Ένα μυθιστόρημα, μοντέλο αταξικού ποντικιού αταξίας τελαγγειεκτασίας που προκαλείται από μια κλινικά σχετική ανόητη μετάλλαξη (Μέρος 2)

Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλώ επικοινωνήστεdavid.wan@wecistanche.com

3.0 Συζήτηση

Αυξάνοντας το γονιδιοτοξικό στρες μέσω της προσθήκης ενός δευτερεύοντος χτυπήματος στο μονοπάτι DDR, δημιουργήσαμε ένα νέο μοντέλο ποντικιού που εμφανίζει το πιο ολοκληρωμένο σύνολο συμπτωμάτων AT από οποιοδήποτε μοντέλο μέχρι σήμερα. Αυτό περιλαμβάνει σοβαρή και προοδευτική αταξία που σχετίζεται με παρεγκεφαλιδική ατροφία και διαταραχές των ιδιοτήτων PN μαζί με υψηλή συχνότητα εμφάνισης καρκίνου και ελαττώματα στην ανάπτυξη των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Μαζί, αυτές οι συννοσηρότητες περιλαμβάνουν τις τρεις κύριες αιτίες πρόωρου θανάτουAT — το καθένα συνεισφέρειστο ένα τρίτο περίπου των θανάτων. Από αυτές, η ανασταλτική επίδραση της αταξίας είναι η πιο διεισδυτική και αναφέρεται από τους ασθενείς και τους φροντιστές ότι έχει τη μεγαλύτερη επίδραση στην ποιότητα ζωής τους. Για το λόγο αυτό, η παρουσία αταξίας και παρεγκεφαλιδικής ατροφίας σε αυτό το νέο μοντέλο ποντικού είναι μεγάλης σημασίας, καθώς παρέχει για πρώτη φορά έναν πόρο όχι μόνο για την αποσαφήνιση των μηχανισμών της νευρολογικής δυσλειτουργίας, αλλά και για ένα κρίσιμα απαραίτητο in vivo μοντέλο για δοκιμάστε τα εξαιρετικά απαραίτητα θεραπευτικά AT, όπως οι ενώσεις ανάγνωσης που περιγράφουμε εδώ. Βρήκαμε αρκετές ομοιότητες μεταξύ της συνολικής εξέλιξης της αταξίας στο Atm3535. Ποντίκια Aptx καιΣΕ ασθενείς. Στην κλινική AT, τα κινητικά ελλείμματα παρατηρούνται περίπου στην ηλικία των 2 ετών, όταν οι γονείς και οι γιατροί εντοπίζουν μειωμένη ικανότητα μετάβασης από το νήπιο σε μια ομαλή, αντανακλαστικά συντονισμένη πύλη - δυστυχώς, λίγα είναι γνωστά για τα κινητικά ελαττώματα σε πρώιμα στάδια λόγω των ασθενειών χαμηλός επιπολασμός και τρέχουσα έλλειψη πρώιμου διαγνωστικού ελέγχου (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Οι ασθενείς συνήθως μαθαίνουν να περπατούν χωρίς βοήθεια και τα νευρολογικά συμπτώματα τείνουν να παραμένουν σταθερά κατά τα πρώτα 4 έως 5 χρόνια της ζωής τους (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Βρήκαμε παρόμοια πρώιμη εξέλιξη των κινητικών ελλειμμάτων στο Atm735×R3x. Ποντίκια Aptx^', ανίχνευση πρώιμων ήπιων κινητικών ελλειμμάτων στο P8 (έλλειμμα αντανακλαστικού δεξιάς) ακολουθούμενη από μια περίοδο σχετικής σταθερότητας, πριν από την έναρξη της προοδευτικής και σοβαρής αταξίας που αναπτύχθηκε μετά το p210 που περιελάμβανε αλλαγές στο βάδισμα, το αντανακλαστικό τρόμου, τον τρόμο και την κινητικότητα δραστηριότητα. Πολλά σημαντικά ερωτήματα προκύπτουν από αυτά τα ευρήματα, συμπεριλαμβανομένου του εάν το ATM και/ή το APTX έχουν νευροαναπτυξιακό ρόλο στην

