Αντιγηραντική επίδραση της ουρολιθίνης Α σε ωάρια βοοειδών in vitro

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Το οξειδωτικό στρες και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία έχουν συσχετιστεί με την σχετιζόμενη με την ηλικία μείωση της ποιότητας των ωαρίων και επί του παρόντος αναζητούνται στρατηγικές για την πρόληψή τους. Η Ουρολιθίνη Α (UA) είναι ένας φυσικός μεταβολίτης με προ-αποπτωτικές και αντιοξειδωτικές επιδράσεις, ικανός να αποτρέψει τη συσσώρευση δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων σε διαφορετικά ηλικιωμένα κύτταρα. Το UA δεν έχει ποτέ δοκιμαστεί σε ωάρια βοοειδών. Ο στόχος μας ήταν να μελετήσουμε την επίδραση της UA στο αναπτυξιακό δυναμικό συμπλέγματος σωρευμάτων-ωοκυττάρων (COC) και κοκκιωδών κυττάρων (GCs) έκφρασης σημαντικών γονιδίων που σχετίζονται με την αναπαραγωγική ικανότητα. Αξιολογήθηκε η πρόοδος της πυρηνικής ωρίμανσης, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP) και η αναπτυξιακή ικανότητα φυσιολογικά ώριμων (22 ώρες) και in vitro ηλικιωμένων ωοκυττάρων (30 ώρες IVM) που ελήφθησαν από προεφηβικά και ενήλικα θηλυκά, είτε συμπληρωμένα με UA είτε όχι. Επιπρόσθετα, η ποσότητα του mRNA αρκετών γονιδίων (NFE2L2, NQO1 και mt-DN5) και ο αριθμός των αντιγράφων mt-ND5 DNA ποσοτικοποιήθηκαν σε καλλιεργημένα GC από προεφηβικά και ενήλικα θηλυκά, είτε συμπληρωμένα με UA είτε όχι. Η μελέτη μας επιβεβαίωσε την επιβλαβή επίδραση της γήρανσης των ωαρίων στην πρόοδο της πυρηνικής ωρίμανσης, στη MMP, στην αναπτυξιακή ικανότητα και στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Ενισχυμένη θεραπεία με UA κατά την in vitro ωρίμανση (σελ<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Λέξεις-κλειδιά:ωοκύτταρο; γηράσκων; Ουρολιθίνη Α; τεχνολογίες υποβοηθούμενης αναπαραγωγής

1. Εισαγωγή

Η μείωση της γυναικείας αναπαραγωγικής ικανότητας είναι μια από τις πρώτες φυσιολογικές λειτουργίες που επηρεάζονται δυσμενώς από τη γήρανση και επομένως θεωρείται ένα αναδυόμενο πρόβλημα υγείας παγκοσμίως [1,2]. Εκτός από πολλά παθολογικά προβλήματα, η σχετιζόμενη με την ηλικία μείωση της γυναικείας γονιμότητας αποδίδεται σε μεγάλο βαθμό στη μείωση του αποθέματος των ωοθηκών των ωοκυττάρων [1,3-5] που σχετίζεται με μια χρονικά εξαρτώμενη επιδείνωση της ποιότητάς τους [2]. Αυτή η διαδικασία φθοράς μπορεί να συμβεί λόγω της έκθεσης των ωοκυττάρων σε ένα γηρασμένο μικροπεριβάλλον των ωοθηκών πριν από την ωορρηξία. Επιπλέον, ο θηλυκός γαμίτης συχνά υποβάλλεται σε γήρανση μετά την ωορρηξία, όταν η διαδικασία γονιμοποίησης δεν λαμβάνει χώρα εντός της βέλτιστης περιόδου και το μη γονιμοποιημένο ωάριο παραμένει στον ωαγωγό ή υαλώδες στη σπερματέγχυση για παρατεταμένες περιόδους [6]Η βλάβη της Η ποιότητα των ωαρίων είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που σχετίζεται με την αποτυχία των τεχνολογιών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ART), καθώς η ποιότητά του είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας για το αναπτυξιακό δυναμικό του εμβρύου μετά τη γονιμοποίηση [7,8]. Συχνά αναφέρθηκε ότι η ασύγχρονη ωορρηξία και τα γηρασμένα ωάρια βλάπτουν την επιτυχία των προγραμμάτων τεχνητής γονιμοποίησης και παραγωγής εμβρύων στη φοράδα, τα βοοειδή και τα πρόβατα, γεγονός που συνεπάγεται σημαντικές οικονομικές απώλειες[1,9,10]. Ως εκ τούτου, είναι πρωταρχικής σημασίας η μελέτη των μηχανισμών της γήρανσης των ωαρίων, προκειμένου να σχεδιαστούν καλύτερες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη διάσωση της γονιμότητας σε πολλά είδη, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, καθώς και ως εργαλείο για τη γενετική βελτίωση των ζώων.cistanche wirkungΙδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στη βελτίωση της αναπτυξιακής ικανότητας των ωοκυττάρων από προεφηβικά βοοειδή, τα οποία συχνά χρησιμοποιούνται για την επιτάχυνση του γενετικού κέρδους και τη μείωση των διαστημάτων παραγωγής.

