Οξείες δοσοεξαρτώμενες νευροπροστατευτικές επιδράσεις της πολυ(προ-17 οιστραδιόλης) σε ένα μοντέλο ποντικού με τραυματισμό σπονδυλικής θλάσης

Περίληψη

17 -Η οιστραδιόλη (Ε2) προσδίδει νευροπροστασία σε προκλινικά μοντέλα τραυματισμού του νωτιαίου μυελού όταν χορηγείται συστηματικά. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να εφαρμοστεί τοπικά το Ε2 στον τραυματισμένο νωτιαίο μυελό για παρατεταμένη διάρκεια χρησιμοποιώντας βιοϋλικά πολυ(προ-Ε2) φιλμ.

Καθώς οι άνθρωποι μαθαίνουν περισσότερα για τους τραυματισμούς του νωτιαίου μυελού, αρχίζουμε να συνειδητοποιούμε τον αντίκτυπο που έχει στη σωματική και ψυχική υγεία των ανθρώπων. Αν και οι τραυματισμοί του νωτιαίου μυελού μπορούν να προκαλέσουν πολλές δυσμενείς επιπτώσεις, ευτυχώς, ο αντίκτυπός τους στη μνήμη μπορεί να ελεγχθεί.

Αρχικά, πρέπει να διευκρινίσουμε τι είναι η κάκωση του νωτιαίου μυελού. Ο νωτιαίος μυελός είναι ένα νεύρο που προστατεύεται στη σπονδυλική στήλη και είναι υπεύθυνο για τη μετάδοση οδηγιών από τον εγκέφαλο σε διάφορα μέρη του σώματος. Εάν τραυματιστεί ο νωτιαίος μυελός, ορισμένα μέρη του σώματος θα χάσουν την καλή σύνδεση με τον εγκέφαλο, με αποτέλεσμα να επηρεάζεται η κίνηση των άκρων, η αίσθηση και ο αυτόνομος έλεγχος.

Οι κακώσεις του νωτιαίου μυελού μπορεί να έχουν κάποιο αντίκτυπο στη μνήμη των ανθρώπων, ειδικά στα αρχικά στάδια της αποκατάστασης ασθενών με κακώσεις του νωτιαίου μυελού. Οι τραυματισμοί του νωτιαίου μυελού μπορεί να προκαλέσουν επιδείνωση της προσοχής, της μνήμης εργασίας και της ικανότητας συναισθηματικής επεξεργασίας ενός ατόμου, γεγονός που θα επηρεάσει την ικανότητα μνήμης ενός ατόμου.

Ωστόσο, αυτές οι αρνητικές επιπτώσεις σταδιακά θα μειωθούν καθώς οι ασθενείς υποβάλλονται σε θεραπεία αποκατάστασης. Οι ασθενείς μπορούν να βελτιώσουν τη μνήμη τους συμμετέχοντας σε παιχνίδια μνήμης και άλλες γνωστικές προπονήσεις. Ταυτόχρονα, η σωματική αποκατάσταση συμβάλλει επίσης στην αποκατάσταση των κινητικών και αισθητηριακών λειτουργιών του σώματος, βελτιώνοντας έτσι τις συναισθηματικές και γνωστικές λειτουργίες.

Θα πρέπει να ενθαρρύνουμε τους ασθενείς με κακώσεις του νωτιαίου μυελού να συμμετέχουν ενεργά στη θεραπεία αποκατάστασης και να επιμείνουν στην εκπαίδευση αποκατάστασης για τη βελτίωση της σωματικής και ψυχικής υγείας. Παρακαλούμε πιστέψτε ότι με τη βοήθεια της σωστής γνώσης και της μετεγχειρητικής θεραπείας, οι ασθενείς μπορούν να ξεπεράσουν τον αντίκτυπο του τραυματισμού του νωτιαίου μυελού στη μνήμη και να συνεχίσουν να ζουν μια ενεργή ζωή. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων, που είναι πολύ σημαντικοί για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το Cistanche μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος αποκτά επαρκή διατροφή και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στα συμπληρώματα γνώσης για να βελτιώσετε τη μνήμη

Μετά από τραυματισμό του νωτιαίου μυελού σε ενήλικα αρσενικά ποντίκια, τα φιλμ πολυ(pro-E2) εμφυτεύθηκαν υποσκληρίδια και η νευροπροστασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία 7 ημέρες μετά τον τραυματισμό και την εμφύτευση. Σε αυτές τις μελέτες, τα φιλμ πολυ(pro-E2) βελτίωσαν μέτρια τη νευροπροστασία χωρίς να επηρεάσουν τη φλεγμονώδη απόκριση σε σύγκριση με τους τραυματισμένους ελέγχους.

Για να αυξηθεί η δόση Ε2 που απελευθερώνεται, κατασκευάστηκαν μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό ενσωματώνοντας μη δεσμευμένο Ε2 στις μεμβράνες πολυ(proE2).

Ωστόσο, σε σύγκριση με τους τραυματισμένους ελέγχους, τα φιλμ πολυ(pro-E2) που απελευθερώνουν βλωμό δεν ενίσχυσαν σημαντικά τη νευροπροστασία ή περιόρισαν τη φλεγμονή είτε 7 είτε 21 ημέρες μετά τον τραυματισμό. Η μελλοντική εργασία θα επικεντρωθεί στην ανάπτυξη πολυ(pro-E2) βιοϋλικών ικανών ακριβέστερα απελευθερώνοντας θεραπευτικές δόσεις Ε2.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο τραυματικός τραυματισμός του νωτιαίου μυελού (SCI) είναι μια εξουθενωτική κατάσταση που επηρεάζει πάνω από 18,000 άτομα κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες,1 ενώ ο παγκόσμιος επιπολασμός του SCI υπολογίζεται μεταξύ 236 και 1009 ανά εκατομμύριο.2

Οι ασθενείς που επηρεάζονται από ΚΝΜ παρουσιάζουν σοβαρά νευρολογικά ελλείμματα, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της αίσθησης, της διαταραχής της λειτουργίας του εντέρου/κύστης και της παράλυσης.3,4 Η πρωταρχική επίπτωση στον νωτιαίο μυελό έχει ως αποτέλεσμα νευρωνικό θάνατο στο σημείο του τραυματισμού, ο οποίος επιδεινώνεται περαιτέρω από αρκετούς καταρράκτες δευτερογενούς τραυματισμού που περιλαμβάνουν αστροκύτταρα και μακροφάγα. .

Με την πάροδο του χρόνου, αυτά τα αστροκύτταρα σχηματίζουν μια γλοιακή ουλή που εμποδίζει την επέκταση των αξόνων πέρα ​​από το άκρο της βλάβης.5 Δεν υπάρχουν μέχρι σήμερα εγκεκριμένα από την FDA νευροπροστατευτικά φάρμακα για τη θεραπεία της ΚΝΜ.

Η έρευνα πολλών δεκαετιών εστιάστηκε στη συστηματική χορήγηση βιομορίων για την πρόληψη της νευρωνικής απώλειας λόγω δευτερογενούς τραυματισμού ή/και για την προώθηση της αναγέννησης των νευραξόνων, οδηγώντας τελικά στην αποκατάσταση της χαμένης λειτουργίας.6 Ένα βιομόριο που έχει αποδείξει σημαντική υπόσχεση σε προκλινικά μοντέλα SCI είναι η γυναίκα ορμόνη φύλου, 17 -οιστραδιόλη(Ε2).

Η χορήγηση Ε2 είναι ευρέως ευεργετική για το κεντρικό νευρικό σύστημα μειώνοντας τη φλεγμονή, 7–9 ανακουφίζοντας την αντιδραστικότητα των νευρογλοιακών κυττάρων,10 περιορίζοντας το οξειδωτικό στρες, 11–14 και μετριάζοντας τον διεγερτοτοξικό νευρωνικό θάνατο που προκαλείται από γλουταμικό. 16,17 Είναι ενδιαφέρον ότι η συστηματική χορήγηση πολλαπλών δόσεων Ε2 προκαλεί λειτουργική αποκατάσταση πιο γρήγορα18,19 σε σύγκριση με ζώα που λαμβάνουν μόνο μία δόση.17

Δεδομένου ότι το E2 προάγει τη λειτουργική αποκατάσταση πιο αποτελεσματικά μέσω σχημάτων πολλαπλών δόσεων, ο στόχος μας ήταν να απελευθερώσουμε σταθερά το E2 τοπικά στο σημείο του τραυματισμού (για να αποτρέψουμε τυχόν επιπτώσεις εκτός στόχου) για να παρακάμψουμε προβλήματα που προκύπτουν από πολλαπλές δόσεις/συστημικές ενέσεις του E2.

Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική βιοϋλικού πολυ(προφαρμάκου) στην οποία το φυσικό φάρμακο (Ε2) αρχικά ενεργοποιήθηκε με αντιδραστικές αλλυλ ομάδες και στη συνέχεια πολυμερίστηκε μέσω προσθήκης ρίζας φωτοεκκινημένης θειόλης-ενίου με μια εύκαμπτη ολιγο-(αιθυλενογλυκόλη) διθειόλη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως .20 Λάβαμε αλυσίδες πολυμερούς υψηλού μοριακού βάρους, οι οποίες αποτελούνται από ένα προφάρμακο Ε2 ως επαναλαμβανόμενη μονάδα εντός του πολυμερούς.

Κατά την υδρολυτική αποικοδόμηση, το πολυμερές απελευθερώνει βαθμιαία Ε2 στα περιβάλλοντα μέσα. Τα μόνα άλλα υποπροϊόντα από την απελευθέρωση είναι το διοξείδιο του άνθρακα και η ολιγο(αιθυλενογλυκόλη) (oEG) (Εικόνα 1). Οι πολυ(pro-E2) αλυσίδες που κατασκευάζονται σε μεμβράνες ή μικροΐνες μπορούν να απελευθερώσουν Ε2 σε νανομοριακές συγκεντρώσεις in vitro σε χρονική κλίμακα από μήνες έως χρόνια .20

Το Ε2 που απελευθερώνεται από αυτά τα ικριώματα πολυ(προ-Ε2) είναι βιοδραστικό και αυτά τα ικριώματα προάγουν τον νευροτροφισμό και την νευροπροστασία in vitro προστατεύοντας τους νευρώνες από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Εδώ, εφαρμόσαμε τις πολυ(pro-E2) μεμβράνες σε ένα μοντέλο μυϊκής θλάσης SCI, αμέσως μετά τον τραυματισμό, και αξιολογήσαμε την νευροπροστατευτική τους ικανότητα in vivo.

Ο αρχικός μας σχεδιασμός πολυ(pro-E2) φιλμ αύξησε τη νευροπροστασία οξεία (7 ημέρες μετά τον τραυματισμό) στο σημείο του τραυματισμού χωρίς να επηρεάσει τη φλεγμονώδη απόκριση. Εφόσον τα φιλμ πολυ(pro-E2) απελευθερώνουν νανογραμμάρια Ε2 ανά ημέρα, αναπτύξαμε μια άλλη στρατηγική απελευθέρωσης όπου το unboundE2 ενσωματώθηκε στη μήτρα πολυ(pro-E2). Υποθέσαμε ότι η απελευθέρωση βλωμού του μη δεσμευμένου Ε2 μπορεί να παρέχει πρόσθετα νευροπροστατευτικά οφέλη.

Τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) απελευθερώνουν Ε2 με τρόπο έκρηξης που ακολουθείται από παρατεταμένη απελευθέρωση Ε2 από το πολυμερές σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Η ανοσοϊστολογική χρώση αξιολόγησε τους νευρώνες, τα αστροκύτταρα και τα μακροφάγα/μικρογλοία που υπάρχουν στο σημείο του τραυματισμού οξεία (7 ημέρες μετά τον τραυματισμό) και χρόνια (21 ημέρες μετά τον τραυματισμό) μετά από SCI παρουσία αυτών των φιλμ πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Τα φιλμ πολυ(pro-E2) απελευθερώνουν Ε2 σε νανομοριακές συγκεντρώσεις, προάγουν την ανάπτυξη νευρώνων από το γάγγλιο της ραχιαία ρίζας και προστατεύουν τους νευρώνες από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου in vitro.20 Η μελέτη που παρουσιάζεται εδώ επιδιώκει να προσδιορίσει την ικανότητα του πολυ(pro-E2) μεμβράνες για την παροχή νευροπροστασίας in vivo χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μυϊκής θλάσης SCI.

Μέτριας βαρύτητας SCI προκλήθηκε σε ενήλικα αρσενικά ποντίκια και αμέσως μετά τον τραυματισμό, τοποθετήθηκαν μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) ακριβώς πάνω από τον τραυματισμό (Εικόνα 2Α). Για να εξασφαλιστεί ότι οι μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) παρέμειναν στη θέση τους μετά την εμφύτευση, μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) φορτωμένες με ροδαμίνη Β εμφυτεύτηκαν στον νωτιαίο μυελό τραυματισμένων ζώων. Επτά ημέρες μετά την εμφύτευση, οι νωτιαίοι μυελοί συλλέχθηκαν και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (Εικόνα 2Β). Σε όλα τα ζώα, οι εμφυτευμένες μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) φορτισμένες με ροδαμίνη Β παρέμειναν σε θέση επικυρώνοντας το πρωτόκολλο εμφύτευσης.

Για να ελεγχθεί η ικανότητα των μεμβρανών πολυ(προ-Ε2) να παρέχουν νευροπροστασία και να ανακουφίζουν τη φλεγμονή, εμφυτεύθηκαν μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) (χωρίς ροδαμίνη Β) μετά από τραυματισμό σπονδυλικής θλάσης και οι νωτιαίοι μυελοί συλλέχθηκαν 7 ημέρες μετά τον τραυματισμό και την εμφύτευση. Διαμήκεις τομές (πάχους 10 μm) κόπηκαν, επικεντρώθηκαν γύρω από το επίκεντρο του τραυματισμού και ανοσοεπισημάνθηκαν για να οπτικοποιηθούν οι νευρώνες και τα μακροφάγα στο νωτιαίο μυελό (Εικόνα 3).

Οι τομές επισημάνθηκαν για NeuN για την αξιολόγηση της νευρωνικής παρουσίας και η ποσοτική ανάλυση της χρώσης αποκάλυψε ότι τα φιλμ πολυ(pro-E2) αύξησαν σημαντικά τη θετική περιοχή NeuN γύρω από το επίκεντρο του τραυματισμού σε σύγκριση με τους τραυματισμένους ελέγχους που δεν έλαβαν εμφυτεύματα φιλμ (Εικόνα 3Α, p=0.0002). Επιπρόσθετη χρώση για άξονες χρησιμοποιώντας NFH (βαριά αλυσίδα νευροϊνήματος) αποκάλυψε επίσης την οξεία νευροπροστατευτική επίδραση των εμφυτευμένων πολυ(προ-Ε2) μεμβρανών (Εικόνα 3Β, p=0.0017).

Παρατηρήσαμε ότι αυτή η αλλαγή στη νευροπροστασία δεν οφειλόταν σε αλλαγή στην απόπτωση (κασπάση 3) στο σημείο του τραυματισμού (Εικόνα S1, p=0.9966). Η χρώση για ενεργοποιημένα μακροφάγα (CD68) επίσης δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ζώων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πολυ(προ-Ε2) και των ζώων που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Εικόνα 3C, p= 0.7207).

Συνολικά, τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) αυξάνουν μέτρια τη νευροπροστασία οξεία χωρίς να αλλάζουν τη φλεγμονώδη απόκριση. Τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) αύξησαν την πυκνότητα των νευρώνων κατά σχεδόν 20%, αλλά τα φιλμ δεν είχαν εμφανή αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα (με βάση τον ποσοτικό προσδιορισμό του την περιοχή που καταλαμβάνουν τα ενεργοποιημένα μακροφάγα) (Εικόνα 3).

Αυτή η έλλειψη μείωσης της φλεγμονής μπορεί να υποδεικνύει ότι οι αντιφλεγμονώδεις και νευροπροστατευτικές δόσεις του Ε2 είναι διαφορετικές και ότι και οι δύο δεν επιτεύχθηκε με την τρέχουσα σύνθεση φιλμ.20 Υποθέσαμε ότι η οξεία αύξηση της απελευθέρωσης Ε2 από τις μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) μπορεί να μειώσει τη φλεγμονή και επιτρέπουν πιο ισχυρή νευροπροστατευτική απόκριση.

Για την οξεία αύξηση της δόσης του Ε2 που απελευθερώνεται, τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) τροποποιήθηκαν έτσι ώστε η απελευθέρωση βλωμού Ε2 να πραγματοποιηθεί αμέσως μετά την εμφύτευση. Μετά την απελευθέρωση βλωμού του Ε2, θα ακολουθούσε η αποικοδόμηση του πολυμερούς για την απελευθέρωση Ε2 στην ίδια συγκέντρωση όπως πριν. Το πείραμα που περιγράφηκε παραπάνω επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας αυτά τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό και η νευροπροστασία και η φλεγμονή αξιολογήθηκαν 7 ημέρες μετά τον τραυματισμό (dpi).

Ωστόσο, αντί για ένα πρόσθετο όφελος, οι μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό δεν αύξησαν σημαντικά τη θετική περιοχή NeuN σε σύγκριση με τους τραυματισμένους, μη θεραπευμένους μάρτυρες (Εικόνα 4Α, p=0.6770). Τα φιλμ πολυ(proE2) που απελευθερώνουν βλωμό αύξησαν την έκφραση του CD68, αλλά η αύξηση δεν ήταν στατιστικά διαφορετική (ρ= 0.1780).

Αυξανόμενες τάσεις στη νευρογλοιακή αντιδραστικότητα και τη μικρογλοιακή φλεγμονή παρατηρήθηκαν επίσης παρουσία των φιλμ πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό λόγω της αύξησης της έκφρασης GFAP (αστροκύτταρα) και Iba1 (μικρογλοία). Ωστόσο, αυτές οι αυξήσεις δεν ήταν στατιστικά μεγαλύτερες από ό,τι παρατηρήθηκε στους τραυματισμένους, χωρίς θεραπεία μάρτυρες (p=0.3233 και p=0.3053, αντίστοιχα). Συνολικά, τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό δεν ενίσχυσαν τη νευροπροστασία και η αντιδραστικότητα των αστροκυττάρων και η παρουσία μακροφάγων/μικρογλοίας δεν μειώθηκαν όπως είχε αρχικά υποτεθεί.

Δεδομένου ότι δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ τραυματισμένων, μη υποβληθέντων σε θεραπεία ζώων και τραυματισμένων ζώων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φιλμ πολυ(proE2) που απελευθερώνουν βλωμό στο οξύ χρονικό σημείο των 7 dpi, επιλέχθηκε ένα χρόνιο χρονικό σημείο για περαιτέρω διερεύνηση αφού οι μεμβράνες πολυ(pro-E2) μπορεί να απελευθερώσει το Ε2 μακροπρόθεσμα.20 Το πείραμα που περιγράφηκε παραπάνω επαναλήφθηκε με τις μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) απελευθέρωσης βλωμού, αλλά τα ζώα αξιολογήθηκαν χρόνια στα 21 dpi (Εικόνα 5).

Οι νωτιαίου μυελού επισημάνθηκαν για τους ίδιους τύπους κυττάρων που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Μετά την ανάλυση, υπήρξε τάση προς αύξηση του κλάσματος περιοχής του NeuN στα ζώα που εμφυτεύονται με πολυ(προ-Ε2) μεμβράνη απελευθέρωσης βλωμού σε σύγκριση με τα τραυματισμένα, χωρίς θεραπεία ζώα (Εικόνα 5Α, p=0.0897) .Επιπλέον, παρατηρήθηκαν τάσεις όπου οι μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) απελευθέρωσης βλωμού μείωσαν το κλάσμα εμβαδού της έκφρασης CD68 και GFAP σε σύγκριση με δεδομένα από μη θεραπευμένα, τραυματισμένα ζώα ελέγχου (Εικόνα 5B, C, p=0).0859 και p=0.2780).

Ωστόσο, καμία από τις τάσεις δεν ήταν στατιστικά διαφορετική. Από την άλλη πλευρά, τομές ιστού με επισήμανση Iba1 από ζώα που έλαβαν θεραπεία με πολυ(pro-E2) απελευθέρωσης βλωμού εμφάνισαν αυξημένη έκφραση σε σύγκριση με τα δεδομένα από μη υποβληθέντα σε θεραπεία, τραυματισμένους μάρτυρες (p < 0.0001). Η προηγούμενη εργασία μας δείχνει ότι το poly(pro -Ε2) οι μεμβράνες που χυτεύονται σε καλυπτρίδες 15 mm × 15 mm απελευθερώνουν περίπου 266 ng Ε2 ανά ημέρα,20 που μεταφράζεται σε περίπου 2 ng Ε2 ανά ημέρα από τις μεμβράνες (1 mm × 1,8 mm) που χρησιμοποιούνται εδώ. Οι μεμβράνες πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνουν βλωμό απελευθερώνουν επιπλέον 40 ug μη δεσμευμένου Ε2 οξεία μετά την εμφύτευση.

Έρευνα που επικεντρώνεται στη χρήση του Ε2 σε μοντέλα SCI τρωκτικών δείχνει ότι η χαμηλή δόση οιστρογόνου (10 ug/kg) που χορηγείται ενδοφλεβίως μειώνει την αντιδραστική γλοίωση και παρέχει νευροπροστασία ενώ εξασθενεί φλεγμονώδη συμβάντα, αναστέλλει την απόπτωση και αυξάνει την αγγειογένεση.21 Αντίθετα, οι υψηλές συστηματικές δόσεις έχουν ανεπιθύμητες ενέργειες που περιλαμβάνουν αυξημένα ποσοστά εν τω βάθει φλεβίτιδας και καρκίνου22,23 και την ανάπτυξη γυναικείων φυσικών χαρακτηριστικών στους άνδρες. Αυτό είναι αξιοσημείωτο δεδομένου ότι το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας Ε2 έχει επικεντρωθεί στη χορήγηση της Ε2 συστηματικά είτε ενδοφλεβίως είτε ενδοπεριτοναϊκά.

Λαμβάνοντας υπόψη τις ανησυχίες για την ασφάλεια με τη χρήση υψηλών δόσεων Ε2 συστηματικά, είναι σημαντικό να βελτιστοποιηθεί η συγκέντρωση Ε2 για τοπική παράδοση στον τραυματισμένο νωτιαίο μυελό για την αποφυγή παρενεργειών. Μέχρι σήμερα, μόνο μία μελέτη έχει παραδώσει E2 από βιοϋλικό χρησιμοποιώντας νανοσωματίδια για την εστιακή παράδοση E2 (2,5 ug ή 25 ug). Η απελευθέρωση από νανοσωματίδια μείωσε ταχέως τη φλεγμονή οξεία σε ένα μοντέλο μώλωπας αρουραίου. πάρα πολύ E2 (40 ug) απελευθερώνεται οξεία ενώ πολύ λίγο (2 ng) απελευθερώνεται χρόνια.

Αν και αυτό που παρατηρούμε από αυτά τα δεδομένα είναι μέτριες τάσεις, αυτή η μελέτη υπογραμμίζει τη σημασία της δόσης Ε2 για την προώθηση της νευροπροστασίας in vivo. Η μείωση της αρχικής δόσης του Ε2 και η προσαρμογή της κινητικής αποδόμησης του βιοϋλικού πολυ(προ-Ε2) θα μπορούσαν να βοηθήσουν στην άμβλυνση αυτού του προβλήματος και ενδεχομένως να παρέχουν καλύτερα νευροπροστατευτικά αποτελέσματα.

Αν και αυτή η μελέτη διεξήχθη αποκλειστικά σε άντρες, είναι σημαντικό να αξιολογηθεί η επίδραση αυτών των φιλμ πολυ(pro-E2) και στα δύο φύλα για να δημιουργηθεί μια έγκυρη δυνατότητα μετάφρασης για αυτό το βιοϋλικό. Η έρευνα έχει δείξει ότι μετά από ΚΝΜ, τα αυξημένα επίπεδα οιστρογόνων στις γυναίκες μπορεί να είναι εν μέρει υπεύθυνα για τα βελτιωμένα λειτουργικά τους αποτελέσματα σε σύγκριση με τα αρσενικά. απελευθερώστε την κινητική κατά συνέπεια για να διασφαλιστεί ότι η χορηγούμενη δόση παραμένει η ίδια για τους άνδρες και τις γυναίκες.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Κατασκευή Ταινιών Poly(pro-E2).

Το πολυ(προ-Ε2) πολυμερές Ρ1 συντέθηκε και χαρακτηρίστηκε όπως περιγράφηκε λεπτομερώς προηγουμένως.20 Το πολυμερές έχει μέσο βάρος μοριακό βάρος MW ~ 80 kDa και διασπορά Đ ~ 3, σύμφωνα με χρωματογραφία διείσδυσης γέλης (GPC). Τα φιλμ πολυ(pro-E2) κατασκευάστηκαν διαλύοντας το πολυμερές σε χλωροφόρμιο (5 wt %/wt, πολυμερές/χλωροφόρμιο), ρίχνοντας το διάλυμα σε γυάλινες καλυπτρίδες 15 mm × 15 mm (100 μL διάλυμα ανά καλυπτρίδα) και αφήνοντάς τις να στεγνώσει όλη τη νύχτα υπό κενό (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Για τη δημιουργία μεμβρανών πολυ(προ-Ε2) με μη δεσμευμένο Ε2, οι μεμβράνες κατασκευάστηκαν προσθέτοντας μη δεσμευμένο Ε2 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) στο διάλυμα πολυμερούς (0.0625 wt %/wt· E2/χλωροφόρμιο) πριν από τη χύτευση το διάλυμα πάνω στις καλυπτρίδες. Πριν από την εμφύτευση, οι καλυπτρίδες με φιλμ αποστειρώθηκαν με χρήση υπεριώδους (UV) ακτινοβολίας για 30 λεπτά και οι μεμβράνες ξεφλουδίστηκαν από τις καλυπτρίδες σε ένα αποστειρωμένο ερμάριο βιοασφάλειας. Τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) στη συνέχεια κόπηκαν σε κομμάτια 1 mm× 1,8 mm, κατάλληλα για εμφύτευση σε ενήλικο ποντίκι όπως περιγράφεται παρακάτω.

Μώλωπες Κάκωση νωτιαίου μυελού και εμφύτευση ταινιών Poly(pro-E2).

Όλες οι διαδικασίες χειρουργικής και μετεγχειρητικής φροντίδας εγκρίθηκαν από το Rensselaer PolytechnicInstitute και τις Επιτροπές Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης του Πανεπιστημίου του Οχάιο (IACUC). Για να προκληθεί SCI μώλωπες, ενήλικα αρσενικά ποντίκια C57BL/6 (10- έως 12-εβδομάδων), που αγοράστηκαν από το Jackson Laboratory (αριθμός αποθέματος 000664; Bar Harbor, ME), αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κεταμίνης (80 mg/kg) και ξυλαζίνης (10 mg/kg). Οι πλάτες των ζώων ξυρίστηκαν και παρασκευάστηκαν ασηπτικά χρησιμοποιώντας 70% αιθανόλη και betadine.

Μετά την τοποθέτηση του ζώου σε ένα θερμαντικό επίθεμα διατηρημένο στους 37 βαθμούς, το δέρμα και οι μυϊκές στοιβάδες ανοίχτηκαν για να εκτεθεί η σπονδυλική στήλη και πραγματοποιήθηκε ραχιαία λαμινεκτομή στον ένατο (Τ9) σπόνδυλο για να εκτεθεί ο νωτιαίος μυελός. Μια μέτρια (75 kdyn) θλάση SCI προκλήθηκε σε αυτό το επίπεδο χρησιμοποιώντας κρουστικό εκκρεμές Infinite Horizons (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Αφού επιτεύχθηκε η αιμόσταση, η μήνιγγα ανοίχτηκε (Εικόνα 2) και η μεμβράνη πολυ(προ-Ε2) ή μια μεμβράνη πολυ(προ-Ε2) που απελευθερώνει βλωμό (1 mm × 1,8 mm) τοποθετήθηκε κάτω από τη σκληρή μήνιγγα και πάνω από το νωτιαίο μυελό, καλύπτοντας το σημείο του τραυματισμού. Στα ζώα ελέγχου, η μήνιγγα ανοίχτηκε αλλά τα φιλμ πολυ(προ-Ε2) δεν εμφυτεύτηκαν. Τα μυϊκά στρώματα έκλεισαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα ράμματα και το δέρμα κλείστηκε χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα μεταλλικά κλιπ πληγής.

Τα ποντίκια έλαβαν 2 mL αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού που εγχύθηκε υποδορίως και επέστρεψαν στα κλουβιά τους και τοποθετήθηκαν σε θερμαντήρα αντικειμένων στους 37 βαθμούς όλη τη νύχτα. Για να εξασφαλιστεί η σωστή ενυδάτωση και να αποφευχθούν λοιμώξεις, στα ποντίκια χορηγήθηκε υποδόρια ένεση 1–2 mL αποστειρωμένου αλατούχου ορού και Gentocin (1 mg/kg) καθημερινά για τις πρώτες 5 ημέρες μετά τον τραυματισμό (dpi). Οι κύστεις εκφράστηκαν χειροκίνητα δύο φορές την ημέρα κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν κάτω από συμβατικές συνθήκες σε κύκλο 12-ωρών φωτός-σκότους με ad libitum πρόσβαση σε τροφή και νερό.

Συγκομιδή Ιστών.

Στα καθορισμένα τερματικά χρονικά σημεία των 7 ή 21 dpi, στα ποντίκια εγχύθηκε μια θανατηφόρα δόση κεταμίνης/ξυλαζίνης (1,5× χειρουργική δόση) και εγχύθηκε διακαρδιακά με 0.1 αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS, pH 7,4) ακολουθούμενο από 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA, pH 7,4). Οι νωτιαίοι μυελοί αφαιρέθηκαν, σταθεροποιήθηκαν για 2 ώρες σε 4% PFA και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0.2Μ (PB, pH 7,4) όλη τη νύχτα.

Οι νωτιαίοι μυελοί κρυοπροστατεύτηκαν σε 30% σακχαρόζη για 48 ώρες στους 4 βαθμούς και στη συνέχεια αποκλείστηκαν σε τμήματα 10 mm με κέντρο γύρω από το σημείο του τραυματισμού με τις ραχιαία στήλες στραμμένες προς τα επάνω. Αυτά τα τμήματα ενσωματώθηκαν σε ένα μέσο βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) και καταψύχθηκαν γρήγορα σε ξηρό πάγο. Όλοι οι νωτιαίοι μυελοί τεμαχίστηκαν στα 10 μm σε κρυοστάτη Microm HM505E, τοποθετημένο σε διαφάνειες ColorFrost Plus Scientific, Ther Waltham, MA), και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε στους -20 βαθμούς μέχρι να χρησιμοποιηθεί για ανοσοχρώση.

Ανοσοϊστοχημεία και ποσοτικοποίηση.

Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αποψύχθηκαν σε θερμαντήρα αντικειμένων για 1 ώρα και στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές σε 0.1 MPBS. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης σβήστηκε με επώαση των πλακών σε 6% Η2Ο2 αραιωμένο σε μεθανόλη για 15 λεπτά σε ΘΔ. Μετά από πλύση 3 φορές σε 0.1 M PBS, τα τμήματα επωάστηκαν με 4% BSA και 0.1% Triton X-100 σε 0}.1 M PBS για 1 h ακολουθούμενη από ολονύκτια επώαση των πρωτογενών αντισωμάτων στους 4 βαθμούς ή RT (Πίνακας 1).

Οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με κατάλληλα βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) σε RT για 1 ώρα. Για να οπτικοποιηθεί το δεσμευμένο αντίσωμα, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) για 1 ώρα και αναπτύχθηκαν με ImmPACT3,3'-διαμινοβενζιδίνη (DAB) ή υπόστρωμα Vector SG (Vector Laboratories) για 10 λεπτά.

Οι τομές αυτές αφυδατώθηκαν μέσω διαδοχικών επωάσεων 2 × 2 λεπτών σε 70% και 90% αιθανόλη, 2 × 3 λεπτά σε 100% αιθανόλη, ακολουθούμενη από 3 × 3 λεπτά σε Histoclear και τελικά καλύφθηκαν με Permount (ThermoFisher Scientific). Έξι τομές ανά ζώο, σε απόσταση 100 μm από τον τραυματισμένο νωτιαίο μυελό, χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτική ανάλυση.

Οι ανοσοεπισημασμένες τομές απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο απεικόνισης Axioplan 2 εξοπλισμένο με κάμερα AxioCamdigital και λογισμικό AxioVision έκδοσης 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Γερμανία) και αντικειμενικό φακό 5×.

Ο αριθμός των θετικών εικονοστοιχείων σε κάθε ένα από τα τμήματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας MIPAR (MIPAR, Worthington, OH) για τον υπολογισμό του ποσοστού ποσοστού θετικού κλάσματος περιοχής ανά τομή. Η μέση επί τοις εκατό θετική περιοχή των έξι τμημάτων ανά ζώο υπολογίστηκε για καθεμία από τις κηλίδες και αναφέρθηκε.

Στατιστική ανάλυση.

Όλα τα δεδομένα αναφέρονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 9 Statistical Software (GraphPad Software, San Diego, CA). Σε όλα τα πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν 5-6 ζώα ανά ομάδα, προερχόμενα από τουλάχιστον δύο διαφορετικές παρτίδες ζώων. Για να ελεγχθούν οι διαφορές μεταξύ των ομάδων φιλμ μάρτυρα και πολυ(pro-E2), χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή t-test Student (Εικόνες 3, 4 και 5). Η σημασία καθορίστηκε στο p Μικρότερο ή ίσο με 0.05.

Συμπληρωματικό Υλικό

Ανατρέξτε στην έκδοση Web στο PubMed Central για συμπληρωματικό υλικό.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Οι συγγραφείς ευχαριστούν τη Wenmin Lai για τη βοήθειά της στις χειρουργικές επεμβάσεις σε ποντίκια.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία έλαβε υποστήριξη από την υποτροφία του Ιδρύματος Craig H. Neilsen (Grant 468116) και την υποτροφία του Paralyzed Veteransof America Research Foundation (Grant 3171) προς το MKG και από το NIH R01 (Grant NS092754) και την Πολιτεία της Νέας Υόρκης Spinal Cord Injury Reviews5G2G Grant. Όλες οι εργασίες στα ζώα πραγματοποιήθηκαν με τη βοήθεια του Τμήματος Νευροεπιστήμης του Πανεπιστημίου του Οχάιο του Κράτους που υποστηρίζεται από το NINDS Grant P30NS104177.

ΑΝΑΦΟΡΕΣ

(1). Εθνικό Στατιστικό Κέντρο Κακώσεων Νωτιαίου Μυελού. (2020) Στοιχεία και αριθμοί για τον τραυματισμό του νωτιαίου μυελού στο aGlance, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Μπέρμιγχαμ, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J, and Brown D (2011) Ένας παγκόσμιος χάρτης για την επιδημιολογία τραυματισμού του νωτιαίου μυελού: Προς ένα ζωντανό αποθετήριο δεδομένων για την πρόληψη τραυματισμών. Νωτιαίος μυελός. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Κάκωση νωτιαίου μυελού - Παρελθόν, Παρόν και Μέλλον. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ, and Wilson DA (2010) Statewide Investigation of Medically Attended Adverse Health Conditions of Persons with Spinal Injury. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J, and Miller JH (2004) Αναγέννηση πέρα ​​από την Γοιακή Ουλή. Nat. Σεβ. Neurosci. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, and Banik NL (2013) Spinal Cord Injury: A Review of Current Therapy, Future Treatments and Basic Science Frontiers.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, andBeyer C (2018) Τα οιστρογόνα εξασθενούν την έκφραση και την ενεργοποίηση τοπικής φλεγμονής μετά από τραυματισμό του νωτιαίου μυελού. ΜοΙ. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG και Yune TY (2018) Τα οιστρογόνα ανακουφίζουν τον νευροπαθητικό πόνο που προκαλείται μετά από τραυματισμό του νωτιαίου μυελού αναστέλλοντας την ενεργοποίηση της μικρογλοίας και των αστροκυττάρων. Biochim. Biophys. Acta, ΜοΙ. Βάση Δισ. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, and Banik N (2015) Τα νανοσωματίδια οιστρογόνου σε τραυματισμό του νωτιαίου μυελού αρουραίου προκαλούν γρήγορες αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις στο πλάσμα, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό και τον ιστό. J. Neurotrauma 32 (18), 1413-1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK, and Banik NL (2010) Η θεραπεία με οιστρογόνο μετά τον τραυματισμό του χρόνιου τραυματισμού του νωτιαίου μυελού βελτιώνει την κινητική λειτουργία σε αρουραίους. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H, and Akaike A (2001) Nongenomic Antiapoptotic Signal Transduction by Estrogen in Cultured Cortical Neurons. J. Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK, and Banik NL (2003) Το οιστρογόνο ως νευροπροστατευτικός παράγοντας στη θεραπεία τραυματισμού του νωτιαίου μυελού. Αννα. NY Acad. Sci. 993.125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com