παρεγκεφαλίτιδα. Μελλοντικές μελέτες που θα επικεντρωθούν στην πρώιμη φάση της διαταραχής θα είναι κρίσιμες για την κατανόηση του εάν η παρεγκεφαλίδα αναπτύσσεται φυσιολογικά πριν από τη δυσλειτουργία ή εάν τα αναπτυξιακά ελαττώματα είναι μια αρχική αιτία. Βρήκαμε επίσης, παρόμοια με τους ασθενείς με AT, ότι η σοβαρότητα της καθυστερημένης αταξίας ήταν μεταβλητή, με μερικά ποντίκια να κινούνται με μια αδέξια πίσω πύλη με ψηλά βήματα (Βίντεο 3) και άλλα να κινούνται σχεδόν εξ ολοκλήρου μέσω συστροφής του πίσω κορμού ( Εικ.1Ε και Βίντεο 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958). Συνολικά, βρήκαμε ότι το Atm?35×xR35×; Τα ποντίκια Aptx ανέπτυξαν μια οπτικά βαθιά και μετρήσιμη προοδευτική απώλεια στον κινητικό συντονισμό παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε ασθενείς με AT, η οποία διασώθηκε με έκφραση τουλάχιστον ενός αντιγράφου του Atm ή του Aptx get he. Η απώλεια του κινητικού συντονισμού στην ΑΤ έχει αποδοθεί στον εκφυλισμό της παρεγκεφαλίδας λόγω της σχετικά εκλεκτικής νευροπαθολογίας της στον εγκέφαλο και του αιτιολογικού της ρόλου σε πολλές διαφορετικές μορφές αταξίας (Hoche et al.2012). Συνεπής μεAT ασθενήςμελέτες νευροαπεικόνισης (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013), βρίσκουμε ότι το μέγεθος της παρεγκεφαλίδας σε Atm735×R ; Τα ποντίκια Aptx' είναι αρχικά φυσιολογικά, αλλά προοδευτικά ατροφούν ταυτόχρονα με αλλαγές στη νευρολογική λειτουργία. Ενώ η απώλεια παρεγκεφαλιδικού ιστού έχει θεωρηθεί ως κύρια αιτία αταξίας στους ανθρώπους, δεν είναι σαφές από κλινικά δεδομένα εάν η σοβαρότητα της αταξίας είναι καλός προγνωστικός παράγοντας για την έκταση του παρεγκεφαλιδικού εκφυλισμού που βρέθηκε μεταθανάτια (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). Στο Atm?35×R35×; Aptx^ ποντίκια, βρίσκουμε σαφή ατροφία που σχετίζεται με λέπτυνση του δενδριτικού στρώματος του νευρώνα Purkinje που προηγείται των καθυστερημένων, σοβαρών ελλειμμάτων συμπεριφοράς. Οι ιστολογικές μας παρατηρήσεις στο Atm?35xR35×; Τα ποντίκια Aptx' προτείνουν ότι οι αλλαγές στην ίδια την παρεγκεφαλιδική λειτουργία, αντί για βαθιά απώλεια παρεγκεφαλιδικών κυττάρων, επαρκούν για να προκαλέσουν τον αταξικό φαινότυπο, σύμφωνα με την παρατήρηση ελαττωμάτων συμπεριφοράς πριν από σημαντική απώλεια PN σε αρκετές SCAs (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000· Clark et al. 1997· Jayabal et al.2016). Ο λόγος για τον οποίο απαιτείται ανεπάρκεια ATM και APTX για τη δημιουργία αταξίας σε ποντίκια, όταν η απώλεια από τα δύο είναι επαρκής για να προκαλέσει αταξία στους ανθρώπους παραμένει ασαφής. Μια πιθανότητα είναι ότι ο εγκέφαλος των τρωκτικών μπορεί να χρησιμοποιεί πιο ευέλικτα αντισταθμιστικά μονοπάτια ή περιττές πρωτεΐνες ενώ ανταποκρίνεται στις 10-20κ αλλοιώσεις του DNA που επηρεάζουν τα κύτταρα κάθε μέρα (Lindahl and Barnes 2000). Υπάρχουν διάφορες μορφές επιδιόρθωσης του DNA για να ανταποκριθούν δυνητικά σε αυτήν την πρόκληση, συμπεριλαμβανομένης της επιδιόρθωσης εκτομής βάσης (BER), επιδιόρθωσης εκτομής νουκλεοτιδίων (NER),