Μία από τις κύριες αιτίες μειωμένης αναπτυξιακής ικανότητας σε ηλικιωμένα ωοκύτταρα είναι η αύξηση του οξειδωτικού στρες, το οποίο προκαλεί μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, βλάβη του DNA και σφάλματα σχηματισμού ατράκτου, επηρεάζοντας την ποιότητα των ωαρίων [1]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η αυξημένη παραγωγή ελεύθερων ριζών είναι αιτία κυτταρικής γήρανσης σε αρκετές χρόνιες ασθένειες και επίσης στην αναπαραγωγική βιολογία, με αποτέλεσμα φτωχά αποτελέσματα γονιμότητας [12]. Το μικροπεριβάλλον των ωοθηκών, το οποίο περιλαμβάνει ωοκύτταρα και κοκκιώδη κύτταρα (GCs), παρέχει έναν αντιοξειδωτικό αμυντικό μηχανισμό ικανό να ρυθμίζει τις οξειδωτικές συνθήκες και να διατηρεί την ισορροπία οξειδωτικών/αντιοξειδωτικών [13]. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας γήρανσης, η αποτελεσματικότητα της αντιοξειδωτικής άμυνας για την εξουδετέρωση των ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) μειώνεται, αυξάνοντας έτσι το επίπεδο του οξειδωτικού στρες. Το μονοπάτι που σχετίζεται με τον πυρηνικό παράγοντα-Ε2-παράγοντα2 (Nrf2 ή NFE2L2), επίσης γνωστό ως Nrf2/like-like ECH πρωτεΐνη 1 (Keap1), είναι ένας κυρίαρχος καταρράκτης απόκρισης που ενεργοποιείται από το οξειδωτικό στρες[14]. Αυτή η οδός είναι ένας κυτταρικός αμυντικός μηχανισμός που έχουν αναπτύξει τα κύτταρα για να αντιμετωπίσουν τις επιβλαβείς επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες. Υπό κανονικές συνθήκες, το Nrf2 ρυθμίζεται αρνητικά από το Keap1, διατηρείται στο κυτταρόπλασμα και διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα. Όταν εκτίθεται σε οξειδωτικά, το Nrf2 διαχωρίζεται από το Keapl, επιτρέποντας τη μετατόπισή του στον πυρήνα όπου συνδέεται με συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA. Αυτές οι αλληλουχίες, που ονομάζονται στοιχεία αντιοξειδωτικής απόκρισης (ARE), οδηγούν στη μεταγραφική ενεργοποίηση κυτταροπροστατευτικών γονιδίων, όπως NAD(P)H: οξειδορεδουκτάση κινόνης-1 (NQO1), οξυγενάση αίμης-1 (HMOX1) και καταλυτική υπομονάδα λιγάσης γλουταμικού-κυστεΐνης (GCLC)[15,16]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Nrf2-Keapl μειώνει τη βλάβη από το οξειδωτικό στρες αυξάνοντας τα επίπεδα αντιοξειδωτικών στα ανθρώπινα GC και στις ωοθήκες του ποντικού[17,18]. Ωστόσο, ο ρόλος του στη διαδικασία γήρανσης των θηλυκών γαμετών παραμένει ασαφής, αν και είναι ξεκάθαρα αποδεδειγμένο ότι τα μιτοχόνδρια είναι ο κύριος τόπος παραγωγής για ROS κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας [9,10].

