Ένα νέο φλεγμονώδες δενδριτικό κύτταρο που είναι άφθονο και γειτονικό με τα Τ κύτταρα στους νεφρούς των ασθενών με νεφρίτιδα λύκου

edmund.chen@wecistanche.com

Οι μηχανισμοί που προάγουν τον τοπικό φλεγμονώδη τραυματισμό κατά τη διάρκεια της έξαρσης της νεφρίτιδας του λύκου (LN) είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Η κατανόηση των βασικών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος που οδηγούν την ενδονεφρική φλεγμονή θα προωθήσει τις γνώσεις μας για την παθογένεση της νόσου και θα ενημερώσει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων για τη διαχείριση του LN. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμενεφρό βιοψίες από ασθενείς με πολλαπλασιαστικό LN και ταυτοποίησαν έναν νέο πληθυσμό φλεγμονωδών δενδριτικών κυττάρων (infDC) που εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στο LNνεφρό, αλλά ελάχιστα υπάρχει στον υγιή άνθρωπονεφρά.Κατά τη διάρκεια μιας αγνωστικής αξιολόγησης της έκφρασης του ανοσοποιητικού μεταγραφήματος στονεφράτων ασθενών με πολλαπλασιαστικό LN, το πιο άφθονα υπερεκφρασμένο μεταγραφή από απομονωμένα σπειράματα ήταν το FCER1G, το οποίο κωδικοποιεί την αλυσίδα γάμμα του υποδοχέα Fc (FcR). Για τον εντοπισμό των τύπων κυττάρων που εκφράζουν FcR που διεισδύουν στονεφρόστο LN, έγιναν μελέτες γιανεφρόβιοψίες από ασθενείς με ενεργό LN χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (IF). Αυτό έδειξε ότι το FcR είναι άφθονα παρόν στην περισπειραματική (PG) περιοχή τουνεφρόκαι σε μικρότερο βαθμό στο διάμεσο σωληνάριο (TI). Περαιτέρω έρευνα των επιφανειακών δεικτών αυτών των κυττάρων έδειξε ότι ήταν FcR plus , MHC II plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 και CD11bV, υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα ήταν infDC. Η ποσοτικοποίηση των infDC έδειξε ένα μέσο 10-πλάσιο υψηλότερο επίπεδο infDC στο LNνεφρόσε σύγκριση με τους υγιείςνεφρά. Είναι σημαντικό ότι το IF αναγνώρισε ότι τα CD3 συν Τ κύτταρα είναι γειτονικά με αυτά τα infDC στον χώρο PG του LNνεφρό,ενώ και οι δύο τύποι κυττάρων είναι ελάχιστα παρόντες στους υγιείςνεφρό.Έτσι, εντοπίσαμε ένα μη περιγραφόμενο προηγουμένως DC στον λύκονεφράπου μπορεί να αλληλεπιδράσουν με τα ενδονεφρικά Τ κύτταρα και να παίζουν ρόλο στην παθογένεση τουνεφρική βλάβηκατά τη διάρκεια της λάμψης LN.

Λέξεις-κλειδιά:φλεγμονώδη δενδριτικά κύτταρα, νεφρίτιδα λύκου, νεφρός, αυτοάνοση, προσαρμοστική ανοσοαπόκριση, Τ κύτταρα, ΣΕΛ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 

Η νεφρίτιδα του λύκου (LN) είναι μια σοβαρή επιπλοκή του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (ΣΕΛ) που σχετίζεται με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα. Έως και το 30 τοις εκατό των ασθενών με LN προχωρούν στο τελικό στάδιοΝεφρική Νόσος(ΕΣΚΔ) (1). Δεν υπάρχουν συγκεκριμένες θεραπείες εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών (FDA) για τη θεραπεία του LN και οι τρέχουσες θεραπείες παράγουν χαμηλότερα ποσοστά απόκρισης με σημαντική κυτταροτοξικότητα (2). Εμείς και άλλοι ερευνητές έχουμε εξερευνήσει τη μοριακή παθολογία τουνεφρόκατά τη διάρκεια του ενεργού LN για την καλύτερη κατανόηση της παθογένειας τουνεφρική βλάβηστο LN και μονοπάτια που μπορεί να στοχεύουν συγκεκριμένα στη θεραπεία του LN.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Κατά τη διάρκεια μιας αγνωστικής αξιολόγησης της έκφρασης μεταγραφής σε μικροδιατομή με λέιζερνεφρόιστού από κλινικές βιοψίες LN, βρήκαμε ότι το πιο άφθονα υπερεκφρασμένο μεταγραφή στο σπειραματικό διαμέρισμα ήταν το FCER1G, που κωδικοποιεί την αλυσίδα γάμμα του υποδοχέα Fc (FcR). Θεωρήθηκε ότι αυτό το αντίγραφο αντανακλούσε τα ανοσοκύτταρα που διεισδύουν στονεφρόκατά τη διάρκεια του ενεργού LN, και αυτή η εργασία πραγματοποιήθηκε για τον εντοπισμό των τύπων κυττάρων που αντιπροσωπεύονται από το υπερεκφρασμένο FcR. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν μεταγραφικά ευρήματα για να καθοδηγήσουν μελέτες ομοεστιακού ανοσοφθορισμού (IF) για να χαρακτηρίσουν τα κύρια διεισδυτικά ανοσοκύτταρα που υπάρχουν στονεφρόκατά τη διάρκεια της λάμψης LN. Προσδιορίσαμε έναν μοναδικό πληθυσμό FcR - που εκφράζει φλεγμονώδη δενδριτικά κύτταρα (infDC) που βρίσκεται στον περισπειραματικό (PG) χώρο και δίπλα στα CD3 συν Τ κύτταρα, υποδηλώνοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ πληθυσμών infDC και Τ κυττάρων.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Πειραματικό σχέδιοΟ σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να πραγματοποιήσει μεταγραφική ανάλυση και IF onνεφρόβιοψίες που έγιναν στο φλας LN για να εντοπιστούν τα κύρια διεισδυτικά ανοσοκύτταρα που υπάρχουν στονεφρότην ώρα της έκρηξης του LN. Πραγματοποιήθηκε μεταγραφική ανάλυση σενεφρόβιοψίες που ελήφθησαν κατά την έκρηξη LN από 58 ασθενείς με πολλαπλασιαστικό (Τάξη III/IV ± V) LN μεταξύ 2007 και 2013. Οι αρχειακές βιοψίες χρησιμοποιήθηκαν μετά την ολοκλήρωση των κλινικών δοκιμών. Πραγματοποιήθηκε μικροτομή σύλληψης με λέιζερ (LCM) και απομονώθηκαν χωριστά σπειράματα και σωληναριστήριο (TI). Ζωντανός δότης προεμφυτευτικούνεφρόοι βιοψίες (n=10) χρησίμευσαν ως υγιείς μάρτυρες (HCs) και αναλύθηκαν παράλληλα με τις βιοψίες LN. Ο ίδιος νεφρολόγος (AM) θεράπευσε όλους τους ασθενείς και ένας έμπειρος νεφροπαθολόγος (VA) διάβασενεφρόβιοψίες. Η επιτροπή δεοντολογίας του Hospital Fernandez (Μπουένος Άιρες) και η επιτροπή θεσμικής αναθεώρησης του Πανεπιστημίου του Οχάιο ενέκριναν τη διερεύνηση τουνεφρόβιοψίες.

Εκχύλιση και Ανάλυση RNA

Οι βιοψίες που χρησιμοποιήθηκαν για μεταγραφική ανάλυση στερεώθηκαν σε φορμαλίνη και ενσωματωμένες σε παραφίνη (FFPE). Από τα μπλοκ παραφίνης, τομές 10 μm κόπηκαν από κάθε βιοψία. Μετά την αποπαραφίνιση, όλα τα διαθέσιμα σπειράματα και ΤΙ διαχωρίστηκαν με μικροτομή λέιζερ (PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Γερμανία), συνελήφθησαν και υποβλήθηκαν σε πέψη με πρωτεϊνάση Κ. Το DNA αφαιρέθηκε με DNase. Το RNA καταβυθίστηκε, εκχυλίστηκε με στήλες περιστροφής RNeasy MinElute (Qiagen, Redwood City, CA, USA) και εκλούστηκε σε νερό χωρίς RNase. Η έκφραση μεταγραφής αναλύθηκε από 250 ng εκχυλισθέντος RNA χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα NanoString nCounter και τον πίνακα μεταγραφής ανθρώπινης ανοσολογίας GX [NanoString Technologies, Seattle, WA, USA; (3–5)]. Το πάνελ ανθρώπινης ανοσολογίας v2 αποτελούνταν από 579 γονίδια ανοσοαπόκρισης, 6 γονίδια θετικού ελέγχου και 6 γονίδια αρνητικού ελέγχου. Ένας πλήρης κατάλογος αυτών των γονιδίων μπορεί να βρεθεί στην προηγούμενη δημοσίευση από την ομάδα μας (6). Για ομοεστιακή μικροσκοπία IF, παγωμένηνεφρόιστοί βιοψίας από τέσσερις ασθενείς με ενεργό LN Κατηγορίας IV ελήφθησαν από το Βιοαποθετήριο Νεφροπαθολογίας του Οχάιο. Τρία κατεψυγμένα δείγματα νεφρεκτομής χρησιμοποιήθηκαν ως HC. Οι νεφρεκτομές έγιναν σε ασθενείς μενεφρώνκυτταρικό καρκίνωμα. Ο ιστός που ελήφθη για ανάλυση αποκόπηκε από τον καρκινικό ιστό. Ο περιβάλλοντας ιστός που χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση φάνηκε υγιής με ιστολογική ανάλυση. Οι νεφρεκτομές χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι επειδή χρειάζονταν κατεψυγμένα δείγματα και δεν είχαμε αποθηκευμένο κατεψυγμένο ιστό δότη μοσχεύματος στο βιοαποθήκη μας.

Αντισώματα

Τα πρωτεύοντα αντισώματα (Abs) που χρησιμοποιούνται για IF παρατίθενται όλα στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη επικυρώθηκαν για IF είτε χρησιμοποιώντας ανθρώπινο λεμφαδένα είτε χρησιμοποιώντας ανθρώπινο ήπαρ ως θετικό έλεγχο (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι ισοτυπικοί έλεγχοι που χρησιμοποιούνται είναι το ChromoPure normal rabbit IgG, το κανονικό IgG ποντικού (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), το IgG1κ ποντικού (BioLegend, San Diego, CA, USA) και το IgG2bκ ποντικού (Jackson ImmunoResearch). Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για το IF ήταν κατσίκας F(ab′)2 αντι-ποντικού IgG 488 (Jackson ImmunoResearch) και κατσίκας αντι-κουνελιού IgG 568, κατσίκας αντι-κουνελιού IgG 488 και κατσίκας αντι-κουνελιού IgG 647 από την Invitrogen (Thermo Fis Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

ΑνοσοφθορισμόςΠαγωμένη νεφρεκτομή και LNνεφρόΟι βιοψίες τεμαχίστηκαν (τομή 5 μm ανά αντικειμενοφόρο πλάκα), σταθεροποιήθηκαν σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με παραφορμαλδεϋδεφωσφορικό 4 τοις εκατό (PBS) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν με PBS (με 0},02 τοις εκατό αζίδιο νατρίου). Οι τομές αποκλείστηκαν με 5 τοις εκατό γάλα σε PBS, ακολουθούμενη από επώαση με το πρωτογενές Ab όλη τη νύχτα. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS για 1 ώρα, οι τομές επωάστηκαν με δευτερεύοντα Abs επισημασμένα με φθορισμό για άλλη μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (100 ng/ml) για 10 λεπτά. Τα τμήματα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν με Prolong Gold (Invitrogen) κάτω από καλυπτρίδες. Τα Abs ελέγχου αναφέρονται στη λίστα των ισοτύπων Abs με τα αντίστοιχα δευτερεύοντα Abs τους. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Olympus FluoView 1000 εξοπλισμένο (Olympus Corp., Τόκιο, Ιαπωνία) με σύστημα φασματικής ανίχνευσης για πιο λεπτό διαχωρισμό φθοροχρωμάτων (φάσματα FV1000) μαζί με φακό εμβάπτισης λαδιού × 60 σε θερμοκρασία δωματίου.

Ποσοτική ΜικροσκοπίαΤο επίπεδο έκφρασης του infDC σε LN και HCνεφράπροσδιορίστηκε ποσοτικά από εικόνες που χρωματίστηκαν για infDC χρησιμοποιώντας αντι CD163. Η συνολική ένταση του CD163 με βάση την έκφραση infDC υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ΗΠΑ). Η ένταση CD163 λήφθηκε μετά την αφαίρεση του φθορισμού φόντου από τον ισότυπο και τις δευτερεύουσες εικόνες που έχουν χρωματιστεί με Ab και μετρώντας την περιοχή και τη μέση ένταση φθορισμού των πράσινων εικονοστοιχείων που προέρχονται από το infDC χρησιμοποιώντας το αντίσωμα CD163 όπως περιγράφηκε προηγουμένως (7).

Στατιστική ανάλυσηΓια μεταγραφική ανάλυση, τα περιγραφικά στατιστικά στοιχεία παρουσιάζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση ή ως ποσοστό. Για κλινικές μεταβλητές, εφαρμόστηκαν δοκιμές t-test, ANOVA ή άθροισμα κατάταξης Wilcoxon ανάλογα με την περίπτωση. Για τις κατηγορικές κλινικές μεταβλητές, χρησιμοποιήθηκε η ακριβής δοκιμή Fisher. Για τα δεδομένα nanostring, οι πρωτογενείς μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν στους θετικούς μάρτυρες spike-in και στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν το log2. Για να μειωθεί η τεχνική προκατάληψη, τα γονίδια με επίπεδο έκφρασης κάτω από το μέσο όρο συν δύο τυπικές αποκλίσεις των αρνητικών μαρτύρων φιλτραρίστηκαν. Ποσοστιαία κανονικοποίηση εφαρμόστηκε στα υπόλοιπα μεταγραφήματα (522 για σπειράματα και 502 για ΤΙ). Τα σπειραματικά δείγματα αναλύθηκαν χωριστά από τα δείγματα ΤΙ. Για τον προσδιορισμό της διαφορικής έκφρασης, της σπειραματικής και της έκφρασης μεταγραφής ΤΙ από το LNνεφράσυγκρίθηκαν με τους ελέγχους. Μια αλλαγή 1.5-πτυχώματος και p < 0.05="" ήταν="" απαραίτητα="" για="" να="" θεωρηθεί="" ότι="" μια="" μεταγραφή="" εκφράζεται="" διαφορικά.="" για="" τη="" στατιστική="" ανάλυση="" της="" ομοεστιακής="" μικροσκοπίας,="" χρησιμοποιήθηκε="" ένα="" τεστ="" t="" student="" δύο="" ουρών="" για="" σύγκριση="" δύο="" ομάδων="" και="" το="" p="">< 0,05="" θεωρήθηκε="" σημαντικό.="" όλες="" οι="" αναλύσεις="" εκτελέστηκαν="" χρησιμοποιώντας="" το="" origin="" pro="" έκδοση="" 2020="" (originlab="" corp.,="" northampton,="" ma,="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η μεταγραφική ανάλυση των βιοψιών νεφρού στο LN Flare αποκαλύπτει σημαντική υπερέκφραση του FCER1G στα σπειράματα και TI στο LN FlareΠραγματοποιήσαμε μεταγραφική ανάλυση σε RNA που απομονώθηκε από σπειράματα και ΤΙ χρησιμοποιώντας LCM από τονεφρόβιοψίες που ελήφθησαν σε πολλαπλασιαστική έκρηξη LN (n=58). Ζωντανός δότης προεμφυτευτικούμεταμόσχευση νεφρούχρησιμοποιήθηκαν βιοψίες ως HC (n {{0}}). Η μεταγραφική ανάλυση για 579 άνοσα μεταγραφήματα έδειξε ότι το FCER1G είναι το πιο σημαντικά υπερεκφρασμένο σπειραματικό μεταγράφημα [Αλλαγή διπλώματος (FC): 3,6, p-value (p): 1E-10] αλλά επίσης υπερεκφράζεται σημαντικά στο TI (FC: 1.7, p=0.001) στο φλας LN (Εικόνα 1 και Συμπληρωματικός Πίνακας 2) σε σύγκριση με το HC. Επιπλέον, η έκφραση FCER1G συσχετίστηκε με τον δείκτη δραστηριότητας ιστολογικής νόσου του NIH (r=−0,43, p=0,01).

Το νεφρικό FcR εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε έξαρση LN και περιορίζεται στην περισπειραματική περιοχήΓια να χαρακτηρίσουμε το κύτταρο του ανοσοποιητικού που εκφράζει το FCER1G, αναλύσαμε την κωδικοποιημένη πρωτεΐνη FCER1G, αλυσίδα γάμμα υποδοχέα Fc [FcR; (8)] σε ανθρώπινο LN και HCνεφρόιστού με μικροσκοπική ανάλυση IF χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα. Η ανάλυση IF αποκάλυψε ότι το FcR εκφράζεται ελάχιστα στα σπειράματα (που προσδιορίζονται από τον δείκτη ποδοκυττάρων, τη συναπτοποδίνη), αλλά εκφράζεται σε αφθονία στις περιοχές PG και TI των βιοψιών έξαρσης LN. Τα κύτταρα που εκφράζουν FcR φάνηκαν να έχουν μια τυπική εμφάνιση κυτταρικού διηθήματος στην περιοχή PG, μικροσκοπικά (Εικόνα 2). Η ανάλυση IF έδειξε ότι κατά τη διάρκεια της έξαρσης LN, η περιοχή PG επεκτείνεται λόγω της παρουσίας κυτταρικού διηθήματος, ενώ η περιοχή PG είναι λεπτή και χωρίς διήθηση κυττάρων σε HC όπως φαίνεται στις συγχωνευμένες εικόνες του Σχήματος 2

και Συμπληρωματικό Σχήμα 4. Το πιο σημαντικό, είδαμε μια αδύναμη έως μηδενική έκφραση του FcR σε LN και HCs χρησιμοποιώντας μάρτυρες αντισωμάτων ισοτύπου που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ταυτόχρονα (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τα μεταγραφικά ευρήματα ότι το FCER1G κωδικοποιεί το FcR και υπερεκφράζεται σε αφθονία σε πολλαπλασιαστική έκρηξη LN.

Οι δείκτες μακροφάγων CD11b και CD68 δεν εντοπίστηκαν με FcR στον ανθρώπινο νεφρό LN

Με βάση προηγούμενες περιγραφές των διάμεσων λευκοκυττάρων στο LN (9-11), προβλέψαμε ότι το κύτταρο που εκφράζει FcR θα είναι μακροφάγο. Κάναμε διπλή χρώση τομών βιοψίας με αντισώματα αντι-FcR Αντισώματα FcR έναντι δεικτών μακροφάγων CD68, CD206 και CD11b. Απροσδόκητα, χρώση για Μ2-ειδικούς δείκτες μακροφάγων, CD11b και CD206 [(12); δεδομένα δεν εμφανίζονται], έδειξε έκφραση ασθενούς έως μηδενικού στο LNνεφρό.Εν τω μεταξύ, ο δείκτης πανμακροφάγου CD68 (13) έδειξε σπειραματική έκφραση. Έτσι, υποδηλώνοντας Μ1 μακροφάγα βρέθηκαν κυρίως μέσα στα σπειράματα. Ωστόσο, η χρώση CD68 δεν συνέπεσε με τη χρώση PG και TI για FcR (Εικόνα 3). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι κύτταρα που εκφράζουν FcR στονεφρόδεν είναι μακροφάγα. Αν και τα αντισώματα κατά των CD206, CD68 και CD11b έδωσαν ασθενές ή καθόλου σήμα στο LNνεφρό, έβαψαν έντονα τα κύτταρα Kupffffer σε υγιές ανθρώπινο ήπαρ, επιβεβαιώνοντας την αξιοπιστία και την εξειδίκευση των αντισωμάτων [(14)· δεδομένα δεν εμφανίζονται].

FcR εντοπίζεται με συμβατικό δενδριτικό κυτταρικό δείκτη CD11c και MHCII σε νεφρό LN 

Για να προσδιοριστεί εάν το κύτταρο που εκφράζει FcR ήταν ένα δενδριτικό κύτταρο (DC), έγινε τριχρωμία IF μικροσκοπία χρησιμοποιώντας τον συμβατικό δείκτη DC CD11c και MHCII που είναι γνωστό ότι εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε όλα τα ανθρώπινα DCs (15, 16), επιπλέον τα άλλα μυελοειδή κύτταρα. Η ποιοτική ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση FcR (επισημασμένη με χρήση αντισώματος anti-FcR ακολουθούμενη από συζευγμένο με βαφή Alexa-594 δευτερεύον αντίσωμα (Invitrogen) που έδειξε κόκκινο χρώμα εκπομπής σε ομοεστιακή μικροσκοπία) εντοπίστηκε και με CD11c και MHCII. Τα CD11c/MHCII επισημάνθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα CD11c/MHC II ακολουθούμενα από συζευγμένο με βαφή Alexa-488 δευτερεύον αντίσωμα (Invitrogen) έδειξε πράσινο χρώμα εκπομπής σε ομοεστιακή μικροσκοπία (Εικόνα 4). Ο εντοπισμός είχε ως αποτέλεσμα ένα κίτρινο χρώμα που αντανακλά την παρουσία τόσο του φθορισμού FcR (κόκκινο) όσο και του CD11c/MHCII (πράσινο) να συνυπάρχουν στην ίδια θέση/κελί στη διάσταση XY (Εικόνα 4). Το σχέδιο χρώσης του CD11c ταιριάζει με το FcR (Εικόνα 4) στην περιοχή PG και TI, και κανένα αντίσωμα δεν χρωματίστηκε εντός των σπειραμάτων. Σε συμφωνία με το CD11c, το MHCII (Εικόνα 4, κάτω σειρά) επίσης κηλιδώθηκε έντονα σε PG, εντοπίζοντας με FcR. Αλλά, εκτός από την ισχυρή χρώση PG, το MHCII έδειξε επίσης ασθενή χρώση εντός του σπειράματος, υποδηλώνοντας την παρουσία ενός ασθενούς σπειραματικού κυττάρου που εκφράζει το MHCII που μπορεί να είναι μυελοειδές κύτταρο.

Το FcR δεν εντοπίστηκε με τον πλασμακυτταροειδές δενδριτικό κυτταρικό δείκτη CD123, αλλά εντοπίστηκε με τον δείκτη δενδριτικών κυττάρων που προέρχονται από μονοκύτταρα DC-SIGN

Για να προσδιοριστεί ποιο υποσύνολο DC που εκφράζει FcR βρίσκεται στην περιοχή PG κατά τη διάρκεια της έκρηξης LN, ο ιστός της βιοψίας χρωματίστηκε για CD123, έναν ειδικό δείκτη ενός πλασματοκυτταροειδούς DC (pDC) (16, 17). Τα κύτταρα CD123 plus βρέθηκαν στην περιοχή TI (Εικόνα 5, επάνω σειρά) αλλά απουσίαζαν από τα σπειράματα και την περιοχή PG του LNνεφρά. Τα κύτταρα CD123 plus ήταν αραιά και η χρώση CD123 στο ΤΙ δεν ευθυγραμμίστηκε με τη χρώση FcR. Αυτό υποδηλώνει ότι το ενδονεφρικό DC που εκφράζει FcR στο LN δεν είναι pDC. Η έκφραση της ρυθμιστικής πρωτεΐνης άλφα σήματος (SIRP) εντοπίστηκε με FcR (Εικόνα 5, μεσαία σειρά), υποδηλώνοντας ότι τα PG DC δεν είναι μυελοειδή συμβατικά DC τύπου 1 (cDC1) (16). Οι υπόλοιπες πιθανότητες ήταν ότι τα PG DCs είναι μυελοειδή συμβατικά DCs τύπου 2 (cDCs2) ή DCs που προέρχονται από μονοκύτταρα (moDCs). Για να γίνει διάκριση μεταξύ αυτών των υποσυνόλων DC, της έκφρασης DC-SIGN, αξιολογήθηκε ένας δείκτης ειδικός για τα moDC. Το DC-SIGN εντοπίστηκε με FcR στην περιοχή PG (Εικόνα 5, κάτω πλαίσιο) υποδηλώνοντας ότι το PG DC είναι ένα moDC.

Το FcR εντοπίστηκε με CD64, CD16 και CD14 στην περισπειραματική περιοχή του νεφρού και επιβεβαιώθηκε ότι τα DC 

Βρέθηκε στο LNΝεφρόat Flare Are moDCs Για να επιβεβαιωθεί ότι τα DC που εκφράζουν FcR είναι moDCs, χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω με την αξιολόγηση της παρουσίας πρόσθετων δεικτών κυτταρικής επιφάνειας που είναι γνωστό ότι υπάρχουν στο moDC συμπεριλαμβανομένων των CD64, CD16 και CD14. Καθένας από αυτούς τους δείκτες βρέθηκε στο LNνεφρόιστού και εντοπίζεται με FcR (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).

Το FcR εντοπίζεται με προηγουμένως αναγνωρισμένο κυκλοφορούν δείκτη infDC Η έκφραση CD163 και CD163 υπερεκφράζεται στο LN Flare

Στη συνέχεια, έγινε ανάλυση συνεντοπισμού του CD163 με FcR για να προσδιοριστεί εάν ο πληθυσμός moDC που εμφανίζεται εδώ θα μπορούσε να είναι ο πρόσφατα περιγραφόμενος κυκλοφορούν infDC (18). Το σχήμα 6 επιβεβαιώνει τον εντοπισμό του CD163 (πράσινο) με FcR (κόκκινο) στην περιοχή PG (Εικόνα 6Α) και το TI (Εικόνα 6Β) υποδηλώνοντας έντονα ότι το υποσύνολο moDC που υπάρχει στονεφρόκατά τη διάρκεια της λάμψης LN είναι όντως infDC. Καθώς τα infDC δεν εκφράζουν το CD5 (18), τονεφρόο ιστός χρωματίστηκε για CD5. Παρόλο που υπήρχαν κύτταρα που εκφράζουν CD5-στονεφρό, δεν βρίσκονταν κοντά στην περιοχή PG και δεν εντοπίστηκαν με FcR (Συμπληρωματικό Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα infDC στερούνται έκφρασης CD5. Για να ποσοτικοποιηθεί η διαφορά στο infDC σε LN και HCνεφρά, τα infDC ποσοτικοποιήθηκαν με μέτρηση της περιοχής έκφρασης CD163 μετά από χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CD163 και της μέσης έντασης φθορισμού του CD163. Χρήση 16 σπειραματικών εικόνων από 4 φλας LNνεφρά, και 18 σπειραματικές εικόνες από τρεις HCνεφρά, βρήκαμε 9- έως 21-πλάσιο υψηλότερο επίπεδο infDC στους νεφρούς LN σε σύγκριση με το HC (Εικόνα 6Γ). Δεδομένου ότι τα infDCs είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι εκφράζουν το CD11b (19, 20), αναλύσαμε περαιτέρω το ανθρώπινο LNνεφρόμε αντι-ανθρώπινο CD11b mAb αρουραίου (κλώνος Μ1/70) μαζί με αντίσωμα αντι-CD163. Σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα σε αυτό το χειρόγραφο (Εικόνα 3), ο κλώνος M1/70 έδωσε ένα σήμα ασθενούς έως μηδέν στα infDC (Συμπληρωματικό Σχήμα 3).

Τα φλεγμονώδη δενδριτικά κύτταρα ήταν παρόντα σε κοντινή απόσταση με τα Τ κύτταρα στο LN Flare

Νεφρίτιδα λύκουνεφρόΟι τομές χρωματίστηκαν με τον δείκτη Τ-λεμφοκυττάρων CD3 και αντισώματα κατά των FcR και CD163 για εντοπισμό Τ-λεμφοκυττάρων και infDC στο χώρο. Η κοστολόγηση CD3 με δείκτες infDC έγινε με δύο τρόπους χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς κλώνους αντισωμάτων αντι-CD3 (mAb UCHT1 ποντικού και mAb SP7 κουνελιού) και 2 δείκτες infDC. Η χρώση CD3 mAb UCHT1 και αντι-FcR έδειξαν την παρουσία CD3 συν Τ κυττάρων δίπλα στα FcR συν infDCs στην περιοχή PG του LNνεφρό(Εικόνα 7Α). Η χρώση με αντι-CD163 συν CD3 mAb SP7 (Εικόνα 7Β) επιβεβαίωσε ότι τα infDC ήταν παρόντα σε κοντινή απόσταση από τα CD3 συν Τ κύτταρα στο ανθρώπινο LNνεφρό.Παρόλο που η συνιστώμενη χρώση του CD3 με δείκτες infDC έδειξε κυρίως διακριτή πράσινη και κόκκινη χρώση και για τους δύο τύπους κυττάρων, σε μερικά σημεία η κόκκινη και πράσινη χρώση επικαλύπτονταν.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε έναν νέο πληθυσμό infDC που διεισδύει στονεφρόστη φωτοβολίδα LN. Αυτά τα infDC διεισδύουν, εντοπίζονται στους χώρους PG και TI και η έκφρασή τους ήταν 10- φορές μεγαλύτερη στην έκρηξη LNνεφρόσε σύγκριση με τα HC. Η απόδειξη ότι αυτά είναι νέα βασίζονται στους δείκτες επιφανείας τους, όπως FcR plus , MHCII plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 και CD11bV . Συγκεκριμένα, αυτά τα infDC ήταν παρόντα σε στενή προσέγγιση με τα Τ κύτταρα στην περιοχή PG τουνεφρόκατά την έκρηξη LN. Οι παρατηρήσεις από αυτήν την έρευνα υποστηρίζονται από προηγούμενες μελέτες που ανίχνευσαν διήθηση PG DC σε διάφορα μοντέλα ποντικών πειραματικής σπειραματονεφρίτιδας (21, 22). Ωστόσο, δεν είναι σαφές γιατί το infDC εγκαθίσταται στον χώρο PG. Η προηγούμενη βιβλιογραφία προτείνει ότι τονεφρώνΤο DC ξεκινά από το σπείραμα και διασχίζει από το μεσάγγιο μέσω του σπειραματικού θυσάνου και των λεμφαγγείων έως τους λεμφαδένες αποστράγγισης προκειμένου να παρουσιάσει αντιγόνο στα Τ κύτταρα στο PG (23). Σε αυτή την περίπτωση, τονεφρώνΤο DC μπορεί να ξεκινήσει στο σπείραμα, αλλά από τη στιγμή που το LN γίνει κλινικά εμφανές, αυτά τα DC έχουν ήδη μετακινηθεί έξω από το σπείραμα και έχουν εγκατασταθεί στον χώρο PG. Στη συνέχεια μπορεί να απελευθερωθούν ανασταλτικά σήματα και να μπλοκάρουν τις κυτοκίνες/χημειοκίνες που απαιτούνται για τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων στο infDC, εξηγώντας την απουσία infDC από τα σπειράματα LN τη στιγμή της βιοψίας. Εναλλακτικά, είναι πιθανό οι DC χημειοτακτικοί παράγοντες να απελευθερώνονται απευθείας απόνεφρώνσωληνοειδή κύτταρα που προσελκύουν διεισδυτικό DC (24). Υποθέτουμε ότι και τα δύο συμβαίνουν ως απόκριση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα που έχουν ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση PG και TI του infDC κατά τη διάρκεια του LN.

Αυτή η έρευνα έδειξε ότι τα PG DC δεν είναι πλασματοκυτταροειδή ή συμβατικά DC. Η έκφραση μονοκυτταρικών δεικτών CD14, CD64 και CD16 που αναφέρθηκαν νωρίτερα, επιβεβαίωσε ότι αυτά τα PG DC αντιπροσωπεύουν ένα moDC (16, 25, 26). Σε περίπτωση ενεργού φλεγμονής ή μόλυνσης, τα moDCs ονομάζονται infDCs (27). Περαιτέρω χαρακτηρισμός αυτών των moDCs αποκάλυψε έναν μοναδικό πληθυσμό infDC που δεν είχε περιγραφεί προηγουμένως στο ανθρώπινο LN. Ιδιαίτερα, ωστόσο, μια πρόσφατη μεταγραφική μελέτη ανοσοκυττάρων περιφερικού αίματος σε ασθενείς με ΣΕΛ εντόπισε μια υπογραφή infDC που ήταν CD163 plus, CD14 plus και CD5h, η οποία είναι παρόμοια με τον ενδονεφρικό πληθυσμό infDC που αναφέρεται εδώ (18). Πρόσφατα, διεξήχθη εκτενής αξιολόγηση των ανοσοκυττάρων χρησιμοποιώντας μονοκύτταρο RNA-Seq απόνεφρόβιοψίες στο φλας LN (28). Πολλές ομάδες μονοκυττάρων ταυτοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη με ένα σύμπλεγμα μονοκυττάρων που εκφράζει μια υπογραφή CD163 plus, CD14 plus, CD16 plus, CD64 plus και DC-SIGN plus, παρόμοια με την infDC που περιγράφεται εδώ. Επιπλέον, η χαρακτηριζόμενη γενεαλογία μονοκυττάρων θεωρήθηκε ότι είναι ένα διεισδυτικό υποσύνολο μονοκυττάρων καθώς εκφραζόταν ελάχιστα σε υγιείςνεφρά. Αν και αυτές οι μελέτες IF δεν παρέχουν ακριβή μέτρηση του επιπέδου έκφρασης του δείκτη γενεαλογίας και αυτό θα μπορούσε να κάνει την ταυτοποίηση των μεταβατικών σταδίων της μετατροπής μονοκυττάρου σε DC dDFOult, αυτά τα ευρήματα επιτρέπουν τον χαρακτηρισμό και τον χωρικό προσανατολισμό για περαιτέρω ποσοτικές μελέτες.

Αυτός ο νέος πληθυσμός infDC μοιάζει επίσης με τον infDC που αναφέρθηκε προηγουμένως, από λεμφαδένες ποντικών μολυσμένων με Listeria (CD64 συν CD11c συν MHCII συν) (27) και βλεννογόνο του εντέρου της κοιλιοκάκης (29). Τα InfDCs έχουν επίσης περιγραφεί στο παρελθόν στο αρθρικό αρθρικό υγρό του ανθρώπου από ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα (20). Ωστόσο, το infDC που περιγράφεται στο LNνεφρόδιαφέρει από το αρθρικό υγρό infDC. σε αυτό, δεν έχουν τους μακροφάγους δείκτες CD11b και CD206 που υπάρχουν στο αρθρικό υγρό infDC. Αυτό υποδηλώνει ότι ο πληθυσμός infDC που περιγράφεται εδώ διαφέρει από τον infDC που παρατηρείται σε τουλάχιστον ορισμένες άλλες αυτοάνοσες ασθένειες και μπορεί να είναι μοναδικός γιανεφρόκατά τη διάρκεια της λάμψης LN. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει το FcεRI [(19, 30); ταυτοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα antiFcεRI (eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) για τη θέση δέσμευσης αντισωμάτων] ως ο καλύτερος δείκτης για τη διάκριση του infDC

ΕΙΚΟΝΑ 6|Η γάμμα αλυσίδα του υποδοχέα Fc εντοπίζεται με τον προηγουμένως αναγνωρισμένο δείκτη φλεγμονώδους δενδριτικού κυττάρου (infDC) Η έκφραση CD163 και CD163 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο LN σε σύγκριση με HCs. (Α) Τρεις έγχρωμες εικόνες IF που είναι αντιπροσωπευτικές 3 ανθρώπινων LNνεφράπου δείχνει τον εντοπισμό του CD163 σε πράσινο ΣΧΗΜΑ 6|(πρώτη) με FcR σε κόκκινο (μέση) στην περιοχή PG. Η δεύτερη σειρά δείχνει ένα μεγεθυσμένο τμήμα εικόνων της επάνω σειράς που επισημαίνονται στο διακεκομμένο τετράγωνο. Η τρίτη στήλη δείχνει τη συγχώνευση των πρώτων 2 μαζί με τη χρώση DIC και DAPI των πυρήνων (μπλε). (Β) Τρεις έγχρωμες εικόνες IF που είναι αντιπροσωπευτικές του 3 ανθρώπινου LNνεφράπου δείχνει εντοπισμό του CD163 σε πράσινο (πρώτα) με FcR σε κόκκινο (μέση) στη σωληναρισιακή (TI) περιοχή. (Γ) Το γράφημα ράβδων απεικονίζει την ποσοτικοποίηση των infDCs με βάση την έκφραση CD163 χρησιμοποιώντας πράσινο χρώμα από χρώση αντι-CD163 από εικόνες 18 G 3 διαφορετικών HC και 16 εικόνες σπειραμάτων από 4 διαφορετικά δείγματα LN χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Η περιοχή μόνο (γραφική παράσταση στα αριστερά) και η περιοχή × μέση ένταση φθορισμού (γραφική παράσταση αριστερά) του CD163 (πράσινο) μετρήθηκαν και σχεδιάστηκαν με μέσο όρο ± SD. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μη ζευγαρωμένη t-test (one-tailed) χρησιμοποιώντας κάθε μέτρηση και οι τιμές p υποδεικνύονταν στο γράφημα ράβδων. ΕΙΚΟΝΑ 7|Η σειρά απεικονίζει 3 έγχρωμες εικόνες IF που αντιπροσωπεύουν τα τρία διαφορετικά LNνεφράπου δείχνει την παρουσία CD3 (δείκτης pan T κυττάρων με κόκκινο χρώμα) δίπλα στο CD163 (δείκτης infDC με πράσινο χρώμα) που μεγεθύνονται σε μεγάλο βαθμό από την περιοχή PG. Η κάτω σειρά δείχνει τις συγχωνευμένες εικόνες των πρώτων 2 στηλών στα δεξιά και τις συγχωνευμένες εικόνες των πρώτων 2 στηλών συν τη χρώση DIC και DAPI των πυρήνων (μπλε) στα αριστερά. από μακροφάγα και cDC με κυτταρομετρία ροής. Οι μελέτες μας προτείνουν ότι το FcR, μια κυτταροπλασματική γάμμα υπομονάδα μέσω της οποίας λειτουργούν πολλαπλά FcRs, συμπεριλαμβανομένων των FcεRI, Fc RI, Fc RIIIa και Fc RI, καθώς και άλλων ανοσοϋποδοχέων όπως GPVI, OSCAR και TREM (8), είναι αξιόπιστη δείκτης για μελέτες IF σε δείγματα βιοψίας ασθενών. Είναι πιθανό ότι το infDC στο LNνεφρόεκφράζουν το FcεRI, παρόμοιο με το Fc RI και το Fc RIIIa (Συμπληρωματικό Σχήμα 1) αφού η παρουσία του FcR υποδηλώνει έμμεσα την παρουσία πολλαπλών υποδοχέων συμπεριλαμβανομένου του FcεRI.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

Η σημασία του χαρακτηρισμού του ενδονεφρικού κυτταρικού τύπου που εκφράζει το CD163 ενισχύεται από πρόσφατα ευρήματα από την ομάδα μας, αποκαλύπτοντας ότι τα επίπεδα CD163 στα ούρα ήταν σημαντικά υψηλότερα στο ενεργό LN σε σύγκριση με τον εξωνεφρικό SLE ή τον ανενεργό SLE (31). Το CD163 των ούρων συσχετίστηκε με τη σοβαρότητα της νόσου και τον δείκτη ιστολογικής δραστηριότητας. Ενώ η μελέτη των Mejia et al (31). Το προτεινόμενο CD163 προέρχεται από μακροφάγους Μ2, τώρα προτείνουμε ότι το CD163 ούρων προέρχεται επίσης από το infDC, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι το CD163 ούρων είναι ένας βιοδείκτης που αντανακλά τη δραστηριότητα της νόσου στο LN.

Όσον αφορά την προέλευση αυτών των infDCs, η έκφραση των μονοκυτταρικών δεικτών υποδηλώνει ότι τα infDCs μπορεί να διαφοροποιηθούν από τα διηθημένα μονοκύτταρα στονεφρόκατά τη διάρκεια φλεγμονής που προκαλείται από διάφορα αυτοάνοσα ερεθίσματα συμπεριλαμβανομένων των ανοσοσυμπλεγμάτων. Από την άλλη πλευρά, η παρουσία CD163 συν CD14 συν infDC στους ασθενείς με κυκλοφορία του λύκου (18) υποδηλώνει ότι η infDC από την περιφερική κυκλοφορία εισέρχεται στηννεφρόστο LN. Είναι επίσης πιθανό να συνυπολογίζονται και οι δύο μηχανισμοίνεφρώνinfDCs. Οι μηχανισμοί με τους οποίους το infDC αλληλεπιδρά με τα Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια του ανθρώπινου LN είναι επί του παρόντος άγνωστοι. Αν και η κοστολόγηση του CD3 μαζί με τους δείκτες infDC δείχνει κυρίως διακριτούς πληθυσμούς και των δύο τύπων κυττάρων σε κοντινή απόσταση (Εικόνα 7Β), υπάρχουν επίσης ενδείξεις κάποιας επικάλυψης που υποδηλώνει σχηματισμό ανοσολογικών συνάψεων και αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των infDC και των Τ κυττάρων στο LNνεφρό.Ωστόσο, τα Τ κύτταρα είναι έτοιμα να μεταναστεύσουν σε δευτερεύοντα λεμφοειδή όργανα. μια πρόσφατη αναφορά έδειξε την παρουσία ανοσολογικών συσσωματωμάτων οργανωμένων ως τριτογενείς λεμφικές δομές (TLS) σε ασθενείς με LN και LN ποντικούνεφράπου μοιάζουν με λεμφαδένες από υπογραφές γονιδίων και κυτταρική σύνθεση (32). Αυτό είναι σύμφωνο με μια προηγούμενη αναφορά που εντόπισε βλαστικά κέντρα με συσσωματώματα Τ- και Β-κυττάρων στο LNνεφρό(33). Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα ευρήματα στο πλαίσιο της αναγνώρισης των infDC στο LNνεφρόυποδηλώνει ότι τα infDC στο PG και το TI μπορεί να είναι σημαντικοί οδηγοί μιας τοπικής προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης εντός του νεφρού LN. Αν και δεν είναι ακόμη ξεκάθαρο εάν αυτά τα Τ κύτταρα είναι μόνιμα Τ κύτταρα ή αρχικά Τ κύτταρα, τα infDCs είναι γνωστό ότι υπό διάφορες ασθένειες έχουν την ικανότητα να πυροδοτούν την ανάπτυξη των κύριων υποσυνόλων Τ βοηθητικών κυττάρων, δηλαδή των Th1, Th2 και Th17 (20 , 34, 35). Αν και, in vitro μελέτες υποδεικνύουν ότι τα infDCs εμπλέκονται στην έναρξη και διατήρηση της απόκρισης Th17 (19), περαιτέρω μελέτες για το νέο LNνεφρό iΤα nfDCs χρειάζονται επειδή το φλεγμονώδες ερέθισμα και το μικροπεριβάλλον των ιστών καθορίζουν τη λειτουργία του infDC in situ (36).

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Συμπερασματικά, εντοπίσαμε έναν νέο πληθυσμό infDC που δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως στο LNνεφρό.Αυτά τα infDC βρίσκονται στην περιοχή PG και δίπλα σε διεισδυτικά Τ κύτταρα. Τα ευρήματά μας, σε συνδυασμό με την πρόσφατη βιβλιογραφία που προσδιορίζει το κυκλοφορούν CD163 συν infDC στον SLE και το CD163 των ούρων ως πολύτιμο δείκτη της δραστηριότητας της νόσου στο LN, υποδηλώνουν ότι τα infDC και οι συνεργάτες των Τ-κυττάρων τους μπορεί να είναι βασικοί συντελεστές στην προώθηση της τοπικής προσαρμοστικής ανοσολογικής απόκρισης κατά τη διάρκεια του ενεργού LN. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για τον καθορισμό των υποομάδων Τ κυττάρων που βρίσκονται δίπλα στα infDC και για την κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους τα PG infDC επικοινωνούν με τα Τ κύτταρα για να οδηγήσουν την τοπική φλεγμονή στο LN.