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα για το Cistanche

καθώς και ομόλογος και μη ομόλογος τερματικός σύνδεσμος (HEJ και NHEJ, αντίστοιχα), σε όλα τα ATM και APTX έχουν εμπλακεί (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) Εναλλακτικά, μπορεί να είναι Σε περίπτωση που η ανεπάρκεια σε ATM ή APTX από μόνη της δεν επηρεάζει επαρκώς την υγεία των κυττάρων κατά τη σχετικά σύντομη διάρκεια ζωής του ποντικιού, και επομένως η εξάλειψη και των δύο πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για να επιτευχθεί επαρκής συσσώρευση βλάβης του DNA για να εκδηλωθεί κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου. Αυτή η πιθανότητα ενισχύεται από το γεγονός ότι το ATM και το APTX έχουν διακριτές βιοχημικές ιδιότητες και λειτουργικούς ρόλους στην απόκριση της βλάβης του DNA, και επομένως μια ανεπάρκεια και στα δύο θα μπορούσε να προβλεφθεί ότι θα προκαλέσει ευρύτερο πλήγμα στη σταθερότητα του γονιδιώματος (δηλ. αυξημένο γονιδιοτοξικό στρες). Το εύρημα μας ότι απαιτούνται δύο πρωτεΐνες οδού σταθερότητας του γονιδιώματος για να προκληθούν νευρολογικά ελαττώματα σε ποντίκια υποδηλώνει έντονα ότι είναι η απώλεια του Oriole του ATM στην επιδιόρθωση του DNA, και όχι οι πιθανές λειτουργίες στη σηματοδότηση του οξειδωτικού στρες, τη μιτοφαγία ή τη μιτοχονδριακή λειτουργία που προκαλούν τα ελαττώματα της παρεγκεφαλίδας. Shiloh 2020). Εναλλακτικές, ωστόσο, δεν μπορούν να αποκλειστούν εντελώς, καθώς το APTX, όπως και το ATM, έχει παρατηρηθεί στα μιτοχόνδρια των εγκεφαλικών κυττάρων, όπου πιστεύεται ότι υποστηρίζει την επεξεργασία του μιτοχονδριακού DNA (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Αυτό το νέο μοντέλο ποντικιού παρέχει ένα νέο εργαλείο για να διερευνήσει αυτές τις δυνατότητες και να ορίσει μηχανιστικά πώς η απώλεια του ATM και του APTX προκαλεί τελικά παρεγκεφαλιδική δυσλειτουργία. Οι βιοφυσικές διαταραχές που παρατηρήθηκαν σε PN που καταγράφηκαν από το AtmR35XR35X. Τα ποντίκια Aptx βρίσκονται ομοίως σε πολλά άλλα μοντέλα αταξίας ποντικιών. Αυτό περιλαμβάνει αλλαγές που παρατηρήσαμε στην αντίσταση εισόδου PN, τη χωρητικότητα της μεμβράνης και το κατώφλι και το πλάτος AP, οι οποίες έχουν επίσης περιγραφεί σε μοντέλα ποντικιών SCA όπως 1, 3 και 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell «Orco et al.2015). Επιπλέον, η προοδευτική μείωση της συχνότητας πυροδότησης του δυναμικού δράσης PN που αναφέρουμε συσχετίζεται θετικά με την ανάπτυξη αταξίας στο AtrnR35XR35X. Το Aptx'mice αναφέρεται σε μεγάλο αριθμό μοντέλων αταξικών ποντικιών, συμπεριλαμβανομένων των SCA 1, 2, 3,5, 6 και 13 καθώς και σε μερικές επεισοδιακές μορφές (βλ. ανασκόπηση (Cook, Fields, and Watt 2021)). Δεδομένης της σημαντικής επικάλυψης στις διαταραχές του PN που παρατηρείται σε πολλές διαφορετικές αταξίες που προκαλούνται από διακριτά κυτταρικά ελαττώματα, η αποκατάσταση των συχνοτήτων πυροδότησης PN AP έχει θεωρηθεί ως μια ευρείας βάσης θεραπευτική προσέγγιση. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν η μειωμένη πυροδότηση PN είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας αταξίας. Επιπλέον, πειραματικά στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στη δραστηριότητα του PN μπορεί στην πραγματικότητα να είναι μια γενικευμένη απόκριση για τη διατήρηση της ομοιόστασης κατά τη διάρκεια της συνεχιζόμενης βλάβης της φυσιολογίας της PN που σχετίζεται με τη νόσο (Dell'Orco et al.2015). Επομένως, απαιτούνται συνεχείς προσπάθειες σε όλες τις παρεγκεφαλιδικές αταξίες για τη σύνδεση των γενετικών, μοριακών και κυτταρικών διαταραχών που προκαλούνται από τη νόσο με τις συγκεκριμένες αλλαγές στην παρεγκεφαλιδική νευρική σηματοδότηση που τελικά δημιουργούν την αταξία. Σημαντική σημασία σε αυτή την προσπάθεια θα είναι να καθοριστεί εάν τα παρεγκεφαλιδικά ελαττώματα που προκαλούν νόσο συνήθως ή διαφορικά προκαλούν αταξία μέσω απώλειας της παρεγκεφαλιδικής λειτουργίας (π.χ. απώλεια συντονιστικών σημάτων κατά την κίνηση) ή από μια κυρίαρχη-αρνητική επίδραση (π.χ. κυκλώματα με μη φυσιολογικά μοτίβα νευρικής εξόδου). Τελικά, ενώ μια κοινή θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση της παρεγκεφαλιδικής αταξίας θα είχε τον μεγαλύτερο αντίκτυπο, μια κατευθυνόμενη προσέγγιση που αντιμετωπίζει τις διακριτές γενετικές και μοριακές αιτίες της κυτταρικής δυσλειτουργίας μπορεί τελικά να είναι απαραίτητη για την επιτυχή ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής θεραπευτικής. πρωτεΐνες σταθερότητας όπως η δυσλειτουργία ATM και APTX και PN δεν είναι καθόλου ξεκάθαρη. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η επίδραση της απώλειας ATM και APTX στα PN είναι εγγενής, καθώς δεν βρίσκουμε αλλαγές στις προσυναπτικές ιδιότητες των κοκκωδών κυττάρων ή ενδείξεις κυτταρικής απώλειας τους (καμία αλλαγή στο πάχος του GCL). Επιπλέον, ενώ παρατηρήσαμε διαφορές στη βραχυπρόθεσμη πλαστικότητα των κατώτερων εισροών ελαιολάδου σε PN με ανεπάρκεια ATM και APTX και άγριου τύπου, αυτά τα αποτελέσματα πιθανώς υποδεικνύουν διαταραχή στην ομοιόσταση του Ca2* δυνητικά μέσω μειώσεων στην Ινοσιτόλη 1,4,{{35} Έκφραση του υποδοχέα τριφωσφορικού 1(ltpr1), παρόμοια με εκείνα που παρατηρήθηκαν σε μοντέλα ποντικών SCA 1,2 και 3 καθώς και σε ποντίκια με έλλειψη ATM (Kim et al.2020· Chen et al.2008· Demirci et al.2009· Shakkottai et al. al.2011). Αν και αυτό παρέχει μια πολλά υποσχόμενη οδό για μελλοντική εξέταση και σύγκριση, είναι ακόμη ασαφές, ακόμη και για τις SCA, εάν οι αλλαγές στην ομοιόσταση Ca²* είναι ο αιτιολογικός παράγοντας ή απλώς ένα άλλο σύμπτωμα ή ακόμη και αντισταθμιστική απόκριση νοσούντων ή διαταραγμένων PNs (Dell «Orco et al.2015). Στο ανοσοποιητικό σύστημα, το ΑΤΜ εμπλέκεται στην επιδιόρθωση των σπασίμων του DNA που συμβαίνουν φυσικά κατά τη γονιδιακή αναδιάταξη των γονιδίων των υποδοχέων αντιγόνου σε πρόδρομα κύτταρα Β και Τ, ένα φαινόμενο κρίσιμο για την ποικιλομορφία των υποδοχέων αντιγόνου (LG και TCR) αυτών των κυττάρων. διαπιστώνοντας ότιΤ-κύτταροΟι αναλογίες στο αίμα μειώνονται σημαντικά είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες σε ανθρώπους και ποντίκια με νοκ-άουτ AT (Schubert, Reichenbach και Zielen 2002· Hathcock et al.2013· Chao, Yang και Xu 2000· Barlow et al.1996). Αυτή η μείωση των Τ-κυττάρων στην περιφέρεια πιθανότατα σχετίζεται με ένα ελάττωμα τόσο στην κυτταρική όσο και στη χυμική ανοσία. Είναι σημαντικό ότι ανακαλύψαμε ότι η έκφραση ενός αντιγράφου του γονιδίου ATM είναι αρκετή για να αποκαταστήσει τα ελλείμματα CD4 συν στο αίμα, υποδεικνύοντας ότι οι θεραπείες ικανές να αποκαταστήσουν τη μερική έκφραση του ATM θα είχαν θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Αν και δεν έχουμε αξιολογήσει την ανάπτυξη των Β-κυττάρων σε αυτό το έγγραφο, είναι πιθανό ότι παρόμοια συμπεράσματα θα ισχύουν για αυτή τη διαδικασία δεδομένων των μηχανιστικών ομοιοτήτων τους (Marshall et al. 2018). Όπως αναμενόταν, η μείωση των Τ-κυττάρων στο περιφερικό αίμα συσχετίζεται με ελαττωματική ανάπτυξη θυμοκυττάρων. Στον θύμο αδένα, βρήκαμε δύο βασικά ελαττώματα. Το ένα, που προκαλείται κυρίως από ανεπάρκεια APTX, εκδηλώνεται ως ελάττωμα στη μετάβαση DN3 σε DN4 που συμπίπτει με την πρώιμη αναδιάταξη του τόπου TCR. Το άλλο ελάττωμα, που προκαλείται κυρίως από ανεπάρκεια ΑΤΜ, συσχετίζεται με μειωμένη εξέλιξη των διπλών θετικών CD4*CD8 σε μονοθετικά κύτταρα, κυρίως CD4' θυμοκύτταρα. Ενώ το εύρημα του APTX ήταν εκπληκτικό, καθώς η ανεπάρκειά του (AOA 1) δεν σχετίζεται με ανοσολογικά ελλείμματα, το APTX είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες αναδιάταξης γονιδίου TCR, συμπεριλαμβανομένου του XRCC4 (Clements et al. 2004). Μελλοντικές μελέτες που στοχεύουν στον καθορισμό του ρόλου του APTX στους μηχανισμούς τελικής σύνδεσης κατά τη διάρκεια της αναδιάταξης του γονιδίου TCR θα είναι

σημαντικό, και η πιθανότητα οι εναλλακτικοί μηχανισμοί τελικής σύνδεσης, όπως η χρήση μικροομολογιών, να εξηγούν την έλλειψη ανοσοποιητικού ελλείμματος σε περίπτωση απουσίας του χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση (Bogue et al. 1997). Η επιβίωση του Atm?35×/R35×; Το Aptx'mice είναι πολύ μεγαλύτερο από τα προηγούμενα μοντέλα ποντικιών AT. Συγκριτικά, το πρώτοΣΤΗΝ ΚΟμοντέλο ποντικιού που αναφέρεται από τους Barlow et al. πέθανε από θυμώματα συνήθως εντός 2-4 μηνών μετά τη γέννηση (Barlow et al. 1996). Η μειωμένη ικανότητα επιβίωσης από καρκίνο σε αυτό και σε πολλά άλλα μοντέλα ποντικιών νοκ-άουτ AT είναι πιθανώς γενετική, καθώς το στέλεχος υποβάθρου που φιλοξενεί τη μετάλλαξη έχει αποδειχθεί ότι έχει σημαντικές επιπτώσεις στον επιπολασμό και την επιβίωση του καρκίνου, με A/J και C57BL/6

υπόβαθρα που έχουν σημαντικά αυξημένη ικανότητα επιβίωσης σε σχέση με τα στελέχη BALBC και 129S (Genik et al. 2014). Το γεγονός ότι τα ποντίκια μας με ανεπάρκεια ATM δημιουργήθηκαν σε φόντο C57BL/6 πιθανότατα υποβόσκει. ότι τα ποντίκια Aptx*t δεν αναπτύσσουν αταξία, είναι η σχετικά μεγάλη διάρκεια ζωής τους. Δεδομένου ότι το Atm35xR35×; Είναι απίθανο ότι ο πρώιμος θάνατος σε ποντικούς AT KO εμποδίζει την παρατήρηση ενός αταξικού φαινοτύπου που διαφορετικά θα αναπτυσσόταν σε αυτά τα ποντίκια. Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν το υπόβαθρο C57BL/6 προσδίδει ανθεκτικότητα στην ανάπτυξη αταξίας, όπως συμβαίνει για τον καρκίνο. Ο καθορισμός των γενετικών ή πιθανώς επιγενετικών παραγόντων που επηρεάζουν τη σοβαρότητα της νόσου θα μπορούσε να παράσχει λεωφόρους για μελλοντική θεραπευτική ανάπτυξη. Δεδομένης της παγκόσμιας φύσης της μηδενικής μετάλλαξης ATM και APTX στο μοντέλο ποντικιού μας, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε εντελώς ότι τα εξω-παρεγκεφαλιδικά ελαττώματα μπορεί επίσης να συμβάλουν στον σοβαρό αταξικό φαινότυπο και επομένως μελλοντική εξέταση έξω από την παρεγκεφαλίδα στον πρόσθιο εγκέφαλο, το εγκεφαλικό στέλεχος και το νωτιαίο μυελό , και ακόμη και οι μύες θα πρέπει να διεξαχθούν. Εντός της παρεγκεφαλίδας, ενώ βρήκαμε κάποιες ανατομικές διαφορές στις ιδιότητες πυροδότησης PN σε διαφορετικές περιοχές της παρεγκεφαλίδας, δεν εντοπίσαμε περιφερειακές διαφορές στο πλάτος της ML ή στην πυκνότητα του PN. Ωστόσο, υπάρχουν προκλήσεις στη χρήση της περιφερειακής ανατομίας ως παράγοντα ομαδοποίησης στην παρεγκεφαλίδα, καθώς οι φυσικές πτυχές του ιστού δεν συσχετίζονται απαραίτητα με τα όρια της λειτουργικής, μοριακής έκφρασης ή τομέων φυσιολογικών ιδιοτήτων που έχουν περιγραφεί (Apps and Hawkes 2009 Tsutsumi et al.2015· Gao, van Beugen και De Zeeuw 2012· Zhou et al.2014). Τα πειράματα που επικεντρώνονται στην εξέταση της έκτασης των παρεγκεφαλιδικών ελαττωμάτων σε αυτούς τους τομείς θα είναι σημαντικά σε μελλοντικές μελέτες και σε σύγκριση με τις ανέκδοτες αναφορές ανατομικών διαφορών σε ασθενείς με ΑΤ (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, και Teplitz 1979· Monaco et al. 1988· Terplan and Krauss 1969· Strich 1966· Solitare 1968· Solitare και Lopez 1967· Aguilar et al. 1968a· Paula-Barbosa et al. 1983). Ενώ ανιχνεύουμε δύο πιθανά στάδια στην εξέλιξη της αταξίας στο Atm735wR35x. Ποντίκια Aptx, το μεταγενέστερο στάδιο της σοβαρής αταξίας αναπτύσσεται στην ενήλικη ζωή σε ποντίκια, σε σύγκριση με την έναρξη της παιδικής ηλικίας στους ανθρώπους. Αυτό μπορεί να περιορίσει τη χρήση του σε ορισμένες νευροαναπτυξιακές μελέτες. Επίσης, η ερμηνεία των μελλοντικών πειραμάτων πρέπει να συνυπολογίσει προσεκτικά το γεγονός ότι αυτό το νέο μοντέλο εκφράζει μηδενικές μεταλλάξεις σε δύο γονίδια σταθερότητας του γονιδιώματος ταυτόχρονα, μια κατάσταση που δεν έχει ανιχνευθεί σε ανθρώπους ασθενείς με AT ή AOA1. Τέλος, ο εντοπισμός πού, πότε και πώς η ανεπάρκεια ΑΤΜ προκαλεί παρεγκεφαλιδική παθολογία και αταξία ήταν μια πρόκληση, καθώς τα προηγούμενα ποντίκια με έλλειψη ΑΤΜ γενικά στερούνται τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα που απαιτούνται για να συνδέσουν αιτιολογικά τα κυτταρικά και μοριακά ελλείμματα με τον αταξικό φαινότυπο. Έχουν οριστεί πολλές ελπιδοφόρες οδοί έρευνας, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εστιάζονται σε νευρωνικό επίπεδο, όπου το ATM εμπλέκεται στη σηματοδότηση οξειδωτικού στρες (Chen et al.2003) και στη συναπτική λειτουργία (Li et al.2009; Vail et al.2016), όπως καθώς και η γλοιακή λειτουργία, όπου πρόσφατα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η παθολογία της γλοίας μπορεί να είναι ο κύριος παράγοντας στην παθολογία της παρεγκεφαλίδας (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus και Wassarman 2012; Weyemi et al.2015). Αυτό το νέο ζωικό μοντέλο παρέχει ένα νέο εργαλείο για τη δοκιμή μηχανιστικών υποθέσεων σχετικά με το πώς η ανεπάρκεια ATM προκαλεί παρεγκεφαλιδική παθολογία και αταξία. Επιπλέον, αυτό το μοντέλο μπορεί να χρησιμεύσει κυρίως ως ένα κρίσιμο προκλινικό εργαλείο για τη δοκιμή υποψήφιων θεραπευτικών υποψηφίων που είχαν προταθεί στο παρελθόν (Browne et al.2004; Chen et al.2003) και των δικών μας ενώσεων SMRT (Du et al. 2013). Οι σοβαροί περιορισμοί της μη ύπαρξης κατάλληλου προκλινικού μοντέλου για θεραπευτικές δοκιμές, ειδικά για σπάνιες διαταραχές όπως η ΑΤ και η ΑΟΑ1, δεν μπορούν να υπερεκτιμηθούν.

4.0 Υλικά και Μέθοδοι

4.1 Δήλωση Δεοντολογίας

Αυτή η μελέτη διεξήχθη αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Ο χειρισμός όλων των ζώων έγινε σύμφωνα με τα εγκεκριμένα πρωτόκολλα της Επιτροπής Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC) στο Ινστιτούτο Lundquist (31374-03,31773-02) και στο UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Πειραμάτων σε Ζώα του Ινστιτούτου Lundquist (Αριθμός διασφάλισης: D16-00213). Καταβλήθηκε κάθε προσπάθεια για να ελαχιστοποιηθεί ο πόνος και η ταλαιπωρία παρέχοντας υποστήριξη όταν ήταν απαραίτητο και επιλέγοντας ηθικά τελικά σημεία.

4.2 Ποντίκια

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>Μετάλλαξη T που βρέθηκε σε μεγάλο πληθυσμό της Βόρειας ΑφρικήςΣΤΟασθενείς using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), αντιγράφοντας το ανθρώπινο AT PTC). Τα γονιδιωματικά αλληλόμορφα στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν σε μια τροποποιημένη έκδοση του φορέα στόχευσης θηλαστικών NorCOMM χρησιμοποιώντας μια αντίδραση 3-way Gateway (Bradley et al. 2012). Οι προκύπτοντες φορείς στόχευσης ηλεκτροδιατρήθηκαν σε κύτταρα C2 ES (C57BI/6N, που προέρχεται από το εργαστήριο A. Nagy, Τορόντο, Καναδάς) και οι επιτυχώς στοχευμένοι κλώνοι ταυτοποιήθηκαν με επιλογή με G418 (Gertsenstein et al.2010). Η ενσωμάτωση της μεταλλαγμένης κασέτας στόχευσης στον τόπο του γονιδίου Atm επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Southern και με ανάλυση αλληλουχίας προϊόντων PCR για να επιβεβαιωθεί η παρουσία της μετάλλαξης Atm PTC, η στόχευση χωρίς σφάλματα στον τόπο Atm και τα λειτουργικά συστατικά χωρίς σφάλματα του

διάνυσμα (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Θετικοί κλώνοι ES χρησιμοποιήθηκαν για έγχυση βλαστοκύστης για να ληφθούν οι διαγονιδιακές γραμμές. Το διαγονιδιακό αλληλόμορφο περιείχε έναν υποκινητή-δέλτα προαγωγέα ανθρώπινης βήτα-ακτίνηςTK1-Νέο cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Εικ.1Α). Ο γονότυπος των δύο γραμμών Atm πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των ακόλουθων εκκινητών σε βαθμό Tm 62 μοιρών. και αντίστροφος(R) εκκινητής γονιδίου Atm: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', δημιουργώντας ένα προϊόν αλληλόμορφου άγριου τύπου 151 bp ή στοχευμένο προϊόν αλληλόμορφων 241 bp (Εικ. 1A, 1B). Atmn35~ και Atm035 οπισθοδιασταύρωση με ποντίκια C57Bl/6J για 9 γενιές (99,2 τοις εκατό ισογονικά) πριν από την κρυοσυντήρηση και την επακόλουθη επαναπαραγωγή χρησιμοποιώντας παρένθετες μητέρες C57BI/6J. Οι Atm735× και Atm?35xand Atm 35×/Q35× ήταν εκτροφείς που λήφθηκαν από ποντίκια F1 αδελφούς Atm35 και Atm835X plus. AtmR35×k35×: και τα δύο βρέθηκαν να είναι γόνιμα. Τα ποντίκια Aptx knockout (Aptx) δημιουργήθηκαν και παρασχέθηκαν στον Dr. Mathews ως έμβρυα από τον Dr. McKinnon (Ahel et al.2006) και στη συνέχεια επαναδημιουργήθηκαν μέσω παρένθετων μητέρων C57Bl/6J. Τα ποντίκια Aptx' βρίσκονται σε μικτό φόντο C57Bl/6 και 129. Atm35k35; Τα ποντίκια Aptx διαφόρων συνδυασμών άγριου τύπου, ετερόζυγων και ομόζυγων δημιουργήθηκαν από το Atm35X. Οι εκτροφείς Aptxt δημιουργήθηκαν με διασταύρωση ποντικών Atm?35×R35 και Aptx^. Μία ομάδα ποντικών διπλών μεταλλαγμένων και αντίστοιχου ελέγχου χρησιμοποιήθηκε στη διαχρονική μελέτη συμπεριφοράς για αναλύσεις βάδισης και δοκιμή SHERPA (Εικ. 2,3). Πολλαπλές πρόσθετες κοόρτες διπλών μεταλλαγμένων και ποντικών ελέγχου ταιριασμένων με την ηλικία χρησιμοποιήθηκαν για ηλεκτροφυσιολογικά, ανοσοϊστολογικά και πειράματα δοκιμής κάθετου πόλου (Εικ. 4, 7). Πειράματα ανοσολογικής έκφρασης και πρωτεϊνικής έκφρασης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ποντικούς που εκτράφηκαν από τους αρχικούς ποντικούς AtmR35× και Atm35× που επαναλήφθηκαν (Εικ. 5, 6 και 8). Ο γονότυπος πραγματοποιήθηκε από δείγματα ιστού αυτιού ποντικών P8-11. Χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι PCR πραγματικού χρόνου που πραγματοποιήθηκαν από την Transnetyx Inc. για τον προσδιορισμό του γονότυπου κάθε ζώου. Τα ζώα έγιναν αναγνωρίσιμα μέσω τατουάζ στα δάχτυλα των ποδιών που δόθηκαν ταυτόχρονα με τη βιοψία αυτιού. Μοναδικοί εκκινητές για Atm35x και Atm35x ποσοτικοποιήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση άγριου τύπου, ετερόζυγων και ομόζυγων ποντικών (αναφέρονται παραπάνω). Οι εκκινητές Aptx' και Aptx*" χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των γονότυπών τους.

4.3 Υγεία των ζώων

Τα ζώα ζυγίστηκαν μέσω ψηφιακής ζυγαριάς σε P8, 45, 120,210,400. Ο θάνατος του ζώου καταγράφηκε ως η ημέρα που βρέθηκε νεκρό ή την ημέρα της ευθανασίας όταν τα ζώα έφτασαν σε ένα μη βάναυσο τελικό σημείο (ζώο δεν μπορούσε να διορθωθεί στη δεκαετία του '60, σημαντικό τρίχωμα που υποδηλώνει έλλειψη αυτο-περιποίησης ή υπερβολική αγωνία, όπως σημειώνει ο κτηνίατρος προσωπικό). Τα πτώματα των ζώων καταψύχθηκαν αμέσως μετά το θάνατο και οι νεκροτομές πραγματοποιήθηκαν κατά παρτίδες. Η πιθανή αιτία θανάτου προσδιορίστηκε στο μέγιστο των δυνατοτήτων μας σε συνεργασία με τον κτηνίατρο του προσωπικού (Dr. Catalina Guerra) με οπτικό έλεγχο των εσωτερικών οργάνων. Μερικά ποντίκια κανιβαλίστηκαν ή απορρίφθηκαν κατά λάθος από το προσωπικό του vivarium

Ως εκ τούτου επισημάνθηκαν ως "αγνοούμενοι". Τα ποντίκια χωρίς ευδιάκριτη οπτική αιτία θανάτου χαρακτηρίστηκαν "απροσδιόριστα." Τα ποντίκια που βρέθηκαν με θωρακικές μάζες κοντά στο σημείο που θα βρισκόταν κανονικά ο θύμος σε νεαρά ποντίκια αναφέρθηκαν ως με "καρκίνο του θύμου". Όλα τα άλλα ταυτοποιήθηκαν Οι πιθανές αιτίες θανάτου (π.χ. μεγέθυνση ήπατος, απόφραξη ούρων) χαρακτηρίστηκαν "άλλα".

4.4 Συμπεριφορά

Πριν από τη διεξαγωγή οποιουδήποτε τεστ συμπεριφοράς, τα ποντίκια εγκλιματίστηκαν στη σουίτα συμπεριφοράς για ~20 λεπτά. Τα ποντίκια δοκιμάστηκαν σε διάφορες ώρες της ημέρας, σύμφωνα με τον ημερήσιο κύκλο τους. Πραγματοποιήθηκε μια σειρά δοκιμών συμπεριφοράς σε αφελή διπλά μεταλλαγμένα ποντίκια των υποδεικνυόμενων γονότυπων σε διάφορα χρονικά σημεία ανάλογα με τη συμπεριφορά αλλά στην ίδια κοόρτη ποντικών. Η μπαταρία των δοκιμών περιελάμβανε την αξιολόγηση βάδισης Catwalk (P45, 120,210, 400) και ένα υποσύνολο των τεστ SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College και Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 και 400). Αυτές οι δοκιμές διεξήχθησαν από το UCLA Behavioral Core. Τα διπλά μεταλλαγμένα ποντίκια και τα ποντίκια ελέγχου εξετάστηκαν επιπρόσθετα στη δοκιμή του κάθετου πόλου. Όλες οι συσκευές συμπεριφοράς σκουπίστηκαν με αιθανόλη (70 τοις εκατό) μεταξύ κάθε υποκειμένου δοκιμής.

Ανάλυση βάδισης

Χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα ανάλυσης βάδισης Noldus Catwalk σχεδιασμένο να μετράει και να αναλύει ημιαυτόματα το βάδισμα των ποντικών κατά τη διάρκεια της κανονικής περιπάτου. