Επικοινωνία:jerry.he@wecistanche.com

Mi Young Ahn1*, Ban Ji Kim1, Ha Jeong Kim1, Jae Sam Hwang1, Yi-Sook Jung2 και Kun-Koo Park3

Το Cistanche έχει αντιγηραντική δράση

Αφηρημένη

Ιστορικό: Η μελέτη αυτή είχε ως στόχο να αξιολογήσει τηναντι γήρανσηεπίδραση μιας πρόσφατα παρασκευασμένης ένωσης προερχόμενης από έντομα, της γλυκοζαμινογλυκάνης σκαθαριού κοπριάς (GAG), που χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε ηλικιωμένους αρουραίους ΣΔ ως μέρος της διατροφής τους για 1 μήνα. Η χορήγηση GAG εντόμων βρέθηκε να σχετίζεται με μείωση της οξειδωτικής βλάβης, των επιπέδων ηπατοκυτταρικών βιοδεικτών, της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες καρβονυλίου και της συγκέντρωσης μηλονοδιαλδεΰδης. οαντι γήρανση-Οι σχετικοί μοριακοί γενετικοί μηχανισμοί του σκαθαριού κοπριάς GAG δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί πλήρως.

Αποτελέσματα: Catharsius molossus (ένας τύπος σκαθαριού κοπριάς) GAG (CaG) κατείχεαντι γήρανσηδραστηριότητες; μείωσε το επίπεδο της κινάσης της κρεατινίνης στον ορό, είχε αορτικές αγγειοχαλαρωτικές δράσεις και καρδιοπροστατευτικές δράσεις και διατήρησε ένα φυσιολογικό επίπεδο γλυκόζης σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μικροσυστοιχίας με μια σειρά κλώνων cDNA 30 K αρουραίου για τον εντοπισμό των προφίλ γονιδιακής έκφρασης 14-μηνών αρουραίων SD που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με γλυκοζαμινογλυκάνη σκαθαριού κοπριάς 5 mg/kg (CaG5) σε διάστημα 1- μηνιαίας περιόδου, η οποία έγινε για τη διερεύνηση τηςαντι γήρανσηαποτέλεσμα σε σύγκριση με αυτό είτε του Bombus ignitus (ένας τύπος μέλισσας) βασίλισσας GAG 5 mg/kg (IQG5) είτε της θειικής χονδροϊτίνης 10 mg/kg. Το CaG5 και το IQG5 είχαν αξιοσημείωτα αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα, προκαλώντας αναστολή των τιμών των ελεύθερων λιπαρών οξέων, ουρικού οξέος, sGPT, IL-1 βήτα και CK. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκαν αντιπηκτικά και αντιθρομβωτικά αποτελέσματα: η συγκέντρωση του παράγοντα 1 (ινωδογόνο) αυξήθηκε στο πλάσμα αρουραίων που υποβλήθηκε σε αγωγή με CaG. Η ομάδα αρουραίου που έλαβε αγωγή με CaG, σε σύγκριση με τον έλεγχο, εμφάνισε ανοδική ρύθμιση 131 γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της λιποκαλίνης 2 (Lbp) και ενός αναστολέα πεπτιδάσης σερίνης, Kaszal type3 (Spink3) και 64 γονιδίων με μειωμένη ρύθμιση, συμπεριλαμβανομένης της λυσυλοξειδάσης (Lox ), αφυδρατάση σερίνης (sds) και κορεσμένη ρετινόλη (Retsat).

Συμπέρασμα: Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι η γλυκοζαμινογλυκάνη του σκαθαριού κοπριάς μπορεί να είναι μια χρήσιμη θεραπεία για ηλικιωμένους αρουραίους, γεγονός που υποδεικνύει τις δυνατότητές της ως θεραπευτικό βιοϋλικό για τη γήρανση.

Λέξεις κλειδιά: Αντιγηραντική δράση, Σκαθάρι κοπριάς (Catharsius molossus), Queen of B. ignitus, Γλυκοζαμινογλυκάνη

Ιστορικό

χρησιμοποιούνται, μέσω καθαρισμού, εκχύλισης και ταυτοποίησης ισχυρών δραστικών συστατικών, ως λειτουργικά τρόφιμα ή φάρμακα. Τα εκχυλίσματα του σκαθαριού κοπριάς Catharsius molossus, που βρίσκεται στην Κίνα, εμφάνισαν αξιοσημείωτη ινωδολυτική δράση και αντιοξειδωτικά και αντι-υπεργλυκαιμικά αποτελέσματα σε αρουραίους που τρέφονταν με δίαιτα πλούσια σε λιπαρά [9, 10]. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη καρβονυλίου στο αίμα και η συγκέντρωση μηλονοδιαλδεΰδης στον ιστό του ήπατος που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αιθανόλη ή εκχύλισμα ακετόνης κοπριάς σε περίοδο 1-μήνων, μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τους μάρτυρες [10]. Πρόσφατα, ένα κορεατικό πεπτίδιο σκαθαριού κοπριάς, το LLCIALRKK-NH2, το οποίο είναι ένα 9-μερικό πεπτίδιο που προέρχεται από το Copris tripartitus Coprisin, βρέθηκε ότι ασκεί βακτηριοκτόνο δράση κατά του E. coli και αντιμικροβιακή δράση προκαλώντας σοβαρή βλάβη στο DNA , που προκαλεί θάνατο που μοιάζει με απόπτωση [11]. Ένα μελισσοκομικό προϊόν, το αλκοολούχο εκχύλισμα B. ignitus queen (BIQ) έχει την υψηλότερη δυνητική αποτελεσματικότητα μεταξύ όλων των εκχυλισμάτων μέλισσας που δοκιμάστηκαν για τη θεραπεία της φλεγμονής σε αρουραίους ΣΔ, καθώς μείωσε σημαντικά το οίδημα των ποδιών [12]. Έτσι, ετοιμάσαμε GAG που προέρχονται από τον μεγαλύτερο αριθμό των C. molossus ή B. ignitus queens για να δοκιμάσουμεαντι γήρανσηιδιότητες. Η γήρανση περιλαμβάνει μια προοδευτική μείωση της φυσιολογικής ικανότητας ενός οργανισμού και εκδηλώνεται με συσσωρευμένες αλλοιώσεις και αποσταθεροποίηση σε ολόκληρο το σύστημα [13]. Η γήρανση σχετίζεται επίσης με ένα μοτίβο διαφορικής γονιδιακής έκφρασης ενδεικτικό μιας μειωμένης απόκρισης στρες μεταξύ των μεταβολικών και βιοσυνθετικών γονιδίων [14]. Συγκεκριμένα, μια αύξηση του σπλαχνικού λιπώδους ιστού που σχετίζεται με την ηλικία ή την παχυσαρκία συνήθως συνοδεύεται από χρόνια φλεγμονή χαμηλού βαθμού, η οποία έχει θεωρηθεί ως αιτία διαφόρων μεταβολικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, των καρδιαγγειακών παθήσεων και, κυρίως, του τύπου δύο διαβήτης [15]. Αυτά τα GAG εντόμων μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ένα ταχέως αναπτυσσόμενο πεδίο με την προοπτική να χρησιμοποιηθούν η μηχανική ιστών και τα βιοϋλικά ως νέες θεραπείες [16].

Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι εμφανίστηκαν GAG από σκαθάρια κοπριάς και BIQαντι γήρανσηιδιότητες και, ως εκ τούτου, αυτές οι ενώσεις έχουν μεγάλες υποσχέσεις για χρήση ωςαντι γήρανσηπράκτορες. Επίσης, καταδεικνύουμε τη δυνητική αξία της γλυκοζαμινογλυκάνης κοπριάς σκαθαριού C. molossus στη μείωση των επιβλαβών πτυχών της γήρανσης, όπως μετράται τόσο στον ορό όσο και στα μοτίβα έκφρασης γονιδίων 14-μήνων SD αρουραίων μετά από θεραπεία για 1 μήνα.

Μέθοδοι

Υλικά

Παρασκευή γλυκοζαμινογλυκάνης εντόμων

Το αποξηραμένο C. molossus αγοράστηκε σε τοπική αγορά στην Κίνα. Η μέλισσα (βασίλισσα του Bombus ignitus) εκτράφηκε και λυοφιλοποιήθηκε στο Τμήμα Αγροτικής Βιολογίας της Εθνικής Ακαδημίας Γεωργικών Επιστημών της Νότιας Κορέας. Η θειική χονδροϊτίνη και όλα τα αντιδραστήρια παρασχέθηκαν από τη Sigma Aldrich (St. Louis, Mo., Η.Π.Α.).

Καθένα από τα αποξηραμένα έντομα βάρους ενός κιλού (1 kg) εμποτίστηκε και εκχυλίστηκε τρεις φορές με αιθανόλη με υπερήχους (Branson, Κολοράντο, MI, ΗΠΑ) για 30 λεπτά. Τα υπολείμματα που διαχωρίστηκαν από τα αλκοολικά εκχυλίσματα απολιπάνθηκαν δύο φορές με 2 όγκους ακετόνης. Περίπου 200 g ξηρής, απολιπασμένης και κονιοποιημένης σκόνης εναιωρήθηκαν σε 2 L ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού νατρίου 0,05 Μ (ρΗ 9). Το εναιώρημα επωάστηκε για 48 ώρες στους 60 βαθμούς μετά την προσθήκη 28 ml (1,4 τοις εκατό) Αλκαλάσης (Sigma Aldrich, St. Louis, Μο., ΗΠΑ). Το μίγμα πέψης ψύχθηκε στους 4 βαθμούς και προστέθηκε τριχλωροξικό οξύ σε τελική συγκέντρωση 5 τοις εκατό. Το δείγμα αναμίχθηκε, αφέθηκε να παραμείνει για 1 ώρα και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 30 λεπτά στα 8000 × g (Hanil Science Industrial, Incheon, Νότια Κορέα). Τρεις όγκοι 5 τοις εκατό οξικού καλίου σε αιθανόλη προστέθηκαν σε έναν όγκο υπερκειμένου. Μετά την ανάμιξη, το εναιώρημα αποθηκεύτηκε όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε. Το ίζημα που ανέρχεται σε 20 g διαλύθηκε σε 40 ml NaCl 0,2 Μ και φυγοκεντρήθηκε. Προστέθηκε χλωριούχο κετυλοπυριδίνιο (5 τοις εκατό) σε 0,2 φορές τον όγκο του υπερκειμένου και το ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση. Το ίζημα διαλύθηκε σε 20 ml NaCl 2,5 Μ. Προστέθηκαν πέντε όγκοι αιθανόλης και το ίζημα διαχωρίστηκε με φυγοκέντρηση. Το ίζημα διαλύθηκε σε νερό και υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 100 όγκων νερού [17] και η ακατέργαστη γλυκοζαμινογλυκάνη που υποβλήθηκε σε διαπίδυση ξηράνθηκε με ψύξη για να ληφθούν περίπου 1,1 g CaG, 4,89 g IQG ως σκόνη. Το ακατέργαστο GAG φορτώθηκε σε στήλη χρωματογραφίας γέλης DEAE Sephadex Α-25 (40 χ 1,2 ​​cm) εξισορροπημένη με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM (ρΗ 7,4). Τα κλάσματα εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας γραμμική βαθμίδωση χλωριούχου νατρίου από 0 έως 2,5 Μ NaCl σε ρυθμιστικό φωσφορικού με ρυθμό ροής 20 ml/h, και η γλυκάνη που υποβλήθηκε σε διαπίδυση ξηράνθηκε με ψύξη σε καθαρό GAG.

Των ζώων

Οι αρουραίοι Sprague Dawley (SD) (αρσενικοί), ηλικίας 8-μηνών, προμηθεύτηκαν από την Samtako Co. Ltd. (Osan, Κορέα). Όλες οι διαδικασίες ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του NIH για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων. Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Εργαστηριακή Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων της Εθνικής Ακαδημίας Γεωργικής Επιστήμης, RDA, Νότια Κορέα (NAAS1503) και ακολούθησαν τις εθνικές οδηγίες για τη φροντίδα και τη χρήση των ζώων (ατομική στέγαση). Οι αρουραίοι εγκλιματίστηκαν για 6 μήνες υπό κανονικές συνθήκες εκτροφής (23 ± 2 βαθμοί C, 55 ± 10 τοις εκατό υγρασία και 12 ώρες κύκλος φωτός/σκότους) και τράφηκαν με κανονική διατροφή (D10001, AIN-76Δίαιτα τρωκτικών, Έρευνα Diet Inc., New Brunswick, NJ, USA) και νερό κατά βούληση. Οι αρουραίοι 14-μηνών διαχωρίστηκαν σε 4 ομάδες θεραπείας των 10 αρουραίων η καθεμία και κατανεμήθηκαν σύμφωνα με την ομοιότητα στο βάρος (680,2 ± 9,20 g). Οι θεραπείες χορηγήθηκαν σε PBS καθημερινά και η καθεμία χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά.

Οι ομάδες ήταν μάρτυρες, δόθηκαν 5 mg/kg CaG (CaG5), 5 mg/kg IQG (IQG5) και 10 mg/kg CS (CS10) (Sigma Aldrich Co., ΗΠΑ). Κάθε ομάδα διατηρήθηκε σε κανονική δίαιτα (AIN-76Δίαιτα τρωκτικών, Ερευνητική δίαιτα) και δειγματοληπτική θεραπεία για 1 μήνα (Σχήμα 1).

Βάρη λιπώδους ιστού

Προσδιορίστηκαν οι αναλογίες λίπους προς βάρος σώματος κοιλίας και επιδιδυμίου. Οι μετρήσεις έγιναν μετά τη θυσία στο τέλος της περιόδου θεραπείας 1- μηνών.

Πυκνότητα λιποκυττάρων

Τα όργανα που αποκόπηκαν και ο λιπώδης ιστός στερεώθηκαν 10 τοις εκατό ουδέτερη φορμαλίνη. Μετά την ενσωμάτωση παραφίνης, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, και μπλε Τολουϊδίνης Ο, εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φωτός (Leica CTR6000, Έσση, Γερμανία) και φωτογραφήθηκαν. Η πυκνότητα των λιποκυττάρων (κύτταρα/mm2) προσδιορίστηκε στον ιστό που υποβλήθηκε σε θεραπεία και στον ιστό ελέγχου με χρώση μπλε τολουιδίνης Ο (αρχική μεγέθυνση, x400).

Δειγματοληψία αίματος και αίμα, πλάσμα, ανάλυση ορού

Σε τέσσερις ομάδες που ονομάστηκαν CON, CaG5, IQG5, CS10 (n =10), μετά από 1 μήνα θεραπείας, συλλέχθηκε αίμα (~5 ml) από την οπίσθια κοίλη φλέβα υπό ελαφριά εισπνοή CO2 και χρησιμοποιήθηκε για μετρήσεις χημείας ορού. Οι παράμετροι που εξετάστηκαν περιελάμβαναν φωσφολιπίδιο, υαλουρονικό οξύ, ελεύθερο λιπαρό οξύ, αλβουμίνη, αλκαλική φωσφατάση (ALP), γλουταμική οξαλοξική τρανσαμινάση (GOT), γλουταμική πυροσταφυλική τρανσαμινάση (GPT), γαλακτική αφυδρογονάση (LDH), CK (κρεατινική φωσφακινάση), γλυκοφωκίνη , τριγλυκερίδιο ολικής χοληστερόλης, HDL χοληστερόλη, LDL χοληστερόλη, κρεατινίνη, άζωτο ουρίας αίματος (BUN), ολική πρωτεΐνη, ουρικό οξύ και c-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP). Όλες οι παράμετροι αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αυτόματο αναλυτή (αυτόματος κλινικός αναλυτής Hitachi 7060, Tokyo).

Δειγματοληψία αίματος και ανάλυση πλάσματος για ανίχνευση αντιπηκτικής δραστηριότητας

Μετά τις θεραπείες 1-μήνας, συλλέχθηκαν περίπου 4 ml πλάσματος από την οπίσθια κοίλη φλέβα υπό ελαφριά εισπνοή CO2 και φυγοκεντρήθηκαν. Το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για τον χρόνο πήξης ως τεστ αντιπηκτικής δράσης: χρόνος ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης (APTT), χρόνος θρομβίνης, χρόνος προθρομβίνης και παράγοντας 1 (ινωδογόνο) ως προσδιορισμός ινωδολυτικής δραστηριότητας χρησιμοποιώντας τον προαναφερθέντα αυτόματο κλινικό αναλυτή σύμφωνα με το εγχειρίδιο του Green Cross Lab.

Οξειδωτική λιπιδική βλάβη

Για τον προσδιορισμό της οξειδωτικής λιπιδικής βλάβης στα ηπατοκύτταρα αρουραίου, τα επίπεδα μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) μετρήθηκαν με δοκιμασία υπεροξείδωσης λιπιδίων χρησιμοποιώντας τη χρωματική μέθοδο που περιλαμβάνει αντιδραστικές ουσίες θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS) στα 535 nm [18].

Βλάβη οξειδωτικής πρωτεΐνης

Υπερκείμενα ομογενοποιημένα ήπατος και αίμα, που ελήφθησαν μετά από φυγοκέντρηση χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε καρβονύλιο. Το πρωτεϊνικό οξειδωτικό στρες αξιολογήθηκε με μέτρηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη καρβονυλίου στο αίμα. Η περιεκτικότητα σε καρβονύλιο προσδιορίστηκε με μια συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοδοκιμασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για το κιτ καρβονυλικής ELISA πρωτεΐνης OxiSelect™ (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA). Η δραστηριότητα CAT (U/mg πρωτεΐνης) μετρήθηκε με βάση την αποσύνθεση του H2O2 με τη μεσολάβηση CAT [19].

Παρασκεύασμα ομογενοποιημένου ήπατος για ανίχνευση οξειδωτικών ενζύμων

Περίπου τέσσερις ομάδες που ονομάζονται CON, CaG5, IQG5, CS10, ιστοί ήπατος ομογενοποιήθηκαν σε πάγο σε ένα 10-πλάσιο ρυθμιστικό λύσης του όγκου διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης PRO-PREP™ (iNtRON, Busan, Κορέα). Το υπερκείμενο του ομογενοποιημένου ήπατος μετά από φυγοκέντρηση (800 g, 10 λεπτά) προσδιορίστηκε για καταλάση, υπεροξειδάση γλουταθειόνης, s-τρανσφεράση γλουταθειόνης και υπεροξείδιο

δραστικότητα δισμουτάσης σύμφωνα με το εγχειρίδιο δοκιμασίας (κιτ OxiSelect™ ELISA, Cell BioLabs, InC., San Diego, CA, USA).

Δοκιμασία κυτοκίνης IL-1, IL-6 και IL-10

Σε τέσσερις ομάδες με το όνομα CON, CaG5, IQG5, CS10, το επίπεδο IL- 1 ή IL − 6 ή IL − 10 στον ορό αρουραίου που υποβλήθηκε σε αγωγή με έντομα GAG μετρήθηκε χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ Elisa (Quanticine, R&D Systems, Inc. , Minneapolis, MN, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Παρασκευή RNA και ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο

Ολικό RNA απομονώθηκε από το ήπαρ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV/Vis (Beckman Coulter Co., Miami, FL, USA). Συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε από 1 g ολικού RNA χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA). Η ενίσχυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκε με το Power SYBR Green Master Mix χρησιμοποιώντας ένα Σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο 7500 (και τα δύο από την Applied Biosystems), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανίχνευση μεταγραφών γονιδίων-στόχων, σχεδιάσαμε ειδικά εμπρόσθιους και ανάστροφους ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές χρησιμοποιώντας λογισμικό Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA). Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στο Σχήμα 2. Τα επίπεδα mRNA στόχου κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αφυδρογονάση φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης 3- (GAPDH) ως εσωτερικό μάρτυρα για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση του mRNA στόχου σύμφωνα με τη μέθοδο του κατωφλίου κύκλου. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν.

Αλληλουχίες εκκινητών για ενίσχυση γονιδίων που εμπλέκονται στον μηχανισμό επιδιόρθωσης κυττάρων και στο εσωτερικό πρότυπο GAPDH (Σχήμα 2).

Διαδικασία μικροσυστοιχίας DNA

Μετά την ιστοπαθολογική ανάλυση, πραγματοποιήθηκε υβριδισμός μικροσυστοιχιών σε δείγματα ήπατος [20]. Ολικό RNA απομονώθηκε από ιστό ήπατος χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen RNeasy Midi (Qiagen, Valencia, CA, USA). Ένα κιτ ετικετών μικροσυστοιχιών FairPlay™ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το επισημασμένο DNA φορτώθηκε σε ένα τσιπ μικροσυστοιχίας. Ένας θάλαμος υβριδισμού συναρμολογήθηκε με το τσιπ μικροσυστοιχίας, Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, USA) και βυθίστηκε σε ένα λουτρό νερού όλη τη νύχτα στους 60 βαθμούς. Το τσιπ μικροσυστοιχίας πλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Ι, ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης II, και στη συνέχεια ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης III για 5 ή 15 λεπτά. Η αντικειμενοφόρος πλάκα στέγνωσε με φυγοκέντρηση στα 500 g για 15 λεπτά και σαρώθηκε με ένα BMS Array Scanner, εφαρμοσμένο Array Worx eBiochip Reader ακριβείας (BioRad, Dallas, TX, ΗΠΑ), χρησιμοποιώντας τα κανάλια Cy3 και Cy5 [21].

Ανάλυση μεμονωμένης καρδιάς αρουραίου

Αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley βάρους 350 ± 50 g αναισθητοποιήθηκαν με πεντοβαρβιτάλη (100 mg/kg). Στην ουραία φλέβα εγχύθηκε ηπαρίνη (1000 U/kg) και στη συνέχεια η τραχεία διασωληνώθηκε. Ενώ οι αρουραίοι αερίστηκαν μηχανικά με έναν αναπνευστήρα τρωκτικών (Μοντέλο 7025, Ugo Basile, Comerio-Varese, Ιταλία), οι καρδιές τους εγχύθηκαν επί τόπου με οξυγονωμένο τροποποιημένο διττανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα Krebs-Henseleit με ανάδρομη αορτική σωλήνωση. Οι καρδιές στη συνέχεια αποκόπηκαν και μετακινήθηκαν σε μια συσκευή Langendorff (Hugo Sachs Electronik, March-Hugstetten, Γερμανία), όπου εγχύθηκαν με οξυγονωμένο τροποποιημένο ρυθμιστικό διττανθρακικών Krebs-Henseleit σε σταθερή πίεση διάχυσης 75 mmHg. Μια κοιλία λατέξ γεμάτη νερό εισήχθη μέσω της πνευμονικής φλέβας και συνδέθηκε με έναν μετατροπέα πίεσης Isotec (Hugo Sachs Electronik) για τη μέτρηση της πίεσης της αριστερής κοιλίας (LVP). Οι καρδιές αφέθηκαν να ισορροπήσουν για 15 λεπτά, οπότε η τελοδιαστολική πίεση της αριστερής κοιλίας (EDP) ρυθμίστηκε στα 10 mmHg και αυτός ο όγκος μπαλονιού διατηρήθηκε καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στη συνέχεια, η βασική συσταλτική λειτουργία, ο καρδιακός ρυθμός και η στεφανιαία ροή (εξωσωματικός ανιχνευτής ηλεκτρομαγνητικής ροής, narco Bio-systems, Houston,

TX, ΗΠΑ) μετρήθηκαν. Η καρδιακή συσταλτική λειτουργία υπολογίστηκε αφαιρώντας το LVEDP από τη συστολική πίεση κορυφής LV (LVSP), δίνοντας ανεπτυγμένη πίεση (LVDP). Μετά από εξισορρόπηση 1 ώρας, οι αορτικοί δακτύλιοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορέα (αλατόνερο) ή CaG (10 ug/ml, 100 ug/ml) 10 λεπτά πριν προκληθεί η συστολή από φαινυλεφρίνη 1 μΜ. Στη συνέχεια, η εξαρτώμενη από το ενδοθήλιο χαλάρωση προκλήθηκε από ακετυλοχολίνη (0,1-100 μΜ) [22].

Στατιστική ανάλυση

Ο μέσος όρος και το τυπικό σφάλμα όλων των παραμέτρων που μελετήθηκαν προσδιορίστηκαν για κάθε ομάδα χρησιμοποιώντας τη δοκιμή ANOVA. Διεξήχθη μια δοκιμή t Student για τον προσδιορισμό σημαντικών διαφορών μεταξύ των ομάδων ελέγχου και των ομάδων που έλαβαν θεραπεία. Μια τιμή p<0.05 was="" considered="">

Αποτελέσματα

Αλλάζει το σωματικό βάρος και το λίπος

Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο μέσο σωματικό βάρος μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Εικ. 1). Κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης 1-μήνα, τα σωματικά βάρη των ηλικιωμένων αρσενικών αρουραίων ήταν συγκρίσιμα στις ομάδες ελέγχου και στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με CaG-, IQG- και CS. Τα μέσα εβδομαδιαία βάρη σώματος παρουσιάζονται στο Σχ. 2α: CON, 685,16 ± 9,14 g. CaG5, 659,54 ± 14,21 g; IQG5, 646,50 ± 11,56 g και CS10, 662,93 ± 7,82 g. Η μέση ποσότητα κοιλιακού λίπους μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες IQG5 και CS10 σε σύγκριση με τον έλεγχο: 21,84 ± 7,46 g για τον έλεγχο. 20,66 ± 8,47 g για CaG5. 16,56 ± 5,97 g για IQG5 (IQG5 έναντι CON, p < 0,05);="" και="" 16,93="" ±="" 5,17="" g="" για="" cs10="" (cs10="" έναντι="" con,="" ρ="">< 0,05)="" (εικ.="" 2a).="" το="" επιδιδυμιδικό="" λίπος="" ήταν="" επίσης="" σημαντικά="" μειωμένο="" στις="" ομάδες="" iqg5="" και="" cs10="" σε="" σύγκριση="" με="" τον="" έλεγχο:="" 10,38="" ±="" 2,58="" g="" για="" έλεγχο.="" 8,19="" ±="" 4.00="" g="" για="" cag5;="" 7.00="" ±="" 1,35="" g="" για="" το="">

(IQG5 vs CON, p < 0.05);="" και="" 8,56="" ±="" 2,53="" g="" για="" cs10="" (cs10="" έναντι="" con,="" ρ="">< 0,05)="" (εικ.="">

Πυκνότητα λιποκυττάρων

Η πυκνότητα λιποκυττάρων [αριθμός κυττάρων/περιοχή (mm2)] των ιστών ήπατος αρουραίου που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GAG σε HFD, όπως αξιολογήθηκε με χρώση με μπλε τολουιδίνης Ο, μειώθηκε με CaG5 (33.00 ± 1,73), IQG5 (45). .00 ± 4,36) ή CS10 (26.00 ± 2,52) (CS10 έναντι CON, p < 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο (51.00 ± 5,29) (Εικ. 2β).

Αλλάζει η αρτηριακή πίεση και ο καρδιακός ρυθμός

Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην αρτηριακή πίεση (συστολική αρτηριακή πίεση ή καρδιακός ρυθμός) μεταξύ των ομάδων που έλαβαν 5 mg/kg CaG-, IQG- ή CS και της ομάδας ελέγχου (δεν παρουσιάζονται δεδομένα).

Αιματολογία και χημεία αίματος

Παρατηρήθηκαν ορισμένες δοσοεξαρτώμενες αλλαγές μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου σε σχέση με τις αιματολογικές παραμέτρους που εξετάστηκαν στο τέλος του πειράματος. Υπήρξε μια αύξηση 27,5 τοις εκατό στο APTT (δευτ.) στην ομάδα που έλαβε CaG5-: CON, 35,68 ± 5,68; CaG5, 45,49 ± 10,91; IQG5, 29,93 ± 3,57; CS10, 36,83 ± 23,95 (Εικ. 3). Ο χρόνος θρομβίνης (δευτ.) ήταν ως εξής: CON, 40,18 ± 2,04; CaG5, 42,13 ± 3,23; IQG5, 36,15 ± 6,67; CS10, 45,02 ± 21,89. Υπήρξε μια σημαντική (62,6 τοις εκατό) αύξηση στον Παράγοντα Ι (ινωδογόνο, mg/dL) στην ομάδα που έλαβε CaG5-: CON, 429,33 ± 142,22; CaG5, 698,29 ± 120,28 (CaG5 vs CON, ρ < 0,05);="" iqg5,="" 627,14="" ±="" 160,67;="" cs10,="" 790.00="" ±="" 274,22="" (cs10="" έναντι="" con,="" p="">< 0,05).="" ο="" χρόνος="" προθρομβίνης="" (δευτ.)="" ήταν="" ως="" εξής:="" con,="" 62.86="" ±="" 47,30;="" cag5,="" 52,71="" ±="" 4,96;="" iqg5,="" 52,14="" ±="" 5,58;="" cs10,="" 55.00="" ±="">

Βιοχημεία ορού

Σε ορούς από τις ομάδες που έλαβαν IQG και CS (Πίνακας 1), τα επίπεδα φωσφολιπιδίων (mg/dL) ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό,τι στους ορούς ελέγχου μετά από 1 μήνα σε ηλικιωμένους αρουραίους: CON, 271,78 ± 91,74; CaG5, 233,67 ± 71.0; IQG5, 173,2 ± 32.{{2{0}}2 (IQG5 έναντι CON, p < 0.05);="" cs10,="" 259,7="" ±="" 57,27="" (cs10="" έναντι="" con,="" ρ="">< 0,05).="" τα="" επίπεδα="" ελεύθερων="" λιπαρών="" οξέων="" (μeq/l)="" μειώθηκαν:="" con,="" 686,78="" ±="" 104,67;="" cag5,="" 431,33="" ±="" 66,22="" (cag5="" έναντι="" con,="" ρ="">< 0,05);="" iqg5,="" 405,6="" ±="" 63,39="" (iqg5="" vs.="" con,=""><0.05); cs10,="" 566.9="" ±="" 115.38="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). also,="" serum="" gpt="" (alt)="" levels="" (iu/l)="" in="" the="" cag-="" and="" iqg-="" treated="" groups="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" control="" group="" in="" aged="" rats:="" con,="" 76.33="" ±="" 40.21;="" cag5,="" 36.78="" ±="" 8.0="" iu/l;="" iqg5,="" 43.22="" ±="" 13.86="" (iqg5="" vs.="" con,p="" <="" 0.05);="" cs10,="" 53.44="" ±="" 11.36="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). fur-="" thermore,="" the="" mean="" creatinine="" phosphokinase="" (ck="" u/l)="" level="" in="" the="" cag-treated="" group="" was="" lower="" than="" that="" in="">

ομάδα ελέγχου σε ηλικιωμένους αρουραίους: CON, 125,78 ± 91,66; CaG5, 1{{1{0}}2,89 ± 65,73 (CaG5 έναντι CON, p < 0,05);="" iqg5,="" 91,22="" ±="" 24,74;="" cs10,="" 131,2="" ±="" 62,56.="" η="" μέση="" γλυκόζη="" ορού="" (mg/dl)="" μειώθηκε="" σημαντικά="" σε="" ηλικιωμένους="" αρουραίους="" (κάθε="" ομάδα="" έναντι="" con,="" p="">< 0,05):="" con,="" 435,11="" ±="" 105,42;="" cag5,="" 304,0="" ±="" 44,44;="" iqg5,="" 275,9="" ±="" 43,18;="" cs10,="" 317,8="" ±="">

Το μέσο επίπεδο ολικής χοληστερόλης (mg/dl) στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με IQG ήταν χαμηλότερο από ό,τι στην ομάδα ελέγχου σε ηλικιωμένους αρουραίους, και αυτή η διαφορά ήταν επίσης σημαντική: CON, 212,67 ± 92,82; CaG5, 181,44 ± 68,4; IQG5, 124,1 ± 23,6 (IQG5 έναντι CON, p < 0,05);="" cs10,="" 198,9="" ±="">

Επιπλέον, τα επίπεδα τριγλυκεριδίων (mg/dL) ήταν ως εξής: CON, 207,89 ± 101,95; CaG5, 136,22 ± 61,6; IQG5, 103,3 ± 35,59 (IQG5 έναντι CON, p < 0.05);="" cs10,="" 183,4="" ±="" 104,74.="" τα="" επίπεδα="" της="" ldl="" χοληστερόλης="" (mg/dl)="" μειώθηκαν:="" con,="" 74,67="" ±="" 44,91;="" cag5,="" 69,0="" ±="" 31,3;="" iqg5,="" 41,44="" ±="" 10,14="" (iqg5="" έναντι="" con,="" ρ="">< 0,05);="" cs10,="" 65,22="" ±="" 18,52.="" σημαντικές="" μειώσεις="" του="" επιπέδου="" ουρικού="" οξέος="" (mg/dl)="" παρατηρήθηκαν="" σε="" όλες="" τις="" ομάδες="" που="" έλαβαν="" gag="" σε="" σύγκριση="" με="" τον="" έλεγχο="" (κάθε="" ομάδα="" έναντι="" con,="" p="">< 0,05):="" con,="" 10,9="" ±="" 2,26;="" cag5,="" 8,12="" ±="" 1,48;="" iqg5,="" 6,49="" ±="" 0,89;="" cs10,="" 8,14="" ±="" 2,17,="" πίνακας="">

Μείωση της οξειδωτικής βλάβης

Η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA, nmol/ml) προσδιορίστηκε μετά από 1 μήνα από κάθε θεραπεία GAG [CON, 252,9 ± 13,1; CaG5, 175,1 ± 5,8 (30,32 τοις εκατό μειώσεις). Κάθε θεραπεία με GAG και θειική χονδροϊτίνη μείωσε την υπεροξείδωση των λιπιδίων στα ηπατοκύτταρα (Εικ. 4α). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης καρβονυλίου στο αίμα μειώθηκε σε αναλογία 68,52 τοις εκατό, 36,89 τοις εκατό και 53,70 τοις εκατό στα GaG5, IQG5 και CS10, αντίστοιχα (Εικ. 4β). Όμως, κάθε GAG δεν είχε στατιστικές διαφορές σε σύγκριση με τον μάρτυρα στην περιεκτικότητα σε καρβονύλιο των ηπατοκυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Ποσοτικοποίηση οξειδωτικών ενζύμων (καταλάση, GPx, GST, SOD).

Η δράση καταλάσης (mg πρωτεΐνης/λεπτό) στα ηπατοκύτταρα μετά από 1 μήνα θεραπείας με GAG ήταν η εξής: CON, 17,72 ± 2,81; CaG5, 19,87 ± 3,88; IQG5, 17,22 ± 4,55; CS10, 19,23 ± 3,55. Η δραστηριότητα καταλάσης σε όλες τις ομάδες ηπατοκυττάρων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CaG αυξήθηκε. Η δισμουτάση του υπεροξειδίου (SOD) είναι ένα ένζυμο δέσμευσης ελεύθερων ριζών (υπεροξείδιο). Η δραστικότητα SOD (nmol/min/ml) αυξήθηκε στις ομάδες θεραπείας σε σύγκριση με τον έλεγχο: έλεγχος, 381,44 ± 85,32. CaG5, 400,56 ± 60,62; IQG5, 386,72 ± 69,22; CS10, 513,05 ± 60,07. Η δραστικότητα υπεροξειδάσης γλουταθειόνης (μονάδα/mg πρωτεΐνης) στην ομάδα ηπατοκυττάρων που υποβλήθηκε σε αγωγή με CaG αυξήθηκε σημαντικά από τη θεραπεία (CaG5 έναντι CON, p <0,05) και="" τη="" δραστικότητα="" s-τρανσφεράσης="" γλουταθειόνης="" (nmol/min/ml)="" η="" ομάδα="" cag="" αυξήθηκε="" επίσης="" σημαντικά="" σε="" σύγκριση="" με="" εκείνη="" στην="" ομάδα="" ελέγχου="" (cag5="" έναντι="" con,="" p="">< 0,05)="" (πίνακας="">

Παραγωγή κυτοκίνης IL-1 και IL-10

Αυξήσεις στα επίπεδα IL-10 παρατηρήθηκαν στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με CaG. Τα επίπεδα IL-1 (ρg/ml) στον ορό μειώθηκαν κατά 1

Πίνακας 1 Ορολογικά ευρήματα ηλικιωμένων αρουραίων που έλαβαν θεραπεία με CaG ή IQG για 1 μήνα

μήνας θεραπείας CaG ή IQG, που δείχνει τις αντιφλεγμονώδεις δράσεις των ενώσεων: έλεγχος, 251,3 ± 70.7; CaG5, 102,9 ± 9,5; IQG5, 110,4 ± 5,2; CS10, 110,4 ± 10,1 (κάθε ομάδα έναντι CON, p < 0,05).="" η="" δραστηριότητα="" της="" il-10="" (ρg/ml)="" μετά="" από="" 1="" μήνα="" θεραπείας="" με="" cag="" σε="" αρουραίους="" αυξήθηκε:="" con,="" 34,9="" ±="" 11,5;="" cag5,="" 67,4="" ±="" 13,3="" (cag5="" έναντι="" con,=""><0.05); iqg5,="" 55.5="" ±="" 24.7;="" cs10,="" 28.0="" ±="" 3.8="" (fig.="" 5).="" the="" il-10="" levels="" in="" the="" cs10="" group,="" was="" statistically="" different="" from="" that="" in="" the="" con="" group="" (cs10="" vs.="" con,p=""><>

Γονιδιακή έκφραση με ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο

The data represented that PCR cycle required number (Ct value) when the concentration of PCR amplicon are equilibrated by sample amplicon. Median CT values of 5 sample's represented, but there was no difference from the control group (Ct vale >2.0) στη χρησιμοποιημένη ακολουθία εκκινητών (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).

Μικροσυστοιχία DNA

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μικροσυστοιχίας με χρήση συστοιχίας κλώνων cDNA ποντικιού 28 K προκειμένου να αναγνωριστούν τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε ήπατα αρουραίου SD ηλικίας 15- μηνών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CaG, IQG και CS και να παρασχεθούν πληροφορίες σχετικά με τις πιθανέςαντι γήρανσημαρκαδόροι.

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η ομάδα CaG5 εμφάνισε 2- έως 4-πλάσια αύξηση σε 118 γονίδια, {{4}πλάσια αύξηση σε 11 γονίδια και μεγαλύτερη από 8-πλάσια αύξηση αύξηση σε 2 γονίδια. Τα επίπεδα έκφρασης των υπολοίπων ~30,{9}} γονιδίων παρέμειναν τα ίδια. Εξήντα γονίδια υπορυθμίστηκαν από 2- σε 4-πλάσια και 4 εμφάνισαν μείωση 4- έως 8-πλάσια.

Στην ομάδα IQG5 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, 162 γονίδια αυξήθηκαν κατά 2- έως 4-πλάσια, 10 γονίδια αυξήθηκαν κατά 4- έως 8-πλάσια και 3 γονίδια αυξήθηκαν κατά πάνω από 8- φορές. Από την άλλη πλευρά, 66 μειώθηκαν κατά 2- σε 4-πλάσιο και 7 μειώθηκαν κατά 4- σε 8-πλάσιο.

Πίνακας 2 Αντιοξειδωτικές ενζυμικές δραστηριότητες της γλυκοζαμινογλυκάνης σκαθαριού κοπριάς σε ηλικιωμένο ήπαρ αρουραίου

Στην ομάδα CS10 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, 63 γονίδια αυξήθηκαν κατά 2- έως 4-πλάσια, 2 γονίδια αυξήθηκαν κατά 4- έως 8-πλάσια και 2 γονίδια αυξήθηκαν κατά περισσότερο από 8- φορές. Τριάντα οκτώ γονίδια υπορυθμίστηκαν κατά 2- έως 4-πλάσια, 4 υπορυθμίστηκαν κατά 4- σε 8-πλάσια και 4 μειώθηκαν κατά περισσότερο από 8-πλάσιο.

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, το γονίδιο lipocalin2 (Lcn2) αυξήθηκε κατά περίπου 10-πλάσια στον ιστό του ήπατος που υποβλήθηκε σε θεραπεία με CaG5-, 46- φορές στην ομάδα IQ5 και {{6} }διπλώστε στην ομάδα CS10. Σε ηπατικούς ιστούς ποντικών που έλαβαν CaG5-, η λυσιλ οξειδάση (Lox) ρυθμίστηκε προς τα κάτω σε αναλογία 0,13, δηλαδή, η γονιδιακή έκφραση μειώθηκε. Η ομάδα αρουραίων που έλαβε θεραπεία με CaG5, σε σύγκριση με τον έλεγχο, έδειξε ότι 131 γονίδια συμπεριλαμβανομένης της λιποκαλίνης 2, της πρωτεΐνης που δεσμεύει ολιγοσακχαρίτη (Lbp) και του αναστολέα της πεπτιδάσης της σερίνης, Kaszal type3 (Spink3) ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (Πίνακας 3) και 64 γονίδια συμπεριλαμβανομένης της λυσυλοξειδάσης (Lox). Η αφυδατάση της σερίνης (sds) και η κορεσμένη ρετινόλη (Retreat) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (Πίνακας 4). Η ομάδα που έλαβε αγωγή με CaG, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, εμφάνισε μια ρύθμιση προς τα πάνω 131 γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της λιποκαλίνης 2, της πρωτεΐνης που δεσμεύει ολιγοσακχαρίτη (Lbp) και του αναστολέα πεπτιδάσης σερίνης Kaszal τύπου 3 (Spink3) (Πίνακας 3 ) και μείωση της ρύθμισης 64 γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της λυσυλοξειδάσης (Lox), της αφυδρατάσης της σερίνης (sds) και της κορεσμένης ρετινόλης (Retsat) (Πίνακας 4). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν τη λιποκαλίνη 2 και τις αδιποκίνες, ως προς τα πάνω ρυθμιζόμενα γονίδια, και τη λυσυλοξειδάση (που σχετίζεται με την ηπαρανάση), ως προς τα κάτω ρυθμισμένο γονίδιο, ως πιθανούς θεραπευτικούς δείκτες που δρουν κατά της γήρανσης και της παχυσαρκίας

Χαρακτηρισμός CaG

Οι συνθέσεις των αμινο, όξινων και ουδέτερων μονοσακχαριτών του GaG προσδιορίστηκαν με GC-MS (Πίνακας 5). Οι κύριοι αμινομονοσακχαρίτες του CaG είναι με την ακόλουθη σειρά: D-γλυκοζαμινικό οξύ > Ν-ακετυλ-γαλακτοζαμίνη > Ν-ακετυλ-D-γακτοζαμινιτόλη > γαλακτοζαμίνη HCl > γαλακτοζαμινικό οξύ > γαλακτοζαμίνη > γλυκουρονικό οξύ. Επίσης, οι ουδέτεροι μονοσακχαρίτες που βρίσκονται στο CaG είναι κυρίως - γλυκόζη και μαννιτόλη, ενώ οι δευτερεύοντες περιλαμβάνουν την αραβινόζη και τη ραμνόζη.

Δείκτες καρδιοπροστασίας

Σε αυτό το πείραμα, χαρακτηρίσαμε την άμεση επίδραση του CaG στις αρτηρίες αντίστασης χρησιμοποιώντας αγγεία που επωάστηκαν in vitro με σύσπαση που προκαλείται από φαινυλεφρίνη και χαλάρωση που προκαλείται από ακετυλοχολίνη. Το CaG αξιολογήθηκε ως καρδιοπροστατευτικός παράγοντας. Η καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης στο CaG μετατοπίστηκε προς τα κάτω σε σύγκριση με αυτήν που παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία ελέγχου (μόνο PBS), δείχνοντας ότι η διέγερση της καρδιάς συνέβη με τρόπο που εξαρτάται από τη συγκέντρωση (Εικ. 6).

Συζήτηση

Η γήρανση είναι μια διαδικασία προοδευτικής μείωσης της φυσιολογικής ικανότητας ενός οργανισμού, που εκδηλώνεται με συσσωρευμένες αλλοιώσεις και αποσταθεροποίηση σε ολόκληρο το σύστημα [13]. Η γλυκοζαμινογλυκάνη πιστεύεται ότι μειώνει τις βλαβερές συνέπειες της γήρανσης αποτρέποντας την καταστροφή του χόνδρου, των οστών, των δίσκων, του δέρματος [23], του αγγειακού συστήματος [8] κ.λπ. Πρόσφατα, ένας τύπος GAG ως πολυλειτουργικά υλικά, πολυουρεθάνη με βάση ηπαρίνης ή θεωρείται επί του παρόντος ως ένα από τα καθιερωμένα βιοσυμβατά και συμβατά με το αίμα

βιοϋλικά που προσφέρουν τρομερή σχέση δομής-ιδιότητας, όπως η ακινητοποίηση ηπαρίνης σε μοσχεύματα πολυουρεθάνης τροποποιημένης χιτοζάνης με αντικολλητικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες [24]. Στις μέρες μας, η έλευση του ελέγχου θερμοκρασίας κατέστησε δυνατό τον σχεδιασμό συστημάτων εκτροφής εντόμων μεγάλης κλίμακας. Επομένως, η γλυκοζαμινογλυκάνη

μπορεί να ληφθεί από τον φλοιό των εντόμων ως υπόλειμμα εκχυλίσματος αλκοόλης. Τέτοια ακατέργαστα φάρμακα από σκαθάρια κοπριάς και B. ignitus queens έχουν μελετηθεί σε μια προσπάθεια να εντοπιστούν τα ενεργά συστατικά τους ή να γίνουν τα εκχυλίσματα ασφαλέστερα για ανθρώπινη χρήση. Το σκαθάρι κοπριάς C. molossus καθαρίστηκε για να δώσει διμερή Ν-ακετυλ-ντοπαμίνης, μολοσσουσαμίδη AC (1-3), δείχνοντας

COX-1 και COX-2 ανασταλτική δραστηριότητα [25]. χιτοζάνη [26]; μελανίνη [27]; και πρωτεάσες σερίνης [9, 28]. Ένα εκχύλισμα μέλισσας (Bombus ignitus) αποδείχθηκε ότι περιέχει πρωτεάση σερίνης από δηλητήριο μέλισσας [29], υπεροξιρεδοξίνες [30] και πρωτεΐνη αναγνώρισης πεπτιδογλυκάνης (PGRP-S) [31].

Οι στρατηγικές για την πρόληψη ή την καθυστέρηση της γήρανσης περιλαμβάνουν την κατάποση αντιοξειδωτικών για την αποκατάσταση της οξειδωτικής κυτταρικής βλάβης στο DNA, τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια, καθώς και την αναγέννηση ιστού με τη μεσολάβηση των βλαστοκυττάρων και τη γονιδιακή θεραπεία [32]. Ως δείκτης λιπιδικής οξειδωτικής βλάβης στις καταστάσεις οξειδωτικού στρες των λιπιδίων των ηπατοκυττάρων, η μηλονοδιαλδεΰδη μειώθηκε με τη θεραπεία με CaG. Επίσης, η περιεκτικότητα σε καρβονύλιο στο αίμα, ειδικά στα ουδετερόφιλα, μειώθηκε με τη θεραπεία CAG και έδειξε ότι επιδιορθώνει τη βλάβη της κυτταρικής οξειδωτικής πρωτεΐνης.

Οι γλυκοζαμινογλυκάνες από το C. molossus και το B. ignitus queens αποτελούνται κυρίως από D-γλυκοζαμινικό οξύ ως όξινο μονοσακχαρίτη και Ν-ακετυλο-γαλακτοζαμινιτόλη ως αμινο

μονοσακχαρίτης, μαζί με -γλυκόζη και D-μαννιτόλη ως ουδέτερους μονοσακχαρίτες. Έτσι, η ένωση μπορεί να έχει πρόσβαση στους υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης και μπορεί να αποτρέψει τις αιτίες ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία αλλάζοντας τον ενεργειακό μεταβολισμό. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες θα μπορούσαν να επιδιορθώσουν τους συνδετικούς ιστούς [23], τον διαβρωμένο χόνδρο, τους δίσκους, τα οστά και τις γλυκοπρωτεΐνες σε μοριακό επίπεδο, με το GAG να σχηματίζει έναν δεσμό μεταξύ των πρωτεϊνών [9]. Σε αυτό το πείραμα, οι αρουραίοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ηλικιωμένοι και ζύγιζαν περίπου 680 g, επομένως, δεν θα ήταν εύκολο να επιτευχθεί μείωση του σωματικού βάρους, αλλά παρατηρήσαμε μειωμένο βάρος λιπώδους λίπους και τον αριθμό των λιποκυττάρων. Όπως συμβαίνει με τις περισσότερες γλυκοζαμινογλυκάνες, η CaG και η IQG επέφεραν μείωση των επιπέδων ορού των παραμέτρων που σχετίζονται με τη φλεγμονή: ελεύθερο λιπαρό οξύ, AST (SGPT), κινάση κρεατινίνης (σχετική καρδιακή λειτουργία), γλυκόζη, ουρικό οξύ και που σχετίζονται με υπεργλυκαιμία. επίπεδα: χοληστερόλη, ολική, τριγλυκερίδια, χοληστερόλη LDL, κ.λπ. Τα επίπεδα ελεύθερων λιπαρών οξέων (σχετιζόμενο λιπώδες ήπαρ) των ομάδων που έλαβαν θεραπεία μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά, 36,7 τοις εκατό στην ομάδα CaG και 40,94 τοις εκατό στην ομάδα IQG. Επίσης, το επίπεδο sGPT (σχετική ηπατική λειτουργία) μειώθηκε σημαντικά, 51,58 τοις εκατό στην ομάδα CaG και 43,38 τοις εκατό στην ομάδα IQG.

Τα δεδομένα που δημιουργήθηκαν από την ανάλυση μικροσυστοιχίας DNA υποστήριξαν τοαντι γήρανσηεπίδραση του IQG, με σημαντικές αλλαγές στα προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε αρουραίους SD ηλικίας 14-μηνών που παρατηρήθηκαν μετά από περίοδο θεραπείας 1-μήνων. Οι αρουραίοι που έλαβαν CaG5-, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, είχαν αυξήσεις σε 131 γονίδια, συμπεριλαμβανομένης της λιποκαλίνης 2 [33], της πρωτεΐνης που δεσμεύει λιποσακχαρίτες (Lbp) [34] και ενός αναστολέα πεπτιδάσης σερίνης, Kazal type3 (Spink3) [35] και μειώνεται σε 64 γονίδια, συμπεριλαμβανομένης της λυσυλοξειδάσης (Lox) [36], της αφυδατάσης της σερίνης (sds) [37] και της κορεσμένης ρετινόλης (Retsat) [38]. Τα δεδομένα υποδεικνύουν τη λιποκαλίνη 2 και τις αδιποκίνες, που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, και τη λυσυλοξειδάση (που σχετίζεται με την ηπαρανάση), η οποία ρυθμίστηκε προς τα κάτω, ως πιθανούς θεραπευτικούς δείκτες γιααντι γήρανσηεπιπτώσεις σε παχύσαρκα ζώα.

Η παρούσα μελέτη παρατήρησε σημαντικές αλλαγές στα προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε ηλικιωμένους αρουραίους μετά από θεραπεία με CaG ή IQG για 1 μήνα. Η γονιδιακή έκφραση της λιποκαλίνης-2, η οποία είναι μια αδιποκίνη που εμπλέκεται στην αντίσταση στην ινσουλίνη [39] και μια εκκριτική πρωτεΐνη με ευημερίες δέσμευσης λιπιδίων, αυξήθηκε κατά περίπου 10 φορές. Αυτό συμφωνεί με μια μελέτη μικροσυστοιχίας που ανέφερε ότι η κατάποση σόγιας προκαλεί αύξηση της ενδογενούς αμυλοειδούς συνθάσης της προσταγλανδίνης D2 τύπου λιποκαλίνης (Ptgds), που οδηγεί σε καταστολή του αμυλοειδούς και αποτρέποντας τη γνωστική δυσλειτουργία [4{{ 22}}]. Η πρωτεΐνη σύνδεσης λιποπολυσακχαρίτη (LPS) (LBP), ένας υποκατάστατος δείκτης της μικροβιακής μετατόπισης, σχετίζεται με μειωμένη φυσική λειτουργία και αυξημένη φλεγμονή [41]. Η φυσιολογική διαδικασία γήρανσης μεταβάλλει το σύστημα πήξης του αίματος στον άνθρωπο. Τα φυσικά αντιπηκτικά, συμπεριλαμβανομένης της αντιθρομβίνης III, του συμπαράγοντα ηπαρίνης II, της πρωτεΐνης C, της πρωτεΐνης S και του αναστολέα της οδού του παράγοντα ιστού, μπορούν να ρυθμίσουν τις αντιδράσεις του συστήματος πήξης του αίματος [42]. Σε αυτή τη μελέτη, υπήρξαν σημαντικές αυξήσεις στον παράγοντα I (ινωδογόνο) σε ομάδες CaG (162,6 τοις εκατό), IQG (146,0 τοις εκατό) και CS10 (184,0 τοις εκατό) - σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, που έλαβε θεραπεία με PBS. Επίσης, το επίπεδο της LBP (πρωτεΐνη δέσμευσης LPS) αυξήθηκε στα δεδομένα της μικροσυστοιχίας DNA μας, υποδηλώνοντας ότι η ηπαρίνη (GAG) συνδέεται με την LBP, διευκολύνει τη μεταφορά του LPS στο CD14 και ενισχύει την ενεργοποίηση των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος με τη μεσολάβηση LPS, με αποτέλεσμα αντιπηκτική δράση [43]. Ένας αναστολέας θρυψίνης, ο αναστολέας της πρωτεάσης σερίνης Kazal-τύπου 3 (Spink3), ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε αυτό το πείραμα, υποδεικνύοντας έναν ρόλο για την παρακρινική διαμόρφωση. εμπλέκεται επίσης στην εμφύτευση εμβρύου [44]. Καθώς το Spink3 είναι ένας σημαντικός αναστολέας πρωτεάσης σερίνης, η ανοδική ρύθμισή του μπορεί να αντανακλά έναν σημαντικό ενδογενή κυτταροπροστατευτικό μηχανισμό που θα αποτρέψει περαιτέρω τραυματισμό [45]. Η προς τα κάτω ρύθμιση της λυσυλοξειδάσης μπορεί να υποδεικνύει ότι η ηπαρίνη (GAG) που αναστέλλει τη στενή δέσμευση της λυσυλοξειδάσης στα προσχηματισμένα ινίδια δεν επηρεάστηκε σχεδόν καθόλου [46]. Η μείωση του κορεσμού της ρετινόλης που παρατηρήθηκε σε αυτό το πείραμα είναι αξιοσημείωτη, καθώς η κορεσμένη ρετινόλη προάγει τη λιπογένεση και ρυθμίζεται προς τα κάτω στην παχυσαρκία [47]. Σύμφωνα με μια υπόθεση, η πυκνότητα του λιπώδους ιστού, ένας νέος βιοδείκτης που προβλέπει τον κίνδυνο θνησιμότητας σε ηλικιωμένους ενήλικες που δεν φαίνεται να σχετίζεται με φλεγμονή [48], επιπλέον, το CaG μείωσε σημαντικά την πυκνότητα του λιπώδους ιστού που υπόσχεται μια ισχυρήαντι γήρανσημέσο.

συμπεράσματα

Η γλυκοζαμινογλυκάνη της κοπριάς μείωσε τα επίπεδα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων στον ορό, προκάλεσε μείωση στο βάρος του λιπώδους ιστού και ομαλοποίηση των επιπέδων του ελεύθερου λιπαρού οξέος, GPT, γλυκόζης και ουρικού οξέος στον ορό και παράταση του χρόνου πήξης που θα εμπόδιζε τη συσσώρευση του αίματος και τα λιπίδια συσσώρευση σε αγγειακούς ενδοθηλιακούς φραγμούς που συμβάλλουν στην ομοιόσταση στο κυκλοφορικό σύστημα. Η IL{{0}} (pg/ml) στον ορό μειώθηκε κατά 1 μήνα θεραπείας με CaG ή IQG, επιδεικνύοντας αντιφλεγμονώδη δράση. Επιπλέον, το προστατευτικό γονίδιο του ήπατος λιποκαλίνη ήταν σε μεγάλο βαθμό ({4}}πλάσιο) ρυθμισμένο προς τα πάνω και η λυσυλοξειδάση υπορυθμίστηκε (0,1- φορές) σε αρουραίους που έλαβαν CaG. Το CaG που προέρχεται από έντομα θα μπορούσε να είναι α

ασφαλέστερη αντικατάσταση της ηπαρίνης και άλλων GAG από θηλαστικές πηγές, καθώς οι πηγές εντόμων μειώνουν την πιθανότητα μετάδοσης μολυσματικών ιών από ζώα όπως οι χοίροι. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CaG και το BIQ δεν θα μπορούσαν μόνο να είναι φυσικάαντι γήρανσηπαράγοντες αλλά και λειτουργικά τρόφιμα, παρόμοια με τη χιτοζάνη και μελλοντικά βιοϋλικά που παίζουν ζωτικό ρόλο στην καθημερινή μας ζωή.

Συντομογραφίες

ALP: Αλκαλική φωσφατάση; ALT(GPT): Γλουταμινικό πυροσταφυλικό τρανσαμινάση. aPTT: Ενεργοποιημένος χρόνος μερικής θρομβοπλαστίνης. AST(GOT): Γλουταμινική οξαλοξική τρανσαμινάση. ΚΟΥΛΟΥΡΙ: Αζώτο ουρίας αίματος. CaG 5: Σκαθάρι κοπριάς (Catharsius molossus) γλυκοζαμινογλυκάνη 5 mg/kg; CK: Φωσφοκινάση κρεατινίνης. ΣΥΝ: Ομάδα ελέγχου. CRP: C-αντιδρώσα πρωτεΐνη.

CS10: Θειική χονδροϊτίνη (10 mg/kg); GAG: Γλυκοζαμινογλυκάνη; GGT: - γλουταμυλ τρανσφεράση; H. Chol: Υψηλή χοληστερόλη. IQG5: Queen of Bombus ignitus (ένας τύπος μέλισσας) γλυκοζαμινογλυκάνη 5 mg/kg. l.Chol: Χαμηλή χοληστερόλη. LDH: Γαλακτική αφυδρογονάση. PT: Χρόνος προθρομβίνης. T. Chol: Ολική χοληστερόλη. TG: Τριγλυκερίδια

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν την Εθνική Ακαδημία Γεωργικής Επιστήμης για οικονομική (RDA, PJ011853) και τεχνική υποστήριξη.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το έργο Rural Development Administration Basic Research, PJ011853.

Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών

Όλα τα δεδομένα είναι διαθέσιμα στις πύλες του περιοδικού στο υποβληθέν χειρόγραφο. Δεν χρειάζονται άλλα υποστηρικτικά αρχεία/δεδομένα μαζί με αυτήν την υποβολή.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Συνεισφορές συγγραφέων

Η MY πραγματοποίησε τα περισσότερα από τα πειράματα, ετοίμασε το χειρόγραφο: συνέλαβε τη μελέτη, συμμετείχε στο σχεδιασμό και τον συντονισμό της, συνέλεξε και ανέλυσε δεδομένα και ετοίμασε το χειρόγραφο. Ο BJ διεξήγαγε τις μελέτες σε ζώα, συμμετείχε σε δοκιμασία οξειδωτικών σχετικών ενζύμων. Ο HJ πραγματοποίησε προσδιορισμούς κυτοκίνης. Ο JS συμμετείχε στην ευθυγράμμιση γενετικής αλληλουχίας. Ο ΚΚ συμμετείχε στη μικροσυστοιχία DNA. Το YS πραγματοποίησε in vivo μελέτη της ανταπόκρισης των αρτηριών αντίστασης. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Συγκατάθεση για δημοσίευση

Αυτό το χειρόγραφο δεν περιέχει δεδομένα μεμονωμένων ατόμων σε οποιαδήποτε μορφή.

Έγκριση δεοντολογίας

Οι μελέτες που αφορούσαν ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Εργαστηριακών Ζώων της Εθνικής Ακαδημίας Γεωργικής Επιστήμης, RDA, Νότια Κορέα (NAAS1503).

Τα χειρόγραφα που αναφέρουν μελέτες δεν περιείχαν ανθρώπινους συμμετέχοντες, ανθρώπινα δεδομένα ή ανθρώπινους ιστούς.

Σημείωση εκδότη

Το Springer Nature παραμένει ουδέτερο όσον αφορά τις διεκδικήσεις δικαιοδοσίας σε δημοσιευμένους χάρτες και θεσμικές σχέσεις.

Στοιχεία συγγραφέα

1 Τμήμα Αγροτικής Βιολογίας, Εθνική Ακαδημία Αγροτικής Επιστήμης, Διοίκηση Αγροτικής Ανάπτυξης (RDA), Wanju-Gun 55365, Νότια Κορέα. 2 Κολλέγιο Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Ajou, Suwon 442-749, Νότια Κορέα. 3Pharmacogenechips Inc., Chuncheon 200-160, Νότια Κορέα.