Μια έμφυτη στρατηγική ανίχνευσης παθογόνων που περιλαμβάνει την ουβικουϊτινοποίηση των βακτηριακών πρωτεϊνών επιφανείας Μέρος 1

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παθογόνος εισβολή πυροδοτεί μια σειρά από ανοσολογικές αποκρίσεις που διεγείρονται από τους μηχανισμούς επιτήρησης του ξενιστή. Αυτό γενικά ξεκινά με την αναγνώριση διατηρημένων μικροβιακών μοριακών δομών γνωστών ως σχετιζόμενα με παθογόνα μοριακά μοτίβα (PAMPs). Η αποτελεσματική ανίχνευση αυτών των PAMP από τους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs) επάγει γρήγορα διάφορες ανοσολογικές αποκρίσεις του ξενιστή μέσω της ενεργοποίησης πολύπλοκων οδών σηματοδότησης που ενεργοποιούν την κάθαρση του παθογόνου.

Τα τελευταία χρόνια, με την ανάπτυξη της βιοτεχνολογίας και τη συνεχή βελτίωση της ερευνητικής τεχνολογίας, οι άνθρωποι έχουν μια βαθύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ των μικροβιακών μορίων και της ανοσίας. Τα διατηρημένα μικροβιακά μόρια είναι μια κατηγορία μικροβιακών μορίων που μπορούν να αναγνωριστούν από τους οργανισμούς και να πυροδοτήσουν ανοσολογικές αποκρίσεις. Περιλαμβάνουν κυρίως μοριακά συστατικά μικροοργανισμών όπως βακτήρια, ιούς και μύκητες, και είναι εξαιρετικά διατηρημένα και ειδικά. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα διατηρημένα μικροβιακά μόρια μπορούν να αντισταθούν σε διάφορα παθογόνα και να ενισχύσουν την ανοσία ενεργοποιώντας το ανοσοποιητικό σύστημα του σώματος.

Τα διατηρημένα μικροβιακά μόρια πυροδοτούν φλεγμονώδεις και ανοσολογικές αποκρίσεις ενεργοποιώντας σημαντικά μόρια στο ανοσοποιητικό σύστημα, όπως Τ κύτταρα, Β κύτταρα και μακροφάγα. Μετά την αναγνώριση των διατηρημένων μικροβιακών μορίων, αυτά τα κύτταρα θα απελευθερώσουν διάφορους ανοσομεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένων των κυτοκινών και των χημειοκινών, προσελκύοντας έτσι άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού για να ενταχθούν στην ανοσολογική απόκριση. Ταυτόχρονα, τα διατηρημένα μικροβιακά μόρια μπορούν επίσης να χρησιμεύσουν ως αντιγόνα για να ενεργοποιήσουν τις αποκρίσεις αντισωμάτων στο σώμα, σχηματίζοντας έτσι προστασία αντισωμάτων. Η αλληλεπίδραση αυτών των κυττάρων και των ανοσολογικών παραγόντων μπορεί να προστατεύσει καλύτερα το σώμα από παθογόνους παράγοντες.

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα διατηρημένα μικροβιακά μόρια μπορούν να βελτιώσουν την ανοσία του σώματος, προλαμβάνοντας και θεραπεύοντας έτσι μια ποικιλία ασθενειών, όπως μολυσματικές ασθένειες, αλλεργικές ασθένειες, καρκίνο κ.λπ. Για παράδειγμα, το συνήθως χρησιμοποιούμενο ανασυνδυασμένο εμβόλιο ηπατίτιδας Β είναι διατηρημένο μικροβιακό μόριο στο επιφανειακό αντιγόνο του ιού της ηπατίτιδας Β. Η ανοσολογική απόκριση του σώματος μπορεί να προκληθεί με τον εμβολιασμό του εμβολίου, για τη δημιουργία του επιφανειακού αντισώματος του ιού της ηπατίτιδας Β, για την επίτευξη του σκοπού της πρόληψης της μόλυνσης από τον ιό της ηπατίτιδας Β.

Συμπερασματικά, υπάρχει ισχυρή σύνδεση μεταξύ των διατηρημένων μικροβιακών μορίων και της ανοσίας. Χρησιμοποιώντας πλήρως την ανοσοτροποποιητική λειτουργία των διατηρημένων μικροβιακών μορίων, η ανοσία του σώματος μπορεί να βελτιωθεί και διάφορες ασθένειες μπορούν να προληφθούν και να αντιμετωπιστούν καλύτερα. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να δώσουμε ενεργή προσοχή στην εφαρμοσμένη έρευνα των διατηρημένων μικροβιακών μορίων και να προωθήσουμε την εφαρμογή τους στην πρόληψη και θεραπεία ασθενειών. Από αυτή την άποψη, πρέπει να βελτιώσουμε την ανοσία. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ανοσία, επειδή η τέφρα του κρέατος περιέχει μια ποικιλία βιολογικά ενεργών συστατικών, όπως πολυσακχαρίτες, δύο μανιτάρια και Huangli, κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να τονώσουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Διάφοροι τύποι κυττάρων, αυξάνουν την ανοσοποιητική τους δραστηριότητα.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστανάκι

Μέχρι σήμερα, έχουν ανακαλυφθεί και χαρακτηριστεί αρκετές κατηγορίες PRRs, όπως υποδοχείς τύπου Toll, υποδοχείς που μοιάζουν με το γονίδιο Ι (RIG-I) που επάγεται από το ρετινοϊκό οξύ, υποδοχείς τύπου NOD και υποδοχείς DNA (κυτοσολικοί αισθητήρες για DNA) (1 ). Αυτά τα PRRs βρίσκονται στην πρώτη γραμμή τόσο της εξωκυτταρικής όσο και της ενδοκυτταρικής αναγνώρισης παθογόνων και ανιχνεύουν διάφορες κατηγορίες μορίων σε μικρόβια, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, λιπιδίων, υδατανθράκων και νουκλεϊκών οξέων (2). Αυτό είναι ζωτικής σημασίας για την ανάσχεση της εξέλιξης της νόσου και την προώθηση της επιβίωσης του ξενιστή.

Η επιτήρηση του ενδοκυττάριου περιβάλλοντος για τον περιορισμό του πολλαπλασιασμού των παθογόνων είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της στειρότητας του κυτοσολίου. Μια παραβίαση τέτοιων αμυντικών μηχανισμών παρέχει στο παθογόνο καταφύγιο από την εξωκυτταρική έμφυτη ανοσία και προσφέρει μια ευκαιρία για γρήγορο πολλαπλασιασμό και διάδοση εντός του ξενιστή (3). Ως εκ τούτου, οι ισχυροί μηχανισμοί ανίχνευσης παθογόνων και τα αυτόνομα αμυντικά συστήματα των κυττάρων είναι κρίσιμα για τον περιορισμό των διεισδυτικών παθογόνων. Η Ubiquitination είναι μια στρατηγική που παίζει καθοριστικό ρόλο στην αναγνώριση και την εξάλειψη των παθογόνων (4).

Η οδός αποικοδόμησης που υπαγορεύεται από την ουβικουιτίνη δρα ως τελικό όριο έναντι των βακτηρίων που κατοικούν στο κυτταρόπλασμα που συχνά αποφεύγουν την κλασική ενδοκυτταρική θανάτωση διαρρηγνύοντας κενοτόπια που περιέχουν παθογόνο για να εισβάλουν στο κυτοσόλιο του ξενιστή. Πολλές λιγάσες ουβικιτίνης ξενιστή Ε3 έχουν αναγνωριστεί για να διακοσμούν φορτία συμπεριλαμβανομένων ενδοκυτταρικών παθογόνων με αλυσίδες πολυουβικιτίνης (Ub) (5), και παρόλο που έχουν ανιχνευθεί λίγοι βακτηριακοί στόχοι όπως οι πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης (6), παραμένει εκτεταμένη γνώση σχετικά με τη στρατηγική αναγνώρισης υποστρώματος περιορισμένος.

Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες τελεστές περιέχουν συνδεδεμένο με ουβικιτίνη τομέα (UBA) στο Mycobacterium tuberculosis (Mtb) που στρατολογούν παθητικά τμήματα ουβικιτίνης, παρέχοντας τελικά παθογόνο σε πρωτεΐνη 1A/1B-σχετιζόμενη με την ελαφριά αλυσίδα 3 (LC3) που σχετίζεται με τον μικροσωληνίσκο (7). Παράλληλα, ασυνήθιστα υποστρώματα ουβικιτίνης όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) και η γλυκάνη έχουν απεικονιστεί κομψά σε μερικά βακτηριακά παθογόνα, επιδεικνύοντας την ευελιξία των υποστρωμάτων ουβικουιτίνης (8, 9).

Συμπληρωματικά, η Rickettsia parkeri βρέθηκε να τροποποιεί ενεργά τις επιφανειακές πρωτεΐνες, προστατεύοντάς τες από την ουμπικουϊτινοποίηση και την επακόλουθη θανάτωση (10). Μαζί, αυτές οι ανεξάρτητες μελέτες τονίζουν τη σημασία του επιφανειακού εντοπισμού του υποστρώματος ουβικιτίνης. Ωστόσο, η ταυτότητα ενός πρωτεϊνούχου υποστρώματος στο παθογόνο και ο τρόπος με τον οποίο θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν με ακρίβεια από τη λιγάση Ε3 του ξενιστή παραμένουν αδιευκρίνιστα.
Αρκετές λιγάσες ουβικιτίνης-ξενιστές, όπως επαναλαμβανόμενες πλούσιες σε λευκίνη και αποστειρωμένο μοτίβο που περιέχει 1 (LRSAM1), Parkin, Ring finger protein 166 (RNF166), RNF213, Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E{{9} Η πρωτεϊνική λιγάση ουβικιτίνης 1 (ARIH1), η ειδική για το SMAD Ε3-λιγάση πρωτεΐνης ουβικιτίνης 1 (Smurf1) και το σύμπλοκο που περιέχει την πρωτεΐνη Skip-Cullin-F-box 2 (SCFFBXO2) έχουν αναφερθεί ότι διακοσμούν κενοτόπια που περιέχουν παθογόνο ή παθογόνο με μια ποικιλία τοπολογιών αλυσίδας ουβικιτίνης (8, 9, 11-18). Συγκεκριμένα, ειδικότερα, το LRSAM1 μέσω της αυτόματης ουβικιτίνης δημιουργεί πιθανώς ένα ισχυρό σήμα ουβικιτίνης γύρω από τα βακτήρια για να στρατολογήσει τον αυτοφαγικό μηχανισμό (19, 20). Οι λιγάσες ουβικιτίνης που είναι υπεύθυνες για τη σήμανση παθογόνων εμπλέκονται επίσης στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης, δημιουργώντας ένα εξαιρετικά λιτό σύστημα για αποτελεσματική και βέλτιστη χρήση των πόρων.

Μεταξύ των διαφόρων τοπολογιών αλυσίδας ουβικιτίνης που σχηματίζονται στο παθογόνο, η διακόσμηση M{0}}Ub οδηγεί πρωτίστως την πρόκληση φλεγμονής (21), ενώ και οι δύο τοπολογίες αλυσίδας K48- και K{3}}Ub στοχεύουν αποτελεσματικά τα μικρόβια προς αυτοφαγία ή πρωτεασωμικό σύστημα, αντίστοιχα (22). Πρόσφατα αποδείξαμε ότι η αλυσίδα K48-Ub έχει πιο κυρίαρχο αντιβακτηριακό αποτέλεσμα σε σύγκριση με το K63-Ub (23). Γενικά, οι κυτταρικές πρωτεΐνες που προορίζονται για πρωτεασωμική αποδόμηση επισημαίνονται με ειδικές λιγάσες της αλυσίδας K48- Ub. Το κρίσιμο σήμα για την αναγνώριση υποστρώματος από τέτοιες λιγάσες κατευθύνεται κυρίως από ένα μοτίβο degron (24).

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίζουμε την ύπαρξη μοτίβων degron σε επιφανειακές πρωτεΐνες φυλογενετικά διαφορετικών βακτηρίων τόσο θετικής όσο και αρνητικής κατά Gram προέλευσης. Η στόχευση τέτοιων υποστρωμάτων από μηχανήματα ουμπικουϊτινοποίησης ωθεί την αποτελεσματική εξάλειψη του παθογόνου από το κύτταρο ξενιστή. Χρησιμοποιώντας αυτό, επιδεικνύουμε τη μετατροπή μιας μη ουβικιτίνης επιφανειακής πρωτεΐνης σε υπόστρωμα ουβικιτίνης με μηχανική εισαγωγή degron για την προώθηση της βακτηριακής κάθαρσης. Αυτή η απλή αλλά γενική αρχή για τον εντοπισμό βακτηριακών υποστρωμάτων μπορεί να χρησιμεύσει ως διατηρημένος μηχανισμός αναγνώρισης παθογόνων κυτταροπλασμάτων, υπόσχεται να είναι αποτελεσματικός και πολλαπλών χρήσεων στην αποτροπή βακτηριακών λοιμώξεων.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η αλυσίδα K48-Ub προάγει την αίσθηση των παθογόνων κυτταροπλασματικών βακτηρίων

Κατά την ανίχνευση της κυτταροπλασματικής εισβολής από παθογόνα, ο ξενιστής τα σημάδεψε με αλυσίδες poly-Ub για να ενεργοποιήσει την κάθαρσή τους (22). Δεδομένου ότι τέτοιες αλυσίδες polyUb αποτελούνται κυρίως από K48- και K63-Ub, αρχικά διερευνήσαμε την κυριαρχία και τη χωρική θέση αυτών των τύπων αλυσίδων σε δύο φυλογενετικά διακριτά παθογόνα, τον Streptococcus pneumoniae (SPN) και τον ορό Salmonella enterica Typhimurium (STM), που προκαλούν πνευμονία και γαστρεντερίτιδα στον άνθρωπο, αντίστοιχα. Για αυτά τα παθογόνα, έχει τεκμηριωθεί η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός εντός του κυτοσόλης του κυττάρου ξενιστή (13, 25). Χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα για τη σύνδεση ουβικιτίνης, παρατηρήσαμε ότι ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ενδοκυτταρικών βακτηρίων σημειώθηκε με τον τύπο αλυσίδας K{6}} Ub (~26 τοις εκατό για το SPN και 37 τοις εκατό για το STm) σε αντίθεση με το K63- Ub (Εικ. 1Α).

Η ανάλυση της χωρικής θέσης με μικροσκόπιο δομημένου φωτισμού (SIM) έδειξε ότι τα κυτταροπλασματικά (χωρίς υπολείμματα κενοτοπίων) ή τα εκτεθειμένα σε κυτταρόπλασμα βακτήρια (εντός κατεστραμμένου ενδοσώματος) σχετίζονται κυρίως με το K48-Ub, ενώ το K63-Ub Το σήμα εντοπίστηκε σε κατεστραμμένα ενδοσώματα, σημειωμένα με Galectin-8 (Gal8, δείκτης ανίχνευσης βλάβης του ενδοσώματος) (Εικ. 1, B έως E) (26). Περίπου το 99 και το ~76 τοις εκατό των SPN και STm που έχουν υποστεί ουβικιτίνη K48-, αντίστοιχα, δεν είχαν Gal8 (Εικ. 1F). Η βακτηριακή παρουσία στο κυτταρόπλασμα επικυρώθηκε περαιτέρω με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) και ανοσοχρώση με δείκτη μεμβράνης FM4-64 (εικ. S1, A έως F). Βρήκαμε 78,4 και 80,4 τοις εκατό K48-Ub-θετικό SPN και STm, αντίστοιχα, χωρίς καμία συσχέτιση μεμβράνης, ενώ το 77,7 και 74,4 τοις εκατό K63-Ub-θετικό SPN και STm, αντίστοιχα, περιορίστηκαν εντός το κενοτόπιο (Εικ. 1G). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η επικάλυψη της βακτηριακής επιφάνειας με αλυσίδες K48-Ub είναι ένας σημαντικός μηχανισμός ανίχνευσης παθογόνων που χρησιμοποιείται από τον ξενιστή για την αναγνώριση μικροβίων που κατοικούν στο κυτταρόπλασμα.

Το Degron είναι ένας γενικός κώδικας για βακτηριακή ουβικουϊτινοποίηση

Στη συνέχεια επιχειρήσαμε να αναγνωρίσουμε το υπόστρωμα για την ουβικουϊτινοποίηση Κ48 στην βακτηριακή επιφάνεια. Ουσιαστικά, οι λιγάσες ουβικιτίνης ξενιστή Ε3, που αναφέρεται ότι εμπλέκονται στη βακτηριακή ουβικουιτίνη, εμπλέκονται επίσης σε κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες (12, 14) όπου οι αλυσίδες K{4}}Ub δρουν ως κύριο σήμα για την κυτταρική πρωτεόσταση. Υποθέσαμε ότι παρόμοιες αρχές θα μπορούσαν να υιοθετηθούν από τον ξενιστή για την αναγνώριση του υποστρώματος K48-Ub στην βακτηριακή επιφάνεια. Για τις πρωτεΐνες ξενιστές, η παρουσία ενός τριμερούς μοτίβου (μια πρωτογενής αλληλουχία degron ακολουθούμενη από ένα εγγύς υπόλειμμα λυσίνης και μια διαταραγμένη περιοχή στο μεταξύ) αναφέρεται ότι αποτελεί προϋπόθεση για την ουβικουϊτινίωση Κ48 (24).

Εξετάσαμε τις επιφανειακές πρωτεΐνες του SPN για την παρουσία παρόμοιων χαρακτηριστικών (Εικ. 1Η), αναγνωρίζοντας τα BgaA και PspA ως πιθανούς στόχους για ουμπικουϊτινοποίηση (Εικ. 1Η και Σχήμα S2, Α και Β). Η BgaA είναι μια -γαλακτοσιδάση που αναφέρεται ότι λειτουργεί ως προσκολλητίνη για την SPN, ενώ η PspA είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύει τη χολίνη που δεσμεύει τη λακτοφερρίνη και απαιτείται για την αποφυγή συμπληρώματος (27, 28). Παρατηρήσαμε μείωση ~50 έως 53 τοις εκατό στη συσχέτιση του τύπου αλυσίδας K48-Ub και για τα μεταλλαγμένα ΔbgaA και ΔpspA, χωρίς καμία αλλαγή στα επίπεδα K63-Ub (Εικ. 1I). Αυτή η μείωση ήταν έντονη (~75 τοις εκατό) σε ένα στέλεχος διπλού νοκ-άουτ (ΔbgaAΔpspA), υποδηλώνοντας τη μη περιττή φύση αυτών των υποστρωμάτων ουβικιτίνης (Εικ. 1Ι).

Επιπλέον, η έκφραση του BgaA-T (μια περικομμένη εκδοχή της πρωτεΐνης, που αποτελείται από τα αμινοξέα 1 έως 1049) και του PspA στα κύτταρα-ξενιστές οδηγεί στην ουμπικουϊτινοποίησή τους με τοπολογία K48-Ub (Εικ. 1J). Η εγκυρότητα των προβλεπόμενων στόχων επιβεβαιώθηκε με τη συμπλήρωση και το μοντέλο ενισχύθηκε με τη χρήση μεταλλάγματος ΔhysA (επιφανειακή πρωτεΐνη SPN που δεν πληροί τα τριμερή κριτήρια degron) ως μάρτυρα για τη βαθμολογία των επιπέδων συσχέτισης K48-Ub (Εικ. 1I ).

Στη συνέχεια εξερευνήσαμε την επίδραση της διακόσμησης K{0}}Ub στην κάθαρση των βακτηρίων.

Η απουσία υποστρωμάτων K48-Ub παρεμπόδισε τη βακτηριακή κάθαρση, με αποτέλεσμα σημαντικά βελτιωμένη ενδοκυτταρική επιμονή και για τα δύο μεταλλαγμένα στελέχη SPN (~1.8-πλάσιο για το ΔbgaA και ~2-πλάσιο για το ΔpspA) ( Εικ. 1Κ). Η καθολικότητα της προσέγγισής μας πρόβλεψης υποστρώματος επικυρώθηκε με την ταυτοποίηση αρκετών πρωτεϊνών που εκτίθενται στην επιφάνεια σε διάφορα άλλα παθογόνα ως πιθανά υποστρώματα για ουμπικουϊτινοποίηση (πίνακας S1). Ένας τέτοιος υποτιθέμενος υποψήφιος, μια πρωτεΐνη εξωτερικής μεμβράνης RlpA στο STm επιβεβαιώθηκε ως στόχος για τον μηχανισμό ουβικουϊτινοποίησης του ξενιστή, καθώς η μετάλλαξη ΔrlpA εμφάνισε ~1,5- φορές μειωμένη συσχέτιση με το K48-Ub σε σύγκριση με την άγρια ​​φύση. -τύπου (WT) STm (Εικ. 1L). Αυτό το εύρημα καθιέρωσε την ευρεία εφαρμογή της στρατηγικής επιλογής υποστρώματος. Από όσο γνωρίζουμε, αυτές είναι οι πρώτες βακτηριακές επιφανειακές πρωτεΐνες που αναφέρθηκαν ότι αναγνωρίζονται από μηχανήματα ουβικουιτίνης ξενιστή για την ανίχνευση και την κάθαρση των παθογόνων.

Ένα τριμερές μοτίβο είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ακριβή σήμανση ουβικιτίνης των βακτηριακών επιφανειακών πρωτεϊνών

Μετά την αναγνώριση του υποστρώματος, στοχεύσαμε να δοκιμάσουμε τα κρίσιμα χαρακτηριστικά του τριμερούς μοτίβου που αποτελούσε τη ραχοκοκαλιά της οθόνης μας (Εικ. 2Α και Εικ. S2A). Η διαγραφή της ακολουθίας degron (102VTPKEE107) στο BgaA-T οδήγησε σε πτώση ~50 τοις εκατό στη συσχέτιση του τύπου αλυσίδας K48-Ub, σε σύγκριση με το WT SPN ανεξάρτητα από παρόμοια αυξητική κινητική και ικανότητα προσκόλλησης κυττάρων (Εικ. 2C και Σχ. S3, Α και Β). Αυτή η μείωση ήταν συγκρίσιμη με το στέλεχος νοκ-άουτ ΔbgaA, επιβεβαιώνοντας τον ειδικό για το degron φαινότυπο. Εκτός από την αλληλουχία degron, ένα υπόλειμμα λυσίνης σε κοντινή απόσταση είναι κρίσιμο για την προσάρτηση του τμήματος ουβικιτίνης στο υπόστρωμα. Στο BgaA, η αλληλουχία degron συνοδεύεται από δύο εγγύς σημαντικά μειωμένη ουμπικουϊτινίωση Κ48 σε σύγκριση με την BgaA-T (Εικ. 2D). Σημειωτέον, η πιθανότητα σοβαρής διαμορφωτικής αλλαγής στην πρωτεΐνη BgaA-TΔDegron να επηρεάσει την ουμπικουϊτινοποίηση ακυρώθηκε με φασματοσκοπία in silico πρόβλεψης και κυκλικής διχρωμίας (CD) της καθαρισμένης πρωτεΐνης BgaA-TΔDegron, η οποία έδειξε παρόμοιες δομικές υπογραφές με την BgaA-T (εικ. S3, Γ και Δ). Όπως το BgaA, η διαγραφή της ακολουθίας degron (327PETPAPE333) και η μετάλλαξη λυσίνης (K315R) στο PspA οδήγησαν επίσης σε σημαντικά μειωμένο συσχετισμό K48-Ub, σε συνδυασμό με παρατεταμένη ικανότητα επιβίωσης (εικ. S4, A έως D).

Στη συνέχεια κατασκευάσαμε την επιφανειακή πρωτεΐνη SPN HysA, η οποία αρχικά στερούσε μια πρωτογενή αλληλουχία degron, με την προσθήκη μιας ακολουθίας degron σε μια δομικά διαταραγμένη περιοχή της πρωτεΐνης που περιέχει ένα υπόλειμμα λυσίνης (Εικ. 2, F και G, και εικ. S2, C δάχτυλο του ποδιού). Αυτή η τροποποίηση παρείχε αναγνώριση και ουβικουϊτινοποίηση Κ48 της προηγουμένως μη ουβικουϊτινοποιήσιμης πρωτεΐνης HysA. K{3}}Τα επίπεδα συσχέτισης Ub των στελεχών SPN που φέρουν την τροποποιημένη πρωτεΐνη HysA (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA και ΔpspA:pHysADegron-PspA) ήταν 2.2- και 3.2-φορές υψηλότερα σε σύγκριση με το είτε ΔbgaA και ΔbgaA: στελέχη pHysA ή ΔpspA, αντίστοιχα (Εικ. 2Η).

Η ενισχυμένη διακόσμηση των στελεχών ΔbgaA:pHysADegron-BgaA και ΔpspA:pHysADegron-PspA με K48-Ub στέρησε από την SPN το κέρδος επιβίωσης που παρέχεται από την απουσία degron στα ΔbgaA και ΔbgaA: pHysA ή ΔpspA (Εικ. 2I). Όλα τα κατασκευασμένα στελέχη SPN παρήγαγαν παρόμοια επίπεδα της τοξίνης πνευμολυσίνης που σχηματίζει πόρους (Ply) (Εικ. 2, B και G), η οποία αποτελεί προϋπόθεση για τη βλάβη της ενδομεμβράνης και την επακόλουθη ουβικουϊτινοποίηση (25). Αυτό ακυρώνει την πιθανή συμβολή χαμηλής ή εκτεταμένης βλάβης της μεμβράνης προάγοντας μια αξιοσημείωτη αλλαγή των επιπέδων ουμπικουϊτινοποίησης σε μεταλλαγμένα στελέχη SPN. Συλλογικά, αυτά υποδηλώνουν ότι η τεχνητή προσθήκη της αλληλουχίας degron προάγει την ανίχνευση και την εξάλειψη των παθογόνων με τη μεσολάβηση της ουβικιτίνης. Ιδιαίτερα, η αλληλουχία degron στο BgaA διατηρήθηκε σε μεγάλο βαθμό σε διαφορετικούς πνευμονιοκοκκικούς ορότυπους (εικ. S5A).

Ωστόσο, στον ορότυπο 19F, ο οποίος συχνά σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο θανάτου από βακτηριαιμική πνευμονία και σήψη (29-31), βρέθηκε ότι ο πρωτογενής απογόνιμος είναι μεταλλαγμένος (P104Q). Παρατηρήσαμε ότι η μίμηση αυτής της μετάλλαξης στο BgaA (εικ. S5B) προσέδωσε κακή ουμπικιτινίωση και βελτιωμένη ικανότητα επιβίωσης στο ΔbgaA:pBgaA-TP104Q σε σύγκριση με το ΔbgaA:pBgaA-T (εικ. S5, C και D). Αυτό υπογραμμίζει την αναγνώριση του degron ως στρατηγική που χρησιμοποιείται από τον ξενιστή για την προστασία του από σοβαρές βακτηριακές λοιμώξεις.

Το SCFFBW7 είναι μια αντιμικροβιακή λιγκάση ουβικιτίνης Ε3

Η κανονική αλληλουχία degron που υπάρχει στα επιλεγμένα υποστρώματα ουβικιτίνης προβλέπεται ότι θα αναγνωριστεί από το σύμπλεγμα λιγκάσης ουβικιτίνης SCFFBW7 E3 (24), το οποίο εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της ανάπτυξης (32). Αποτελείται από δύο διατηρημένες πρωτεΐνες, την πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με την κινάση της φάσης S (SKP1) και ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Cullin, μαζί με μια μεταβλητή πρωτεΐνη F-box που παρέχει ειδικότητα υποστρώματος (33). Για να επαληθεύσουμε τη συμμετοχή του SCFFBW7 στην ουμπικιτινίωση του SPN, αξιολογήσαμε πρώτα τη συσχέτιση του FBXW7 με το SPN. Βρήκαμε ~31 τοις εκατό του ενδοκυτταρικού SPN να σχετίζεται με το FBXW7 κατά την ανάλυση ανοσοφθορισμού (Εικ. 3Α και Σχήμα S6A). Αναμενόμενα, το FBXW7-θετικό SPN εντοπίστηκε επίσης με ουβικιτίνη K48 (εικ. S6B). Για να αποδειχθεί η συμμετοχή του SCFFBW7, η επισήμανση των βακτηρίων με αλυσίδες K48-Ub εξετάστηκε με ανοσοφθορισμό, μετά από μείωση της έκφρασης των γονιδίων Cullin1, SKP1 και FBXW7 χρησιμοποιώντας στοχευμένα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA, εικ. S7, Α έως C).

Συγκεκριμένα, η σίγαση FBXW7 επικυρώθηκε από το επίπεδο συσσώρευσης κυκλίνης Ε1 σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siFBXW7- (εικ. S7F). Παρατηρήσαμε μείωση ~45 έως 60 τοις εκατό στη συσχέτιση SPN με το K48-Ub σε κελιά knockdown Cullin1, SKP1 και FBXW7 (Εικ. 3Β), η οποία, με τη σειρά της, οδήγησε σε ~1.6- σε 1.75-πλάσια αύξηση της επιμονής του SPN εντός των κυττάρων-ξενιστών (Εικ. 3Ε). Η ειδική στόχευση του μοτίβου degron από το SCFFBW7 αποδείχθηκε από αμετάβλητες διαφορές στον εντοπισμό K{17}}Ub και την ικανότητα επιβίωσης των στελεχών ΔpspAΔbgaA και ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με siFBXW7-(εικ. S8, A) ΡΕ). Αυτά τα ευρήματα τεκμηριώθηκαν από αξιοσημείωτες μειώσεις στην ουμπικουϊτινίωση Κ48 του BgaA-T σε κύτταρα ξενιστές μετά από καταστροφή του FBXW7 (Εικ. 3C).

Περαιτέρω, in vitro, η ουβικουϊτινίωση με καθαρισμένο BgaA-T (εικ. S9, A έως D) και τα συστατικά του συμπλέγματος SCF καταδεικνύει ξεκάθαρα το SCFFBW7 ως την καλόπιστη λιγάση Ε3 που είναι υπεύθυνη για την ουβικουϊτινίωση του BgaA. Ο ανασυνδυασμένος SCFFBW7 ήταν ικανός να ουμπικιτίνει καθαρισμένο BgaA-T αλλά απέτυχε να ουμπικιτινώσει την παραλλαγή BgaA-TΔDegron που είχε διαγραφεί από degron ή την παραλλαγή υποκατάστασης λυσίνης σε αργινίνη BgaA-TK97R (Εικ. 3D). Επιπλέον, κύτταρα ξενιστές που εκφράζουν παραλλαγή FBXW7R505C, η οποία παρουσιάζει μειωμένη ικανότητα αναγνώρισης για την κυκλίνη E1 (ένα υπόστρωμα του FBXW7) (εικ. S7E), εμφάνισαν μειωμένη (~50 τοις εκατό ) ουμπικιτινίωση K48 του SPN, καθώς και ~2- φορές υψηλότερη επιβίωση του SPN σε σύγκριση με τα κύτταρα WT (Εικ. 3, F και G). Αυτά τα πειράματα αποδεικνύουν τον βασικό ρόλο της λιγάσης SCFFBW7 E3 στην ανίχνευση των παθογόνων που κατοικούν στο κυτταρόπλασμα και στη στόχευση τους σε μονοπάτια θανάτωσης.

Η μεσολαβούμενη από GSK3 -φωσφορυλίωση του μοτίβου degron ενισχύει την αντιμικροβιακή δράση του SCFFBW7

Γενικά, οι πρωτεΐνες F-box αναγνωρίζουν τα φωσφορυλιωμένα υποστρώματα για να προάγουν την ουβικουϊτινοποίησή τους (34). Επομένως, διερευνήσαμε την πιθανότητα και την επίδραση της φωσφορυλίωσης βακτηριακών υποστρωμάτων στην επικάλυψη K48-Ub του παθογόνου. Η ανάλυση βιοπληροφορικής αποκάλυψε την παρουσία ενός υποθετικού υπολείμματος θρεονίνης με δυνατότητα φωσφορυλίωσης (102VT*PKEE107) εντός της αλληλουχίας degron στο BgaA. Παρατηρήσαμε ότι το στέλεχος SPN που φιλοξενεί μια μετάλλαξη BgaA-TT103A (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (Εικ. 4Α) εμφάνισε 71 τοις εκατό μειωμένο εντοπισμό με το K48-Ub σε σύγκριση με το WT (Εικ. 4Β), αποκαλύπτοντας τη συνάφεια του φωσφορυλίωση στην αναγνώριση υποστρώματος από το σύμπλοκο SCF.

Κρίσιμα, η μειωμένη τάση της φωσφορυλίωσης BgaA στο ΔbgaA:pBgaA-TT103A ακύρωσε την ικανότητα του ξενιστή να εξαλείφει τα ενδοκυτταρικά βακτηριακά φορτία (~1.8- φορές) (Εικ. 4C). Παράλληλα με το BgaA, μια παραλλαγή PspA degron (ΔpspA:pPspAT329A) έδειξε επίσης πτώση 51 τοις εκατό στον εντοπισμό K48-Ub που συσχετίστηκε με παρατεταμένη ενδοκυτταρική επιμονή (εικ. S10, A έως C). Γενικά, τα υποστρώματα-στόχοι SCFFBW7 έχουν μια θρεονίνη/σερίνη (T/S*) δίπλα σε ένα υπόλειμμα προλίνης, το οποίο φωσφορυλιώνεται από μια κατευθυνόμενη από προλίνη κινάση πρωτεΐνης, GSK3 (35-37). Επομένως, προσπαθήσαμε να αποκαλύψουμε τη συμμετοχή του GSK3 στην ενίσχυση της αναγνώρισης υποστρώματος.

Αρχικά δείξαμε ότι το GSK3 συνδέεται στενά με το ουμπικιτινωμένο SPN, που επισημαίνεται με FBXW7 (Εικ. 4, D και E). Στη συνέχεια, πραγματοποιώντας μια in vitro δοκιμασία κινάσης, παρατηρήσαμε ότι η GSK3 θα μπορούσε να φωσφορυλιώνει το ανασυνδυασμένο BgaA-T. Ταυτόχρονα, η παραλλαγή BgaA-TT103A παρέμεινε μη φωσφορυλιωμένη (Εικ. 4F). Αυτό επικύρωσε την ταυτότητα του υπολείμματος θρεονίνης εντός της αλληλουχίας degron του BgaA-T ως στόχος για φωσφορυλίωση με τη μεσολάβηση GSK3 -. Η στοχευμένη καταστροφή του GSK3 από το siRNA (εικ. S7D) οδήγησε σε ~ 58 τοις εκατό μείωση της ουβικουιτίνης K48 του SPN (Εικ. 4G). Αυτή η μειωμένη ουβικουϊτινίωση, μετά από την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης GSK3, οδήγησε σε μειωμένη ικανότητα του ξενιστή να εκκαθαρίζει τα παθογόνα που έχουν προσβληθεί από κύτταρα (~1.5- φορές) (Εικ. 4Η) αλλά δεν έδειξε καμία επίδραση στο ΔbgaA : pBgaA-TT103A (εικ. S8, E και F). Συλλογικά, αυτό παρέχει τις πρώτες ενδείξεις μιας κινάσης ξενιστή, συγκεκριμένα της GSK3, που ρυθμίζει την ουμπικουϊτινοποίηση πρωτεϊνών βακτηριακής επιφάνειας για αποτελεσματική κάθαρση παθογόνων (Εικ. 4Ι).

Η Ubiquitination των κυτταροπλασματικών παθογόνων προσδίδει ξεχωριστές μοίρες για την εξάλειψή τους. Συγκεκριμένα, η ουβικουϊτινίωση Κ48 προάγει τη στόχευση των υποστρωμάτων προς τα πρωτεασώματα (22). Ομοίως, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν συσχέτιση του ουμπικιτινωμένου SPN με την πρωτεασωμική υπομονάδα, 7 (εικ. S11, A, και C). Επιπλέον, η πρωτεασωμική αναστολή από τη θεραπεία με MG132 βελτιώνει την επιμονή του WT SPN αλλά δεν αλλάζει την ικανότητα επιβίωσης του ΔpspAΔbgaA. Παρόμοιοι φαινότυποι παρατηρήθηκαν στην περίπτωση του μεταλλαγμένου STm και ΔrlpA (εικ. S11, B, και D).

Η επιτήρηση του παθογόνου που καθοδηγείται από το degron προστατεύει τον ξενιστή από τη σήψη

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε τον αντίκτυπο της αναγνώρισης SPN μέσω του μηχανισμού κυτταρικής ουμπικουιτίνης στα αποτελέσματα της μόλυνσης. Χρησιμοποιώντας ένα καθιερωμένο μοντέλο σήψης SPN (38), συγκρίναμε τη λοιμογόνο δύναμη του μεταλλάγματος ΔbgaA με αυτό του WT SPN καθώς και με στελέχη που συμπληρώνονται είτε με BgaA-T (ΔbgaA:pBgaA-T) είτε με μια έκδοση που δεν έχει την ακολουθία degron ( ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές (39), το στέλεχος διαγραφής bgaA έδειξε εξασθενημένη λοιμογόνο δράση, ενώ ποντίκια που είχαν μολυνθεί με WT, ΔbgaA:pBgaA-T ή ΔbgaA: BgaA-TΔDegron υπέκυψαν σε μόλυνση (Εικ. 5Α και εικ. S12, A έως D) . Ωστόσο, η ομάδα ποντικών που μολύνθηκαν με το στέλεχος SPN που δεν είχε την ακολουθία degron έδειξε υψηλότερο ποσοστό θανάτων αλλά με καθυστερημένη θνησιμότητα σε σύγκριση με την ομάδα που είχε μολυνθεί με ΔbgaA:pBgaA-T (P=0.0492, δοκιμή λογαριασμών) (Εικ. 5Α). Η σύγκριση του βακτηριακού φορτίου στο αίμα (Εικ. 5Β) και τη σπλήνα (Εικ. 5C) και η χρονική πορεία των ορατών σημείων ασθένειας σε μολυσμένα ποντίκια (Εικ. 5D) επιβεβαίωσαν την τάση προς αυξημένη λοιμογόνο δράση στο στέλεχος ΔbgaA:pBgaATΔDegron.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η σήψη SPN δημιουργείται από μια δεξαμενή βακτηρίων στον σπλήνα (38). Ενώ το πρώτο κύμα εισβολής βακτηρίων στην κυκλοφορία απομακρύνεται γρήγορα από τους έμφυτους ανοσολογικούς μηχανισμούς του ξενιστή, ένα ποσοστό του SPN επιβιώνει και πολλαπλασιάζεται μέσα στους σπληνικούς μακροφάγους, πριν επανασπείρει στο αίμα. Υποθέσαμε ότι η καθυστερημένη εμφάνιση σοβαρής νόσου σε ποντίκια που έχουν μολυνθεί με ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron μπορεί να είναι το αποτέλεσμα παρατεταμένης επιβίωσης του SPN εντός των μακροφάγων της σπλήνας, λόγω της μειωμένης ενδοκυτταρικής αναγνώρισης των βακτηρίων από τον μηχανισμό ουμπικουϊτινοποίησης του ξενιστή. Προς υποστήριξη αυτού, παρατηρήσαμε καθυστερημένη έναρξη του δεύτερου κύματος βακτηριαιμίας σε ποντίκια που είχαν μολυνθεί με στέλεχος ΔbgaA:pBgaA TΔDegron σε σύγκριση με ΔbgaA:pBgaA-T (24 ώρες έναντι 12 ωρών), μετά την πρώιμη φάση κάθαρσης (Εικ. 5Ε).

Ωστόσο, στη φάση της έκλειψης, κατά την οποία τα βακτήρια απομακρύνονται από το αίμα, ο αριθμός των βακτηρίων του σπλήνα ήταν σταθερά υψηλότερος στα ΔbgaA: ποντίκια μολυσμένα με pBgaA-TΔDegron (Εικ. 5F). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η φάση της διάδοσης του SPN εντός των σπληνικών μακροφάγων επεκτείνεται απουσία ενδοκυτταρικής αναγνώρισης της λοίμωξης μέσω του μηχανήματος ουμπικουϊτινοποίησης. Ως αποτέλεσμα, αυξημένες βακτηριακές πυκνότητες μπορεί να συσσωρευτούν στον σπλήνα (Εικ. 5F), και στη συνέχεια να σπείρουν στο αίμα σε υψηλότερους αριθμούς, γεγονός που μπορεί να ευθύνεται για την καθυστερημένη αλλά αυξημένη θνησιμότητα των μολυσμένων με ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron ποντικών. Μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η αναγνώριση και η ουβικουϊτινοποίηση του ενδοκυτταρικού SPN συμβάλλουν στον έλεγχο των παθογόνων του ξενιστή κατά τη σήψη.

For more information:1950477648nn@gmail.com