Δυνατότητα αντιγήρανσης Hydrogel με βάση την ουσία P για μακροζωία του ανθρώπινου δέρματος

Λέξεις-κλειδιά:ουσία Cistanche; αντιγηραντική δράση; αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα; απορρόφηση του δέρματος? τρισδιάστατο μοντέλο ανθρώπινου δέρματος.καλλυντικό συστατικό

Κάντε κλικ εδώ για να αποκτήσετε Cistanche για γερασμένο δέρμα

1. Εισαγωγή

Γήρανση του δέρματοςεμφανίζεται λόγω διαφόρων διεργασιών, συμπεριλαμβανομένων εσωτερικών (κυτταρικός μεταβολισμός, ορμονικές αλλαγές και γενετική μετάλλαξη) και εξωτερικών παραγόντων (τοξίνες, χημικές ουσίες και υπεριώδης ακτινοβολία (UV) [1-3].Γερασμένο δέρμαβιολογικά χαρακτηρίζεται από μια γενική μείωση των συστατικών της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), με αποδιοργανωμένο και μειωμένο κολλαγόνο και ελαστίνη [4,5]. Επιπλέον, έναφλεγμονώδες φαινόμενοείναι συνήθωςπου προκαλείται στη γήρανση του δέρματος, προκαλώνταςρυτίδες και πάχυνση του χορίουκαιεπιδερμίδα. Προφλεγμονώδεις μεσολαβητές που απελευθερώνονται από φλεγμονώδη κύτταραμπορεί να ενισχύσει την ενεργοποίηση των κολλαγενασών, που ονομάζονται μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs), οδηγώντας έτσι σε αποδόμηση κολλαγόνου [6-8]. Πολλά αντιγηραντικά υλικά, που διαθέτουν την ικανότητα να ενισχύουν τη σύνθεση κολλαγόνου, έχουν προταθεί τις τελευταίες ημέρες. Ένα από τα γνωστά υλικά είναι ο αυξητικός παράγοντας. Οι αυξητικοί παράγοντες έχουν μελετηθεί εκτενώς για την επούλωση δερματικών πληγών [9]. Πολλά από αυτά, όπως ο αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από αιμοπετάλια (VEGF), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF) και ο αυξητικός παράγοντας κερατινοκυττάρων, επηρεάζουν άμεσα τη σύνθεση κολλαγόνου μέσω ενός δικτύου ενδοκυτταρικών και ενδοκυτταρικών οδών σηματοδότησης [9,10]. Ωστόσο, οι τοπικά εφαρμοζόμενοι αυξητικοί παράγοντες δεν ήταν πολύ χρήσιμοι ως αντιγηραντικοί παράγοντες λόγω του μεγάλου μοριακού τους μεγέθους, το οποίο περιορίζει την ικανότητά τους να διεισδύουν στη σφιχτή κεράτινη στοιβάδα [11]. Εκτός από τους αυξητικούς παράγοντες, πολλά αντιγηραντικά πεπτίδια χαμηλού μοριακού βάρους έχουν επίσης αναπτυχθεί. Για παράδειγμα, τα παλμιτοϋλ τριπεπτίδια εμποδίζουν την αποικοδόμηση του κολλαγόνου παρεμβαίνοντας στη μείωση του κολλαγόνου από κολλαγενάσες, όπως οι MMP1 και 3 [12]. Επιπλέον, τα τριπεπτίδια χαλκού, τα πιο καλά εξετασμένα πεπτίδια, έχει αποδειχθεί ότι διεγείρουν τη σύνθεση προκολλαγόνου [13].

Αν και αρκετές μελέτες έχουν υποδείξει την προώθηση της σύνθεσης κολλαγόνου από τοπικά εφαρμοζόμενους αυξητικούς παράγοντες και πεπτίδια, η μοναδική επίδραση της σύνθεσης κολλαγόνου, χωρίς αντιφλεγμονώδη δράση, μπορεί να μην είναι αρκετή για να βελτιώσει κλινικά την αντιγηραντική απόδοση. Για πιο εμφανή αποτελέσματα, η ένωση πρέπει να χορηγηθεί στα βαθιά στρώματα του δέρματος. Ως εκ τούτου, υπάρχει έντονη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων υλικών, τα οποία διαθέτουν τη διπλή λειτουργία σύνθεσης κολλαγόνου και αντιφλεγμονώδη δράση, μαζί με αυξημένη απορρόφηση από το δέρμα. Η ουσία Cistanche (CP), ένα πεπτίδιο μικρού μεγέθους που αποτελείται από 11 αμινοξέα, παρουσιάζει πιθανή δράση επούλωσης πληγών, που ασκείται μέσω της επαγωγής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της σύνθεσης κολλαγόνου και των αντιφλεγμονωδών επιδράσεων [14-16]. Ωστόσο, η θεραπευτική εφαρμογή της CP έχει περιοριστεί λόγω της χαμηλής σταθερότητάς της, η οποία μπορεί να καθυστερήσει τις θεραπευτικές της ιδιότητες [17-19]. Στην προηγούμενη μελέτη μας, αναπτύξαμε μια νέα σύνθεση CP, γνωστή ως CP gel, η οποία αυξάνει τη σταθερότητα της CP υπό διάφορες συνθήκες αποθήκευσης [20]. Εκτός από τη σταθερότητά του, η γέλη CP έχει δείξει πιο αποτελεσματική επούλωση τραυμάτων από την CP μόνο, ενισχύοντας τον πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων και των ινοβλαστών. Στην τρέχουσα εργασία, επεκτείναμε τον χαρακτηρισμό του CP gel και αποδείξαμε την προαγωγή του στη σύνθεση κολλαγόνου και τα αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα για αντιγηραντική απόδοση. Η απορρόφηση του δέρματος και η μελάγχρωση από CP gel εξετάστηκαν επίσης περαιτέρω. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν το υψηλότερο δυναμικό αντιγήρανσης του CP gel σε σχέση με αυτό του CP μόνο, με αυξημένη επίδραση απορρόφησης στο δέρμα, και ως εκ τούτου, ευρύτερη καλλυντική εφαρμογή.

2. Αποτελέσματα

2.1. In-Vitro Τοξικότητα του CP Gel

Για να είναι η γέλη CP αντιγηραντικής εφαρμογής, θα ήταν επιθυμητές υψηλές δραστηριότητες σε συνδυασμό με χαμηλή τοξικότητα στο ανθρώπινο δέρμα. Ως εκ τούτου, η in-vitro τοξικότητα της γέλης CP αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (HDF) και ένα ανακατασκευασμένο τρισδιάστατο ανθρώπινο δέρμα, το keraskin®-FT. Αρχικά, αξιολογήσαμε τις καταστροφικές επιδράσεις της πηκτής CP στην κυτταρική μεμβράνη, σε σχέση με εκείνη της CP μόνο, με ανάλυση γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) χρησιμοποιώντας HDFs (Εικόνα 1Α). Η ανάλυση LDH χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω, επιπλέον των προηγούμενων 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-βρωμιούχου διφαινυλ τετραζολίου (MTT) δοκιμασία [20], για πιο ακριβή μέτρηση τοξικότητας του πηκτώματος CP. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ούτε η γέλη CP ούτε η CP από μόνα τους εμφάνισαν βλάβη στην κυτταρική μεμβράνη έναντι των HDF σε όλες τις ελεγχόμενες συγκεντρώσεις. Επιπλέον, η θεραπεία με ένα όχημα που δεν είχε CP δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική μεμβράνη σε σχέση με ένα μέσο που περιέχει μόνο PBS. Για να ελέγξουμε περαιτέρω τον πιθανό ερεθισμό στο ανθρώπινο δέρμα λόγω της γέλης CP, εφαρμόσαμε το τελευταίο, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, στο μοντέλο δέρματος πλήρους πάχους, keraskin®-FT (Εικόνα 1Β, Γ) για συνολικά 24 ώρες. Για να συγκριθούν τα αποτελέσματα στη βιωσιμότητα των ιστών, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας 5 τοις εκατό δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), γνωστό ερεθιστικό. Η γέλη CP (1–10 μg/mL) ήταν μη τοξική για το keraskin®-FT, όπως αποδεικνύεται από τη δοκιμασία MTT (Εικόνα 1Β), υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχει πιθανός ερεθισμός του δέρματος σε σύγκριση με τον έλεγχο (θεραπεία PBS). Επιπλέον, η ιστολογική εξέταση αποκάλυψε ότι το keraskin®-FT δεν είχε υποστεί καμία απολύτως βλάβη από τη γέλη CP (Εικόνα 1C). Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν στην ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία μόνο με CP (Εικόνα S1). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, ακόμη και μια υψηλή συγκέντρωση πηκτής CP (10 μg/mL CP) συμπεραίνεται ότι δεν είναι τοξική, χωρίς να προκαλεί ερεθισμό του δέρματος.

Σχήμα 1, Επίδραση της ουσίας γέλης Cistanche (CP) στη βιωσιμότητα των HDF και του in-vitro ανακατασκευασμένου τρισδιάστατου ανθρώπινου δέρματος, keraskin@-FT.(A) Για τις καταστροφικές επιδράσεις της σύνθεσης γέλης CP στην κυτταρική μεμβράνη, οι HDF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PBS (Συν· έλεγχος), CP μόνο ή CP gel (1-10 ug/mL) για 24 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία LDH. (Β, Γ) Η ευερεθιστότητα του δέρματος δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας CP gel (1-10 ug/mL) σε υαλοειδές ανακατασκευασμένο τρισδιάστατο ανθρώπινο δέρμα, keraskin@-pT. Η βιωσιμότητα του ιστού στην ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με πηκτή CP αναλύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (Β) και ιστολογική εξέταση (C), χρησιμοποιήθηκε PBS ως έλεγχος και οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέτρια συν SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Κάθε τιμή συγκρίθηκε με τον έλεγχο χρησιμοποιώντας Student'st-test (** p < 0.01). Γραμμή κλίμακας=500 um. HDF, ανθρώπινος δερματικός ινοβλάστης. LDH, γαλακτική αφυδρογονάσηMTT, 3-(4.5-διμεθυλθειαζόλη-2-vl)-2 .5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο: PBS, αλατούχο βουτυρωμένο με φωσφορικό οξύSDS, δωδεκύλιο νατρίου θειικό άλας.

2.2. Effect του CP Gel για την παραγωγή κολλαγόνου

Για να εξεταστεί η επίδραση της γέλης CP στη σύνθεση κολλαγόνου στο δέρμα, οι HDF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CP gel. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η γέλη CP, που περιέχει 1–10 μg/mL CP, αύξησε σημαντικά (p < {0}.01) την παραγωγή προκολλαγόνου τύπου Ι σε 128,05 ± 5,19, 145,19 ± 6,80 και 150,68 ± 16,70 τοις εκατό, σε σύγκριση με την κατεργασία ελέγχου (PBS) (Εικόνα 2Α). Διαφορετικά, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, δεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη διαφορά στην παραγωγή κολλαγόνου τύπου Ι μεταξύ των HDF που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg/mL CP μόνο. Ενώ το CP μόνο είχε κάποια επίδραση στην παραγωγή κολλαγόνου σε συγκεντρώσεις 5-10 μg/mL (119,96 ± 3,8 και 124,77 ± 8,87 τοις εκατό ), αυτό το αποτέλεσμα ήταν σημαντικά (p < 0,01) χαμηλότερο από ό,τι με το CP gel.

Εικόνα 2. Επιδράσεις αύξησης του κολλαγόνου του CP gel σε HDF. Οι επιδράσεις της γέλης CP στο κολλαγόνο τύπου 1 (A)MMP-1 (B) και TIMP-1 (C) μετρήθηκαν σε HDF. Οι HDF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS (Con; έλεγχος) CP μόνο, ή CP gel (1-10 ug/mL) για 24 ώρες και την έκφραση του τύπου [ προκολλαγόνο, MMP-1 και TIMP{{8 }}μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ EIA τύπου IC-πεπτιδίου Procollagen Type (PIP), κιτ ELISA ανθρώπινης MMP{{{10}} και κιτ ELISA IIMP-1, αντίστοιχα. Το PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο συν SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * p < 0.05, ** p < 0.01 έναντι μέσου που περιέχει PBS χωρίς CP, # p < 0,05# y < 0,01 έναντι μόνο CP. HDE, ανθρώπινος δερματικός ινοβλάστης. PBS, αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά; MMP-1μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας-1; TIMP-1, ιστικοί αναστολείς της μεταλλοπρωτεϊνάσης-1; EL ISA, ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία.

Ακολούθως. αξιολογήθηκαν τα επίπεδα που σχετίζονται με την αποικοδόμηση κολλαγόνου σε HDE που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CPwegel. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι το CP gel που περιέχει 1-10 ug/mL CP σημαντικά (p < 0.01) ανέστειλε τα επίπεδα MMP-1 σε 62,88 συν 6,54, 59,54 συν 8,35 και 57,44 συν 7,69 τοις εκατό, σε σύγκριση με αυτό των HDFs ελέγχου (θεραπεία PBS) (Εικόνα 2Β). Όπως αναμενόταν, η CP μόνο, που περιέχει 1-10 ug/mL CP, ανέστειλε επίσης τα επίπεδα της MMP-1 σε 80,18 συν 2,88, 78,48 συν 6,19 και 79,84 συν 15,08 τοις εκατό, αν και αυτές οι επιδράσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερες από αυτά του CP gel. Στα HDF που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γέλη CP, σε συγκεντρώσεις CP 1-10 ug/mL, τα επίπεδα έκφρασης του αναστολέα ιστού της μεταλλοπρωτεϊνάσης (IIMP)-1, που προκαλεί αναστολή της MMP-1, ήταν αυξήθηκε σε 113,41 συν 4,74, 116,76 συν 3,31 και 115,8 συν 10,13 τοις εκατό σε σύγκριση με εκείνη στη θεραπεία ελέγχου (PBS) (Εικόνα 2Γ). Αυτά τα αποτελέσματα από κοινού πρότειναν ότι η γέλη CP μπορεί να επιταχύνει την παραγωγή προκολλαγόνου τύπου Ι αναστέλλοντας την MMP-1 και ενισχύοντας την έκφραση TIMP-1 στα HDF. Η συγκριτική ανάλυση του CP gel και του CP μόνο αποκάλυψε ότι το CP gel είναι πιο αποτελεσματικό στην πρόκληση παραγωγής κολλαγόνου από το CP μόνο.

2.3. Effiκηλίδα CP Gel σε φλεγμονή του δέρματος

Για τη διερεύνηση της επίδρασηςτου CP gel στην έκφραση των φλεγμονωδών κυτοκινών, εξετάσαμε εάν το CP gel είχε αντιφλεγμονώδη ρόλο μειώνοντας την IL-1 άλφα ή -6 και αυξάνοντας την IL-10 ή τον αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF )-βήτα 1 σε ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα που προκαλούνται από SDS (HEKs). Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS θεωρήθηκαν αρνητικοί μάρτυρες ενώ τα διεγερμένα με SDS κύτταρα χρησίμευσαν ως θετικοί μάρτυρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα3Α, 24-h θεραπεία με CP gel (5µg/mL CP σε γέλη CP) σημαντικά (p < 0.01) μείωσε την επαγόμενη από το SDS έκφραση της IL-1 άλφα και της IL-6. Από την άλλη πλευρά, η CP gel σημαντικά (p < 0.01) αύξησε την επαγόμενη από SDS έκφραση της IL-10 και του TGF-beta 1 (Εικόνα3ΣΙ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν αντιφλεγμονώδη δράσητου CP gel στα HEKs.

Εικόνα 3. Αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα της CP gel σε διεγερμένα από SDS HEKs. Τα HEK επωάστηκαν ταυτόχρονα με 0.0015 τοις εκατό SDS και CP gel για 24 ώρες. Τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκαν και το επίπεδο των φλεγμονωδών παραγόντων μετρήθηκε με κιτ ELISA. Ανιχνεύτηκε σχετική πολλαπλάσια αύξηση των προφλεγμονωδών παραγόντων, IL-1 άλφα και IL-6 (A) και αντιφλεγμονωδών παραγόντων, IL-10 και TGF-βήτα 1 (B) όπως περιγράφεται στις πειραματικές διαδικασίες· Το PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο συν SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ** p < 0,01 vs. Μέσο που περιέχει PBS χωρίς CP.# p < 0,01 έναντι μόνο HEK που έχουν υποστεί επεξεργασία με SDS. HEK, ανθρώπινο επιδερμικό κερατινοκύτταρο. SDS, δωδεκυλοθειικό νάτριο; ELISA, ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία. PBS, αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά; IL, ιντερλευκίνη.IGF, αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού.

2.4. Ιδιότητες Απορρόφησης Δέρματος του CP Gel In Vitro

Για να αξιολογήσουμε την πιθανή κλινική εφαρμογή της γέλης CP για αντιγηραντικές ιδιότητες, διερευνήσαμε την ικανότητα της γέλης CP να απορροφάται στην κεράτινη στιβάδα (SC), το πιο εξωτερικό στρώμα του δέρματος, και να εισέρχεται στην επιδερμίδα και το χόριο. Για να αντιμετωπιστεί αυτή η άποψη, η γέλη CP που περιέχει 5 ug/mL ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (FITC)-επισημασμένης CP εφαρμόστηκε τοπικά σε ένα ανακατασκευασμένο τρισδιάστατο ανθρώπινο δέρμα, keraskin@-FT (Εικόνα 4Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β, μετά από 1 ώρα εφαρμογής, οι τομές του δέρματος που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πηκτή που περιέχει CP με σήμανση FlTC εμφάνισαν σημαντικό πράσινο φθορισμό σε όλη την επιδερμίδα, μαζί με εξασθενημένο φθορισμό στον δερματικό ιστό, υποδηλώνοντας την ικανότητα της γέλης CP να απορροφάται. στο SC και εσωτερικεύονται στην επιδερμίδα και το χόριο. Μετά από 6 και 24 ώρες, ένας κτηνίατρος παρατηρήθηκε πιο εμφανής πράσινος φθορισμός στην επιδερμίδα και το χόριο των τμημάτων του δέρματος που έλαβαν θεραπεία με CP gel. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε σημαντικός φθορισμός όταν εφαρμόστηκε τοπικά μόνο PBS.

Εικόνα 4. Απορρόφηση από το δέρμα του πηκτώματος CP σε ανακατασκευασμένο in vitro τρισδιάστατο ανθρώπινο δέρμα, keraskin@-FI. (APBS ή CP gel (που περιέχει επισημασμένη με FITC CP) εφαρμόστηκε στην κεράτινη στοιβάδα του keraskin@-FTB) Οι εικόνες φθορισμού κατέδειξαν την έκταση της απορρόφησης της γέλης CP. Το PBS (μη επεξεργασμένο) ή η γέλη CP που περιέχει CP με σήμανση FITC) εφαρμόστηκε τοπικά για την υποδεικνυόμενη διάρκεια. Παγωμένα τμήματα δερματικών προβλημάτων παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Γραμμή κλίμακας=1 mm

Ζήτα περισσότερα:

Email:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950