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Αντίθετα, τα μιτοχόνδρια εμπλέκονται σε πολλές κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες και είναι θεμελιώδεις για την κάλυψη της ζήτησης παραγωγής ενέργειας που απαιτείται κατά την ωρίμανση των ωαρίων και την επακόλουθη εμβρυϊκή ανάπτυξη [19]. Η ικανή μιτοχονδριακή δραστηριότητα έχει συσχετιστεί σε μεγάλο βαθμό με υψηλότερα περιεχόμενα μιτοχονδριακού DNA (mt-DNA) και παραγωγή ATP [20], υψηλότερο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης [21] και διατήρηση της ποιότητας και της ποσότητας των μιτοχονδρίων μέσω της μιτοφαγίας [22]. Επιπλέον, η μιτοχονδριακή δραστηριότητα έχει προταθεί ότι σχετίζεται άμεσα με τη βιωσιμότητα του εμβρύου και τα καλύτερα αποτελέσματα γονιμότητας [23]. Τα αυξανόμενα στοιχεία υποστηρίζουν ότι οι μιτοχονδριακές αλλοιώσεις που σχετίζονται με την ηλικία οδηγούν στη γήρανση των ωοθηκών και στη συνέχεια μειώνουν τη βιωσιμότητα του εμβρύου και το δυναμικό εμφύτευσης. Αυτές οι αλλαγές περιλαμβάνουν μειωμένο αριθμό αντιγράφων mt-DNA, μειωμένη παραγωγή ATP [20], μεταβολές στην έκφραση του μιτοχονδριακού γονιδίου [24, βλάβη mt-DNA [25] και μειωμένο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης [26].

Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν στα μιτοχόνδρια προκάλεσαν τεράστιο ενδιαφέρον για αρκετές παθολογίες που σχετίζονται με τη γήρανση λόγω των μεγάλων δυνατοτήτων τους στην ενίσχυση της μιτοχονδριακής λειτουργίας [27]. Μέσα σε αυτό το πλαίσιο, η Ουρολιθίνη Α (UA) - ένας φυσικός μεταβολίτης που λαμβάνεται μετά την κατάποση τροφής όπως τα ρόδια ακολουθούμενη από τη μετατροπή της από τη μικροχλωρίδα του εντέρου - έχει αποδειχθεί ότι αποτρέπει τη συσσώρευση δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων με την ηλικία, προκαλώντας μιτοφαγία και επίσης διατηρώντας τα μιτοχονδριακά βιογένεση και αναπνευστική ικανότητα [28,29]. Το UA έχει εφαρμοστεί ως πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό φάρμακο για την πρόληψη ορισμένων μορφών καρκίνου, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου και του προστάτη[30,31]. Επιπλέον, το UA έχει επίσης αντιφλεγμονώδεις [32], κατά της παχυσαρκίας [33], αντιοξειδωτικές [34] και αντιγηραντικές ιδιότητες [35].βιοφλαβονοειδή εσπεριδοειδώνΜια πρόσφατη μελέτη τόνισε τα αποτελέσματα της συμπλήρωσης UA σε γηρασμένους ινοβλάστες ανθρώπινου δέρματος στην ενεργοποίηση της οδού Nrf2-Keapl ενισχύοντας την αντιοξειδωτική τους ικανότητα. Αυτή η ενεργοποίηση της οδού Nrf2-Keapl μετριάζει αποτελεσματικά το επίπεδο ROS, μέσω της ανοδικής ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων απόκρισης Nrf2 κατάντη ARE (SOD, NQO1, GCLC και HMOX1), υποδεικνύοντας μια πολλά υποσχόμενη αντιγηραντική δράση [ 35].

Έχουν διεξαχθεί αρκετές μελέτες με στόχο την καθυστέρηση της γήρανσης των ωοθηκών, κατά συνέπεια τη βελτίωση της ποιότητας των ωαρίων και των αποτελεσμάτων της γονιμότητας. Λόγω της συμβολής του οξειδωτικού στρες στη διαδικασία γήρανσης των ωοθηκών, καθώς και στη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, η συμπλήρωση με αντιοξειδωτικά έχει εμφανιστεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία [36,37]. Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν το συμπλήρωμα Ουρολιθίνης Α μπορεί να αποκαταστήσει τη βλάβη που εμφανίζεται κατά τη γήρανση των ωοθηκών συμβάλλοντας στην πρόληψη προβλημάτων υπογονιμότητας. Ως εκ τούτου, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν: (1) να αποδειχθεί ότι η γήρανση θα μπορούσε να αλλάξει το αναπτυξιακό δυναμικό συμπλέγματος σωρευμένου ωαρίου (COC) και την έκφραση των GCs σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στη οδό σηματοδότησης Nrf2· (2) να προσδιοριστεί εάν το UA μπορεί να σώσει γυναικεία γονιμότητα που επιδεικνύει αντιγηραντική δράση σε ηλικιωμένα COC και GCs. και (3) για την αξιολόγηση της επίδρασης της UA στο επίπεδο έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στο μονοπάτι σηματοδότησης Nrf2 καθώς και στην ποιότητα των ωαρίων.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Πειραματικό σχέδιο

