα. Στη συνέχεια, τα δεδομένα ομαδοποιήθηκαν με MS-Cluster με μητρική ανοχή μάζας 0.2 Da και ανοχή ιόντων θραύσματος MS/MS 0.2Da για να δημιουργηθούν συναινετικά φάσματα. Περαιτέρω, τα συναινετικά φάσματα που περιείχαν λιγότερα από 2 φάσματα απορρίφθηκαν. Στη συνέχεια δημιουργήθηκε ένα δίκτυο όπου οι ακμές φιλτράρονταν για να έχουν βαθμολογία συνημιτόνου πάνω από 0.65 και περισσότερες από 2 αντιστοιχισμένες κορυφές. Περαιτέρω ακμές μεταξύ δύο κόμβων διατηρήθηκαν στο δίκτυο μόνο εάν καθένας από τους κόμβους εμφανιζόταν ο ένας στους αντίστοιχους κορυφαίους 10 πιο παρόμοιους κόμβους του άλλου. Στη συνέχεια, τα φάσματα στο δίκτυο αναζητήθηκαν με βάση τις φασματικές βιβλιοθήκες του GNPS. Τα φάσματα της βιβλιοθήκης φιλτράρονταν με τον ίδιο τρόπο όπως τα δεδομένα εισόδου. Όλες οι αντιστοιχίσεις που διατηρήθηκαν μεταξύ φασμάτων δικτύου και φασμάτων βιβλιοθήκης έπρεπε να έχουν βαθμολογία πάνω από 0,5 και τουλάχιστον 5 αντιστοιχισμένες κορυφές.

Αντιμυκητιακές αναλύσεις.

Ένα αποθεματικό διάλυμα του εκχυλίσματος συγκαλλιέργειας παρασκευάστηκε σε μεθανόλη και αραιώθηκε περαιτέρω σε PDA στη συγκέντρωση 0,5 mgmL−1. 15 mL του προκύπτοντος διαλύματος χύθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri και ακολούθησε εμβολιασμός 15 ul ενός διαλύματος 105 σπορίων mL−1 P. digitatum στο κέντρο της πλάκας άγαρ. Πραγματοποιήθηκε επίσης μια δοκιμασία ελέγχου. Οι πλάκες επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς για 96 ώρες. Γιααντιμυκητιακόαναλύσεις, 2,5 mL PDA συμπληρώθηκαν με 6, 9 και 10 (400 μgmL−1) και κάθε διάλυμα χύθηκε σε μια μικροπλάκα 6-πηγαδιού. 5 ul ενός διαλύματος 105 σπορίων mL−1 P. digitatum εμβολιάστηκαν στο κέντρο κάθε πλάκας άγαρ. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η μικροπλάκα επωάστηκε στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς για 96 ώρες. Για τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) των ενώσεων 1 και 4, πραγματοποιήθηκε ανάλυση αραίωσης μικροζωμού όπως συνιστάται από το Clinical and Laboratory Standards Institute (2008)24 με λίγες τροποποιήσεις. Τα μητρικά διαλύματα των 1 και 4, παρασκευάστηκαν σε νερό (5 τοις εκατό μεθανόλη) και αραιώθηκαν περαιτέρω σε μέσα YES σε μια περιοχή συγκεντρώσεων από 600 μg mL−1 έως 1 μg mL−1. 195 ul από κάθε διάλυμα μεταφέρθηκαν σε μια μικροπλάκα 96-πηγαδιού ακολουθούμενη από τον εμβολιασμό 5 ul ενός διαλύματος 105 σπορίων mL−1 P. digitatum. Οι δοκιμασίες έγιναν εις διπλούν και οι έλεγχοι εις τριπλούν. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ιτρακοναζόλη (100 μgmL−1). Πραγματοποιήθηκαν αρνητικοί έλεγχοι με μεθανόλη σε ΝΑΙ. Οι μικροπλάκες επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς για 96 ώρες.

Συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ.

Μετά την περίοδο επώασης, οι αντικειμενοφόρες πλάκες των μικροσκοπίων αφαιρέθηκαν από το τρυβλίο Petri. Τα in vitro δείγματα συν-καλλιέργειας χρωματίστηκαν με κόκκινο του Κονγκό (0.25 τοις εκατό w/v σε νερό) για 20 λεπτά και πλύθηκαν για λίγο σε απεσταγμένο νερό. Τα δείγματα αναλύθηκαν με μικροσκόπιο Leica TCS SP5. Η διέγερση έγινε από τη γραμμή εκπομπής 543 nm του λέιζερ He-Ne και το φως που εκπέμπεται μεταξύ 570 και 680 nm συλλέχθηκε.

ΟΦΕΛΟΣCISTANCHE: ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ

Αποτελέσματα και συζήτηση

Το MSI αποκαλύπτει πιθανά αντιμυκητιακά στην αλληλεπίδραση μεταξύ P. digitatum και P. citrinum.

Για έλεγχο για νέααντιμυκητιακόενώσεις με τη δυνατότητα να προστατεύουν τα εσπεριδοειδή και να ελέγχουν τις ασθένειες μετά τη συγκομιδή, εφαρμόσαμε μια στρατηγική συγκαλλιέργειας που περιλάμβανε το P. digitatum και ένα άλλο παθογόνο εσπεριδοειδών, το P. citrinum. Η συγκαλλιέργεια είναι μια στρατηγική εμπνευσμένη από τη φύση στην οποία ο ανταγωνισμός μεταξύ των μικροοργανισμών μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή νέων μεταβολιτών. Σε προηγούμενη εργασία, η συγκαλλιέργεια μεταξύ Trichophyton rubrum και Bionectria ochroleuca προκάλεσε την παραγωγή ενός νέου θειικού αναλόγου του PS-990, υποδηλώνοντας ότι αυτή η ένωση θειώνεται περαιτέρω κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης με μύκητες26. Επίσης, ένα άλλο παράδειγμα μιας ένωσης που προέρχεται από αλληλεπίδραση μυκήτων είναι το τετραπεπτίδιο κυκλο-(L-λευκυλ-trans-4-υδροξυ-L-προλυλ-D-λευκυλ-trans-4-υδροξυ-L-προλίνη) που απομονώθηκε από το ζωμό συγκαλλιέργειας του Phomopsis sp. K38 και Alternaria sp. E33; το κυκλικό τετραπεπτίδιο εμφάνισε μέτρια έως υψηλή ανασταλτική δράση έναντι φυτοπαθογόνων μυκήτων σε σύγκριση με το εμπορικό μυκητοκτόνο triadimefon27. Έτσι, τα πειράματα συγκαλλιέργειας είναι μια βιώσιμη προσέγγιση για την εύρεση ενώσεων που μπορούν να αναστείλουν τα κύρια φυτοπαθογόνα των εσπεριδοειδών, ειδικά την πράσινη μούχλα που προκαλείται από το P. digitatum.

Σε συγκαλλιέργεια που πραγματοποιήθηκε τόσο σε πορτοκαλί (in vivo) όσο και σε συνθετικά μέσα (in vitro) παρατηρήσαμε οπτικά μια αναστολή ανάπτυξης σε μεγάλες αποστάσεις μεταξύ του P. citrinum και του P. digitatum. Σε μια αλληλεπίδραση μυκήτων, τα σιωπηλά γονίδια μπορούν να ενεργοποιηθούν και οι επιβλαβείς μεταβολίτες μπορούν να εξουδετερωθούν από τον ένα σύντροφο στον άλλο16,28. Οι μεταβολίτες που προκαλούνται από το Tese εντοπίζονται συνήθως στη ζώνη αντιπαράθεσης σε στερεά μέσα συνκαλλιεργειών16. Ωστόσο, οι τακτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και την αποσαφήνιση μεταβολιτών, όπως η φασματομετρία μάζας σε συνδυασμό με χρωματογραφία υγρού (LC-MS) ή αερίου (GC-MS) δεν παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη χωρική κατανομή των μορίων.

Οι πληροφορίες σχετικά με τη μοριακή χωρική κατανομή μπορούν να ληφθούν με απεικόνιση φασματομετρίας μάζας (MSI), ένα ισχυρό εργαλείο που δημιουργεί εικόνες για κάθε ιόν που ανιχνεύεται στο φάσμα μάζας16. Η χρήση του MSI για την κατανόηση των μικροβιακών συστημάτων και των δευτερογενών μεταβολιτών τους δεν είναι νέα και μελέτες, όπου αυτή η τεχνική εφαρμόστηκε με επιτυχία, μπορούν να βρεθούν στη βιβλιογραφία30. Για παράδειγμα, εφαρμόστηκε MSI για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του Bacillus subtilis 3610 και του Streptomyces coelicolor A3. Η απεικόνιση DESI της βακτηριακής συγκαλλιέργειας αποκάλυψε 57 σήματα χωρικά εντοπισμένα σε βακτηριακές αποικίες, οδηγώντας στην ταυτοποίηση ορισμένων δευτερογενών μεταβολιτών όπως η σουρφακτίνη και η πλιπαστατίνη31. Επιπλέον, η ανάλυση MSI έδειξε επίσης ότι το S. coelicolor αναστέλλει την παραγωγή ορισμένων δευτερογενών μεταβολιτών παρουσία του B. subtilis, αποκαλύπτοντας μια αλληλεπίδραση μεταξύ των βακτηρίων31.

Επομένως, για να ανιχνεύσουμε τους δευτερογενείς μεταβολίτες που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των παθογόνων εσπεριδοειδών, εφαρμόσαμε το DESI-MSI απευθείας στην επιφάνεια του άγαρ συγκαλλιέργειας, για να οπτικοποιήσουμε τη διάχυση των ενώσεων στη ζώνη αντιπαράθεσης. Ελήφθησαν σήματα MSI για ιόντα [Μ συν Η] συν σε m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 459,1645, m/z 625,39409, m/z 625,39409, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 625,39409, m/z. z 527,2862, m/z 511,2894 και m/z 448,2938 (Εικ. S1–S10). Παρατηρήσαμε ότι όλα τα ιόντα που αναφέρθηκαν ανιχνεύθηκαν και συγκεντρώθηκαν στη ζώνη αντιπαράθεσης μεταξύ των μυκήτων (Εικ. 1). Αυτές οι ενώσεις μπορεί να σχετίζονται με την αλληλεπίδραση μύκητα-μύκητα και θα μπορούσαν να αποτελούν δυνητικά νέους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Τα ιόντα στα m/z 625, 609, 527, 511 και 448 παρήχθησαν από το P. citrinum, ενώ τα ιόντα στα m/z 519, 503, 475, 460 και 459, φαινόταν ότι ήταν μια αντεπίθεση του P. digitatum , αποκαλύπτοντας τον χημικό πόλεμο μεταξύ αυτών των δύο παθογόνων εσπεριδοειδών. Τα ιόντα που ανιχνεύθηκαν in vitro μέσω αναλύσεων MSI ανιχνεύθηκαν επίσης στα εκχυλίσματα των συνκαλλιεργειών in vivo (Εικ. S11-S20) χρησιμοποιώντας πορτοκάλια ως υπόστρωμα (Εικ. 2).

Για τον χαρακτηρισμό των μεταβολιτών που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση, λήφθηκε ένα εκχύλισμα συγκαλλιέργειας από ένα πείραμα καλλιέργειας σε κλίμακα και οι ενώσεις ενδιαφέροντος, που ανιχνεύθηκαν αρχικά μέσω αναλύσεων MSI, απομονώθηκαν με προπαρασκευαστική HPLC και χαρακτηρίστηκαν μέσω φασματομετρίας μάζας σε σειρά και αναλύσεων NMR.

Μέσω των ακριβών μαζών που ελήφθησαν από τις αναλύσεις DESI-MSI (Πίνακας 1), ήταν δυνατό να επιβεβαιωθεί η παρουσία αλκαλοειδών ινδόλης που παράγονται από το P. digitatum. Ιόντα [Μ συν Η] συν σε m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960 και m/z 459,1645 που αντιστοιχούν αντίστοιχα σε τρυπτοκουαλανίνη Α (1), τρυπτοκουιαλανίνη (τρυπτοκουιαλανίνη) αντίστοιχα 3), 15-διμεθυλ-2-επι-φουμικιναζολίνη Α (4) και δεοξυτρυπτοκουαλανόνη (5) (χημικές δομές που απεικονίζονται στο Σχ. 3). Αυτές οι ενώσεις αποτελούν μέρος του βιοσυνθετικού μονοπατιού των τρυπτοκουαλανινών32 και είχαν ανιχνευθεί προηγουμένως κατά την ανάλυση DESI-MSI πορτοκαλιών που είχαν μολυνθεί από την ασθένεια της πράσινης μούχλας23. Η ένωση 1 αναφέρθηκε ως ο κύριος δευτερογενής μεταβολίτης που παράγεται από το P. digitatum33. Ωστόσο, η διαγραφή αυτού του γονιδίου, που είναι υπεύθυνο για τη ρύθμιση της 1 βιοσύνθεσης, έδειξε ότι το 1 δεν εμπλέκεται στην παθογένεια του P. digitatum έναντι των εσπεριδοειδών αφού η ικανότητα μόλυνσης των μεταλλαγμένων δεν αλλοιώθηκε34. Ο ακριβής βιολογικός ρόλος των τρυπτοκουαλανινών είναι ακόμα άγνωστος34 και αυτή η μελέτη παρέχει μια νέα βιολογική δραστηριότητα των τρυπτοκουαλανινών με τη συμμετοχή αυτών των αλκαλοειδών στην αλληλεπίδραση των μυκήτων. Το MS/MS του ιόντος [Μ συν Η] συν σε m/z 625,3951 έδωσε σε θραύσματα σε m/z 594,3533, 576,3427, 449,2430, και 431,2325 (Σχ. S21), το ίδιο σχέδιο θραυσματοποίησης που λήφθηκε για την κιτρίνη (6) σε μια μελέτη που αφορούσε συγκαλλιέργεια μεταξύ P. citrinum και Pseudoalteromonas sp. ΟΤ5919. Επίσης, η βάση δεδομένων GNPS πρότεινε ότι το ιόν στο m/z 625 θα μπορούσε να είναι κιτρινίνη Α. Το διαδοχικό φάσμα μάζας που λήφθηκε για αυτήν την ένωση μοιράστηκε πέντε κοινά θραύσματα με το σειριακό φάσμα μάζας του 6 που κατατέθηκε στη βάση δεδομένων (Εικ. S22). Επιπλέον, μοιράζεται ένα παρόμοιο πρότυπο κατακερματισμού MS/MS με την κιτρίνη Α που αναφέρεται από τους Moree et al. (2014). Οι κιτριναδίνες αναφέρθηκαν ότι παράγονται υψηλότερα σε καταστάσεις συγκαλλιέργειας και συγκεντρώνονται σε διεπαφές συγκαλλιέργειας, υποδηλώνοντας μια αμυντική απόκριση του P. citrinum έναντι άλλων μικροοργανισμών. Η ανάλυση μοριακής δικτύωσης των απομονωμένων ενώσεων αποκάλυψε ότι μια άλλη κιτρίνη εμπλέκεται στη συγκαλλιέργεια ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ. Παρατηρήσαμε ότι το ιόν στο m/z 609, που ανιχνεύτηκε αρχικά με ανάλυση MSI, ομαδοποιείται στην ίδια ομάδα της ένωσης 6 (m/z 625) (Εικ. S23), υποδηλώνοντας ότι αυτή η ένωση είναι ένας μεταβολίτης που μοιάζει με κιτρινίνη. Σε μια ανάλυση μοριακής δικτύωσης, οι σχετικοί μεταβολίτες ομαδοποιούνται στις ίδιες ομάδες αφού έχουν παρόμοιο φάσμα MS/MS.

Η ακριβής μάζα που λαμβάνεται για το ιόν [Μ συν Η] συν στο m/z 609,4010 αντιστοιχεί σε μια ένωση με μοριακό τύπο C35H53N4O5. Σχέδιο θρυμματισμού έδωσε θραύσματα σε m/z 578,3583, 464,2905, 451,2586 και 433,2482 (Συμπληρωματικό Σχήμα S24). Τα φάσματα 1H NMR και 1H-1 H COZY που ελήφθησαν για τον καθαρισμένο μεταβολίτη (Εικ. S25-S26 και Πίνακας S1) εμφάνισαν παρόμοια σήματα μιας συντιθέμενης δεοξυκιτριναδίνης Α που αναφέρθηκε από τους Bian et al. (2013)37. Το χαρακτηριστικό σήμα εποξειδίου στο δΗ 4.0 απουσίαζε σε αυτό το παράγωγο και ένα σήμα για βινιλικό υδρογόνο μπορούσε να παρατηρηθεί στο δΗ 6.9, υποδεικνύοντας την έλλειψη της ομάδας εποξειδίου και την παρουσία διπλού δεσμού σε σύγκριση με την κιτρινίνη Α37. Είναι η πρώτη φορά που η δεοξυκιτριναδίνη Α (7) αναφέρεται στη βιβλιογραφία ως δευτερογενής μεταβολίτης που παράγεται από μικροοργανισμό.

Οι ακριβείς μάζες που ελήφθησαν με DESI-MSI για ιόντα [Μ συν Η] συν σε m/z 527,2862 και 511,2894 έδειξαν ενώσεις με τη στοιχειακή σύνθεση C28H38N4O6 και C28H38N4O5, αντίστοιχα. Το MS/MS αποκάλυψε ότι το ιόν στο m/z 511 έχει παρόμοια δομή σε σύγκριση με το m/z 527, εκτός από την απουσία ατόμου οξυγόνου. Ο κατακερματισμός του ιόντος σε m/z 527 έδωσε σε θραύσματα m/z 281, 247, 219, 182, και 120 (Εικ. S27), ενώ το ιόν στο m/z 511 έδωσε σε m/z 265, 247, 219, 166 και 120 (Εικ. S30). Το ίδιο σχέδιο κατακερματισμού αναφέρθηκε για την αλληλουχία των τετραπεπτιδίων Phe-Val-Val-Tyr (8) του Penicillium canescens. Ωστόσο, τα τετραπεπτίδια 8 και Phe-Val-Val-Phe (9) αναφέρθηκαν πρόσφατα ως δευτερογενείς μεταβολίτες που παράγονται από το Penicillium roqueforti. Οι αναλύσεις 1H και 13C NMR των απομονωμένων ενώσεων (Εικ. S28–S32 και Πίνακες S{42}}S3) επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα που προέκυψαν μέσω MS/MS, καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι τα ιόντα σε m/z 527 και m/z 511 αντιστοιχούν σε 8 και 9, αντίστοιχα. Η παραγωγή αυτών των τετραπεπτιδίων στον χημικό πόλεμο των μυκήτων δεν προκαλεί έκπληξη επειδή τα μικρά πεπτίδια είναι γνωστά για την αντιμικροβιακή τους δράση40. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά των 8 και 9 ως δευτερογενών μεταβολιτών του P. citrinum. Για ιόν [Μ συν Η] συν σε m/z 448,2938, η ακριβής μάζα υποδηλώνει μια ένωση με μοριακό τύπο C28H38N3O2, την ίδια σύνθεση του δευτερογενούς μεταβολίτη χρυσογεναμίδιο Α (10) (σφάλμα=-4,6 ppm). Η ένωση 10 απομονώθηκε και αναλύσεις 1Η και 13C NMR (Εικ. S33-S34 και Πίνακας S4) επιβεβαίωσαν τη δομή της. Είναι η πρώτη αναφορά ότι η χρυσογεναμίδη Α εμπλέκεται σε αλληλεπίδραση μυκήτων. Η ένωση 10 αναφέρθηκε για πρώτη φορά ως δευτερογενής μεταβολίτης του Penicillium chrysogenum Νο. 005, ενός ενδοφυτικού μύκητα που σχετίζεται με το φυτόCistanche deserticola. Επίσης, το 10 αναφέρθηκε ως δευτερογενής μεταβολίτης ενός στελέχους P. citrinum42. Οι δομές των μεταβολιτών που παράγονται από το P. citrinum αντιπροσωπεύονται στο Σχ. 4.

Αντιμυκητιακές αναλύσεις.

Ερευνήσαμε τοαντιμυκητιακόΗ δραστηριότητα των μεταβολιτών που παράγονται στη συγκαλλιέργεια και το P. digitatum εμβολιάστηκε σε μέσα άγαρ που περιείχαν εκχύλισμα συγκαλλιέργειας. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, παρατηρήσαμε μείωση κατά 67 τοις εκατό στην ακτινική ανάπτυξη του P. digitatum (Εικ. S35), υποδεικνύοντας ότι οι μεταβολίτες που εμπλέκονται στον πόλεμο των μυκήτων έχουν δυνατότητα ως αντιμυκητιασικοί παράγοντες. Για να επιβεβαιώσουμε αυτήν την υπόθεση, δοκιμάσαμε τις απομονωμένες ενώσεις και παρατηρήσαμε ότι οι ενώσεις 6, 9 και 10 (400 μg mL−1) μείωσαν κατά 48 τοις εκατό , 41 τοις εκατό και 61 τοις εκατό της ακτινικής ανάπτυξης του P. digitatum, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 5), επιβεβαιώνοντας την αντιμυκητιακή δράση. Οι κιτριναδίνες βρέθηκαν να εμπλέκονται στην απόκριση του P. citrinum έναντι άλλων μικροοργανισμών σε συνκαλλιέργειες, αλλά ο βιολογικός τους ρόλος σε βιολογικά περιβάλλοντα είναι ακόμη άγνωστος μέχρι σήμερα19. Η ένωση 6 δοκιμάστηκε για δραστικότητα κατά του έλκους κατά του Buruli στο Mycobacterium ulcerans MN209, αλλά δεν παρατηρήθηκε ενδιαφέρον MIC43. Επίσης, αναφέρθηκε δραστηριότητα κυτταροτοξικότητας του 6 έναντι κυττάρων λευχαιμίας και καρκινώματος44. Τα αποτελέσματά μας είναι η πρώτη αναφορά της αντιμικροβιακής δράσης των κιτριναδινών στη βιβλιογραφία και μπορούν να παρέχουν τις πρώτες πληροφορίες για τον βιολογικό ρόλο αυτών των ενώσεων στις αλληλεπιδράσεις μυκήτων-μυκήτων. Επιπλέον, το chrysogenamide A δεν αναφέρθηκε ποτέ ως αντιμικροβιακός παράγοντας μέχρι τώρα. Η ένωση 10 επέδειξε προστατευτική δράση στα νευροκύτταρα έναντι του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες41, ωστόσο, δεν αναφέρθηκε καμία άλλη βιολογική δραστηριότητα για το 10 στη βιβλιογραφία. Αντιμυκητιακές αναλύσεις που εφαρμόζουν το D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr αποκάλυψαν ότι αυτό το τετραπεπτίδιο έχει ανασταλτική δράση έναντι των υποτίτλων B. και του φυτοπαθογόνου σόγιας Fusarium virguliforme38. Αντίθετα, καμία αναστολή των E. coli, B. subtilis και S. cerevisiae παρουσία D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr ή D-Phe-L-Val-D-Val-L -Παρατηρήθηκε Phe39. Η αντιμυκητιακή δράση των τρυπτοκουαλανινών αξιολογήθηκε επίσης καθώς αυτές οι ενώσεις φαινόταν να είναι μια χημική απόκριση του P. digitatum έναντι του P. citrinum σε χημικό πόλεμο. Οι τρυπτοκουαλανίνες 1 και 4 δοκιμάστηκαν και αποκάλυψαν αντιμυκητιακή δράση έναντι του P. citrinum. Οι ενώσεις 1 και 4 είχαν MIC 300 μgmL−1, αναστέλλοντας την παραγωγή σπορίων P. citrinum (Εικ. S36). Από όσο γνωρίζουμε, είναι η πρώτη αναφορά αντιμικροβιακής δράσης των τρυπτοκουαλανινών. Πρόσφατα, το 1 αποδείχθηκε ως εντομοκτόνο ένωση κατά του Ae. aegypti larvae23; η αντιμυκητιακή δράση μπορεί να προσφέρει περισσότερη κατανόηση για το ρόλο των τρυπτοκουαλανινών στο περιβάλλον των παθογόνων εσπεριδοειδών, εφόσον αυτές οι ενώσεις δεν απαιτούνται για τη λοιμογόνο δράση του P. digitatum.

ΟΦΕΛΟΣCISTANCHE: Αντιβακτηριδιακό

Ο χημικός πόλεμος μεταβάλλει το κυτταρικό τοίχωμα του P. digitatum στη συνκαλλιέργεια.

Για τη διερεύνηση της δράσης των δευτερογενών μεταβολιτών κατά τηνμυκητιακήαλληλεπίδραση, δείγματα συγκαλλιέργειας χρωματίστηκαν με κόκκινο του Κονγκό και παρατηρήθηκαν μέσω ομοεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης λέιζερ. Το κόκκινο του Κονγκό χρησιμοποιείται συνήθως για τη χρώση πολυσακχαριτών που περιέχουν 1,4 δεσμούς όπως, για παράδειγμα,μυκητιακήσυστατικό κυτταρικού τοιχώματος χιτίνη45,46. Οι υφές P. digitatum παρατηρήθηκαν στη ζώνη αντιπαράθεσης (δείγμα) και συγκρίθηκαν με υφές που απέχουν από την περιοχή διεπαφής (έλεγχος) (Εικ. S37). Οι υφές ελέγχου χρωματίστηκαν ομοιογενώς με κόκκινο του Κονγκό, ενώ οι υφές στην περιοχή διεπαφής εμφάνισαν ένα αλλοιωμένο σχέδιο χρώσης (Εικ. 6), με ακανόνιστα μπαλώματα. Παρόμοια σχέδια χρώσης ελήφθησαν για μεταλλαγμένους μύκητες νοκ-άουτ στους οποίους τα διαγραμμένα γονίδια είχαν ρόλο στην οργάνωση του κυτταρικού τοιχώματος. Ως αποτέλεσμα, τα μεταλλάγματα εμφάνισαν ελαττωματικά κυτταρικά τοιχώματα και ακανόνιστη χρώση25,46,47. Ωστόσο, ανώμαλη χρώση με Calcofluor White παρατηρήθηκε για το P. ostreatus P89 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 36 βαθμούς. Η υψηλή θερμοκρασία αλλοίωσε την κατανομή της χιτίνης και την ακεραιότητα του κυτταρικού τοιχώματος48. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το P. digitatum hyphae, σε επαφή με τους μεταβολίτες που διαχέονται κατά τη διάρκεια της συγκαλλιέργειας, έχουν ένα ελαττωματικό κυτταρικό τοίχωμα αφού το Ερυθρό του Κονγκό συνδέεται με τις δομές του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων. Το μυκητιακό κυτταρικό τοίχωμα είναι ένας ελκυστικός στόχος των αντιμικροβιακών, επειδή δεν υπάρχουν στα κύτταρα των θηλαστικών49,50. Συμπερασματικά, η μικροσκοπική ανάλυση και οι αντιμυκητιακές αναλύσεις ενισχύουν ότι οι μεταβολίτες που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση των μυκήτων έχουν τη δυνατότητα νααντιμυκητιακόπαράγοντες και μπορεί να είναι ο μηχανισμός στη φύση που ανέπτυξαν αυτά τα φυτοπαθογόνα για να ανταγωνίζονται άλλους μικροοργανισμούς για τον ξενιστή (Εικ. 7).

συμπεράσματα

Η αναζήτηση νέων φυσικών αντιμικροβιακών είναι ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο στην έρευνα φυσικών προϊόντων σχετικά με τον οικονομικό αντίκτυπο των ασθενειών μετά τη συγκομιδή στην παγκόσμια γεωργία. Επιπλέον, η εμφάνιση στελεχών μυκήτων ανθεκτικών στα μυκητοκτόνα κάνει την ανακάλυψη νέωναντιμυκητιακόπαράγοντες για την αντικατάσταση συνθετικών ενώσεων είναι εξαιρετικά σημαντικό. Χρησιμοποιώντας τη συγκαλλιέργεια μεταξύ φυτοπαθογόνων που ανταγωνίζονται για τον ίδιο ξενιστή, το P. digitatum και το P. citrinum, παρατηρήσαμε μια μυκητιακή αλληλεπίδραση. Μέσω της τεχνικής MSI, ανιχνεύσαμε δευτερογενείς μεταβολίτες που εξουδετερώθηκαν στη ζώνη διεπαφής μεταξύ των μικροοργανισμών. Οι τρυπτοκουαλανίνες, οι κιτριναδίνες, το χυρσογεναμίδιο Α και τα τετραπεπτίδια εμφάνισαν μεγάλη αντιμυκητιακή δράση, επιβεβαιώνοντας ότι οι συνκαλλιέργειες και η τεχνική MSI είναι ένας καλός συνδυασμός στην αναζήτηση νέων φυσικών αντιμικροβιακών.

Μέχρι αυτή την ημερομηνία, δεν υπάρχουν πληροφορίες για την αλληλεπίδραση μεταξύ των παθογόνων μυκήτων των εσπεριδοειδών. Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ενώσεις που παίζουν ρόλο στη μικροβιακή οικολογία των εσπεριδοειδών. Επιπλέον, δείξαμε ότι οι μεταβολίτες που μελετήθηκαν έχουν μεγάλες δυνατότητες όπωςαντιμυκητιακόπαράγοντες αφού τα κυτταρικά τοιχώματα των μυκήτων είναι ένας από τους κύριους στόχους τουαντιμυκητιακόενώσεις. Η χρήση των ταυτοποιημένων ενώσεων ως φυσικών αντιμυκητιασικών αντί για συνθετικά μυκητοκτόνα θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Η παρούσα εργασία ανοίγει νέες ερευνητικές δυνατότητες και συμβάλλει στην περιβαλλοντική και ανθρώπινη υγεία, βοηθώντας στην αναζήτηση ασφαλέστερων στρατηγικών για τη γεωργία μέσω της χρήσης ενώσεων που λαμβάνονται από φυσικές πηγές.

ΟΦΕΛΟΣΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ CISTANCHE: ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