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Περίθαλψης Ζώων της Εθνικής Κτηνιατρικής Αρχής (Ν βαθμός 08965DGAV), σύμφωνα με τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης (αρ.86/609/EEC). Για τη διερεύνηση της επίδρασης της γήρανσης στην αλλοίωση της ποιότητας των ωαρίων και της πιθανής αντιγηραντικής επίδρασης της UA, ένα μοντέλο που χρησιμοποιεί COC που συλλέγονται από προεφηβικές και ενήλικες αγελάδες που υποβλήθηκαν σε γήρανση in vitro (30 ώρες ωρίμανσης) ή στη φυσιολογική ωρίμανση (22 η) εφαρμόστηκαν διαδικασίες.

2.1.1.Προηγούμενη δοκιμασία-Μελέτη δόσης-απόκρισης

Μια προηγούμενη ανάλυση για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης UA που θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί κατά τη διαδικασία ωρίμανσης των COC βοοειδών πραγματοποιήθηκε με βάση μια μελέτη δόσης-απόκρισης σε τέσσερις συνεδρίες. Δεδομένου ότι η UA δεν έχει ποτέ δοκιμαστεί σε ωάρια βοοειδών, χρησιμοποιήθηκαν προηγούμενες δόσεις με επιτυχία για την πρόληψη και τον μετριασμό ορισμένων καρκίνων και για να αποδειχθεί η αντιγηραντική επίδραση της UA σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές [28,39]. Τα COC που ελήφθησαν από προεφηβικές και ώριμες ενήλικες αγελάδες (n=978) επιλέχθηκαν και στη συνέχεια χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες για να δοκιμαστούν διαφορετικές δόσεις UA: έλεγχος, 1,10,25 και 50 μΜ κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής in vitro ωρίμανσης. Μετά την περίοδο ωρίμανσης, ορισμένα ωοκύτταρα (n=154) χρωματίστηκαν για να προσδιοριστεί η χρωμοσωμική διαμόρφωση και τα στάδια ωρίμανσης. Τα υπόλοιπα ώριμα ωάρια υποβλήθηκαν σε σπερματέγχυση in vitro με κατεψυγμένο/απαγωμένο σπέρμα. Οι πιθανολογούμενοι ζυγώτες καλλιεργήθηκαν και οι ρυθμοί διάσπασης και βλαστοκύστης προσδιορίστηκαν την ημέρα 2 και την ημέρα 7 της καλλιέργειας, αντίστοιχα. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, δηλαδή την απουσία επιβλαβών επιδράσεων και την προώθηση της ωρίμανσης και της ανάπτυξης βλαστοκύστης, επιλέχθηκε η συγκέντρωση 1 uM UA.

2.1.2.Πείραμα1

Σε αυτό το πείραμα, που διεξήχθη σε έξι συνεδρίες, και τα δύο COC από προεφηβική (μέση ηλικία=9 μήνες, n=660) και ενήλικες (μέση ηλικία =39μήνες, n=674) συλλέχθηκαν αγελάδες για να αξιολογηθεί η ποιότητα των ωαρίων και το αναπτυξιακό δυναμικό των ηλικιωμένων και φυσιολογικά ωριμασμένων ωοκυττάρων καθώς και η επίδραση UA για τη διάσωση της γυναικείας γονιμότητας. Τα COC χωρίστηκαν τυχαία σε 8 ομάδες: (1) ομάδα ελέγχου προεφηβικής ηλικίας, COC από προεφηβικά μοσχάρια που ωρίμασαν για 22 ώρες (n=148)· (2) UA προεφηβική ομάδα, COC από προεφηβικά μοσχάρια που ωριμάστηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με 1 uM UA για 22 ώρες (n {= 155);(3)ομάδα ελέγχου ηλικίας 30 ωρών προεφηβικής ηλικίας, COC από προεφηβικούς μόσχους ηλικίας έως 30 ωρών ωρίμασης in oitro (n=149); (4) UA ηλικίας 30 ωρών προεφηβική ομάδα, COC από μόσχους προεφηβικής ηλικίας in vitro για 30 ώρες σε μέσο ωρίμανσης συμπληρωμένο με 1 uM UA(n=144)· (5) ομάδα ενηλίκων ελέγχου, COC από ενήλικες αγελάδες ωρίμασαν για 22 ώρες (n=155 );(6) Ομάδα ενηλίκων UA, COC από ενήλικες αγελάδες ωριμασμένα σε μέσο συμπληρωμένο με 1 uM UA για 22 ώρες (n=129)· (7) ομάδα ενηλίκων μάρτυρα ηλικίας 30 ωρών, COC από ενήλικες αγελάδες ηλικίας έως 30 ώρες in oitro ωρίμανσης (n=148); και (8) Ομάδα ενηλίκων UA ηλικίας 30 ωρών, COC από ενήλικες αγελάδες που ηλικιώθηκαν in oitro για 30 ώρες σε μέσο ωρίμανσης συμπληρωμένο με 1 uM UA(n=138).οφέλη cynomoriumΜετά τις αντίστοιχες περιόδους ωρίμανσης in vitro, τα ωοκύτταρα γονιμοποιήθηκαν με αποψυγμένο σπέρμα ταύρου. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η εμβρυϊκή ανάπτυξη, αξιολογώντας τόσο το ποσοστό των σχισμένων και παραγόμενων εμβρύων, όσο και την ποιότητά τους.

Επιπλέον, σε αυτό το πείραμα, COC από κάθε ομάδα ανακτήθηκαν για να αξιολογηθεί το στάδιο της πυρηνικής ωρίμανσης (ομάδα ελέγχου προεφηβικής, n=7; UA προεφηβική ομάδα, n =7· έλεγχος ηλικίας 30 ωρών προεφηβική ομάδα, n{ {3}}; UA ηλικίας 30 ωρών προεφηβική ομάδα, n=6; ομάδα ενηλίκων ελέγχου, n=16;ομάδα ενηλίκων UA, n=21; ομάδα ενηλίκων ελέγχου ηλικίας 30 ωρών, n{ {9}}· UA ηλικίας 30 ωρών ομάδα ενηλίκων, n=18). Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MP) των COCs αξιολογήθηκε επίσης (ομάδα ελέγχου προεφηβικής, n=10· UA προεφηβική ομάδα, n{ {13}};ομάδα ελέγχου ηλικίας 30 ωρών προεφηβική,n=9;UA ηλικίας 30 ωρών προεφηβική ομάδα,n=9;ομάδα ενηλίκων ελέγχου, n=15; ομάδα ενηλίκων UA, n{ {19}}; ομάδα ενηλίκων ελέγχου ηλικίας 30 ωρών, n=10; ομάδα ενηλίκων ηλικίας 30 ωρών UA, n=14).

2.1.3.Πείραμα2

Καθώς τα GC παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη των ωοθυλακίων και στην ανάπτυξη των ωαρίων, ένα δεύτερο πείραμα πραγματοποιήθηκε σε πέντε συνεδρίες για να μελετηθεί περαιτέρω η επίδραση της ηλικίας και της UA στην έκφραση των NFE2L2, NQO1 και mt-ND5. Αξιολογήθηκε επίσης ο αριθμός των αντιγράφων του γονιδίου mt-ND5. Τα GC ελήφθησαν μετά από φυγοκέντρηση του ωοθυλακικού υγρού που αναρροφήθηκε από ωοθήκες προεφηβικών (μέση ηλικία=10 μηνών) και ενήλικων αγελάδων (μέση ηλικία =62μήνες). Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στις ακόλουθες συνθήκες: (1) προεφηβικός έλεγχος, καλλιέργεια GC μόσχων προεφηβικής ηλικίας. (2) προεφηβική UA, καλλιέργεια GC προεφηβικών μόσχων συμπληρωμένη με 1 uM UA· (3) έλεγχος ενηλίκων, καλλιέργεια GC ενήλικων αγελάδων. και (4) ενήλικα UA, η καλλιέργεια των GC ενήλικων αγελάδων συμπληρωμένη με 1 uM UA. Μετά τη συρροή των GCs την 5η ημέρα της καλλιέργειας, καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο και αργότερα το DNA και το RNA εκχυλίστηκαν, επιτρέποντας τον μετέπειτα ποσοτικό προσδιορισμό των μεταγραφών mRNA NFE2L2, NQO1 και mt-ND5 και επίσης του αριθμού αντιγράφων mt-ND5.

2.2. Συλλογή Ωαρίων και Ωρίμανση In vitro

Ωοθήκες από ενήλικες και προεφηβικές αγελάδες (προηγούμενη ανάλυση, n {{0}} και έκφρ. 1, n=1334) συλλέχθηκαν σε τοπικό σφαγείο και διατηρήθηκαν σε 35-37 βαθμό , σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) συμπληρωμένο με 0.15 τοις εκατό αλβουμίνης ορού βοοειδών (w/v, BSA) συμπληρωμένο με 0,05 mg mL-l καναμυκίνης. Στο εργαστήριο, ωοθυλάκια διαμέτρου 2-8 mm αναρροφήθηκαν με μια 19-βελόνα μετρητή. Μόνο COC με τουλάχιστον τρεις στοιβάδες συμπαγών κυττάρων σωρευμάτων και ομοιογενές ωόπλασμα πλύθηκαν και επιλέχθηκαν για ωρίμανση σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό.υάκινθος της ερήμουΗ ωρίμανση επιτεύχθηκε σε επωαστήρα στους 38,8 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2 σε υγροποιημένο αέρα για 22 ή 3{8}} ώρες σε ένα μέσο ωρίμανσης που αποτελείται από μέσο καλλιέργειας ιστού 199 (TCM) με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 0,2 mM νατρίου πυροσταφυλικό, 10 ng mL-l επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και 10 μL mL-l γενταμικίνης【40】.

2.3. Συλλογή και Καλλιέργεια Κυττάρων Granulosa

Τα κοκκιώδη κύτταρα ελήφθησαν από το ανακτηθέν ωοθυλακικό υγρό μετά από φυγοκέντρηση για 10 λεπτό στα 200x g[41]. Το ίζημα εναιωρήθηκε σε 1 mL μέσου καλλιέργειας (TCM199 συν 10 τοις εκατό ορού) για να πραγματοποιηθεί άλλη φυγοκέντρηση για 5 λεπτά. Το νέο ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1 mL μέσου καλλιέργειας είτε συμπληρωμένο με 1 uM UA είτε όχι σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό και ομογενοποιήθηκε με μια σύριγγα συνδεδεμένη σε μια βελόνα 19G, τουλάχιστον 30 φορές για να αποκολληθούν τα κύτταρα. Μετά την αξιολόγηση της βιωσιμότητας του GC (χρωστική μπλε τρυπάνης, 0,4 τοις εκατό w/v), τα κύτταρα σπάρθηκαν σε συγκέντρωση 2×105 βιώσιμα κύτταρα mL-1 και καλλιεργήθηκαν για πέντε ημέρες στους 38,8 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2 σε υγροποιημένο ατμόσφαιρα μέχρι τη συμβολή. Κάθε 48 ώρες, το μέσο καλλιέργειας εκκενώθηκε και ανανεωνόταν με ένα νέο. Για την εκχύλιση DNA και RNA, συλλέχθηκαν GC και πλύθηκαν με φυγοκέντρηση στα 200x g για 10 λεπτά. Τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 1 mL PBS, καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό.

2.4. Πυρηνική ωρίμανση ωαρίων

Τα στάδια πυρηνικής ωρίμανσης αξιολογήθηκαν μετά την περίοδο 22 ωρών ή 30 ωρών της in vitro ωρίμανσης.Μέθοδος εκχύλισης φλαβονοειδών pdfΤα απογυμνωμένα ωοκύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα οξικού οξέος/αιθανόλης (1:3, ν/ν) και διατηρήθηκαν στους 4 βαθμούς για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα ωοκύτταρα χρωματίστηκαν με διάλυμα ακετο-λακμοειδούς 1 τοις εκατό, τοποθετήθηκαν σε θάλαμο Neubauer και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus BX41). Τα ωοκύτταρα ταξινομήθηκαν ως εξής: βλαστική φυσαλίδα (GV), χρωμοσώματα συμπύκνωσης I (CCI), συμπυκνωμένα χρωμοσώματα II (CCII), διακινησία, ανάφαση-Ι/τελοφάση-Ι (AI/TI) και MII (Μεταφάση-ΙΙ) . Μόνο ωοκύτταρα με ορατή χρώση με χρωματίνη ελήφθησαν υπόψη [42].

2.5. Εκτίμηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης

Για να μετρηθεί το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MP), ένας δείκτης μιτοχονδριακής δραστηριότητας, τα μιτοχόνδρια χρωματίστηκαν με 5, 6, 6'-τετραχλωρο-1, 1', 3, 3'τετρααιθυλοβενζιμιδαζολκαρβοκυανίνη ιωδίδιο (JC{{8} , Invitrogen, Waltham, MA, ΗΠΑ). Τα απογυμνωμένα ωοκύτταρα επωάστηκαν με 5 ug mL-l JC-1 [37] σε μέσο ωρίμανσης για 30 λεπτά στους 38,8 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2 σε υγροποιημένο αέρα στο σκοτάδι. Τα ωοκύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και μεταφέρθηκαν αμέσως σε προθερμασμένο γυαλί πλάκας και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus BX51) χρησιμοποιώντας το μπλε φίλτρο φθορισμού (BP 470-490 αντικειμενικός στόχος UPlanFI 20×/0,50). Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης στη συνέχεια υπολογίστηκε ως η αναλογία του μετρούμενου ερυθρού/πράσινου φθορισμού χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image] (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 2.6.Εξωσωματική γονιμοποίηση και καλλιέργεια εμβρύων

Η εξωσωματική γονιμοποίηση πραγματοποιήθηκε με κατεψυγμένο σπέρμα ταύρου Holstein-Frisian, που είχε προηγουμένως υποβληθεί σε χωρητικότητα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Percoll gradient (45 και 90), σε συγκέντρωση 2 x 10 μοιρών σπερματοζωαρίων mL-4. COCs και Τα σπερματοζωάρια συνεπωάστηκαν για 20 ώρες στους 38,8 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2 σε υγροποιημένο αέρα. Οι πιθανοί ζυγώτες μεταφέρθηκαν στη συνέχεια σε σταγονίδια μέσου συνθετικού ωοθηκικού υγρού (SOF) συμπληρωμένου με αμινοξέα ΒΜΕ και ΜΕΜ, γλουταμίνη, γλουταθειόνη και BSA [40]. Μετά από 48 ώρες της σπερματέγχυσης, ο ρυθμός διάσπασης (διασπασμένα έμβρυα ανά σύνολο γονιμοποιημένων ωοκυττάρων) πέρασε και τα διασπασμένα έμβρυα διατηρήθηκαν σε SOF συμπληρωμένο με BSA και 10 τοις εκατό εμβρυϊκού βόειου ορού (FBS). Τα έμβρυα καλλιεργήθηκαν για 12 ημέρες [41,43] για να αξιολογηθεί ο ρυθμός ανάπτυξης βλαστοκύστεων (στις ημέρες 7,9 και 12· έμβρυα D7 ανά διασπασμένο έμβρυο) και ο ρυθμός εκκολάψεων εμβρύων (εκκολάπτονται έμβρυα ανά έμβρυα D7) και η ποιότητά τους [43]. Τα έμβρυα της ημέρας 7 ταξινομήθηκαν ως βαθμού 1 (καλή ποιότητα), 2 (δίκαιη ποιότητα) και βαθμού 3 (κακής ποιότητας)[4].

2.7.Εξαγωγή και ποσοτικοποίηση DNA και RNA

Το συνολικό DNA και το RNA απομονώθηκαν από GC χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας προτύπων υψηλής καθαρότητας PCR (Roche, Basel, Switzerland) και το κιτ PureLinkTM RNA Mini (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτά τα πρωτόκολλα περιλάμβαναν τη χρήση στηλών spin που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση υψηλής ποιότητας ολικού DNA και RNA και DNase ως θεραπεία για την αφαίρεση του γονιδιωματικού DNA από το RNA[40]. Μετά την εκχύλιση, τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό . Η συγκέντρωση και η ποιότητα του DNA και του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDropTM One/OneC (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Συμπληρωματική Σύνθεση DNA

Η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cDNA) από απομονώσεις RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Xpert cDNA Synthesis Mastermix (GRiSP, Πόρτο, Πορτογαλία, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας 500 ng εξαγόμενου RNA από κάθε δείγμα για την εκτέλεση σύνθεσης cDNA. η οποία διεξήχθη με τη χρήση θερμοκυκλοποιητή (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Τα cDNA που προέκυψαν αποθηκεύτηκαν σε -20 βαθμό μέχρι να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω αναλύσεις. 2.7.2. Σχεδιασμός εκκινητών

Για αυτήν τη μελέτη, σχεδιάστηκαν εκκινητές για το στοχευόμενο γονίδιο (NFE2L2 και NQO1) και ένα ενδογενές γονίδιο ελέγχου (6-ακτίνη) χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer-BLAST του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, πρόσβαση στις 6 Μαρτίου 2020). Αλληλουχίες εκκινητών για τα γονίδια αναφοράς και τα γονίδια στόχους απεικονίζονται στον Πίνακα 1. Επιπλέον, το γονίδιο mt-ND5 χρησιμοποιήθηκε σε αυτή την εργασία και λεπτομέρειες σχετικά με τους εκκινητές mt-ND5 ανακτήθηκαν από προηγούμενη μελέτη [45].

2.7.3. Ποσοτική Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Αντίστροφης Μεταγραφής

Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας το Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X με ROX σε θερμοκυκλωτή QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, ΗΠΑ), χρησιμοποιώντας cDNA σε συγκέντρωση 25 ng uL-l. Η αξιολόγηση του αριθμού αντιγράφων του μιτοχονδριακού DNA (mt-DNA) του γονιδίου ND5 πραγματοποιήθηκε με qPCR μέσω του DNA που είχε εκχυλιστεί προηγουμένως, χρησιμοποιώντας τον ίδιο εξοπλισμό όπως για τον ποσοτικό προσδιορισμό των γονιδίων. Πραγματοποιήθηκε κάθε βελτιστοποιημένη αντίδραση, αποτελούμενη από Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X με ROX, εκκινητή (Forward και Reverse) κάθε γονιδίου στόχου, δείγμα (cDNA/DNA) και νερό χωρίς RNase που αποτελούν συνολικό όγκο 10 μL. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν και οι αντιδράσεις που περιείχαν νερό αντί για μήτρα συμπεριλήφθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ένα πρωτόκολλο ενίσχυσης που αποτελούνταν από έναν αρχικό κύκλο στους 95 βαθμούς για 2 λεπτά φάσης μετουσίωσης, ακολουθούμενο από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 55 δευτερόλεπτα, 40 κύκλους ανόπτησης για 30 δευτερόλεπτα στους 60 βαθμούς (ανάλογα με τη θερμοκρασία τήξης του ακολουθίες εκκινητών), και φάση επέκτασης στους 72 βαθμούς για 30 δευτερόλεπτα και, τέλος, μια τελική περίοδος επέκτασης στους 72 βαθμούς για 10 λεπτά.

Για την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκε η σχετική μέθοδος ποσοτικοποίησης. Αυτή η μέθοδος σχετικής ποσοτικοποίησης της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε με τα επίπεδα έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων-στόχων, τα οποία κανονικοποιήθηκαν με τα γονίδια housekeeping, με τη συγκριτική μέθοδο CT. Καθώς η ενίσχυση με RT-qPCR πραγματοποιήθηκε εις διπλούν, προσδιορίστηκαν οι μέσες τιμές CT για κάθε γονίδιο και τα επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

όπου △Ct=Γονίδιο στόχος Ct -γονίδιο ενδογενούς ελέγχου Ct.

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων mt-DNA, χρησιμοποιήθηκε η σχετική ποσοτικοποίηση που κανονικοποιήθηκε έναντι της μεθόδου μοναδιαίας μάζας. Αυτή η μέθοδος διεξήχθη με τις τιμές CT των GC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (ονομάστηκε ως δοκιμή), οι οποίες κανονικοποιήθηκαν με δείγματα ελέγχου (που επί του παρόντος ορίζονται ως βαθμονομητής). Καθώς ο αριθμός αντιγράφων mt-ND5 αξιολογήθηκε με qPCR και εκτελέστηκε εις διπλούν, προσδιορίστηκαν οι μέσες τιμές CT για τα δείγματα δοκιμών και βαθμονομητών και οι αναλογίες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

όπου △Ct=Ct calibrator-Ct test και E είναι η απόδοση.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals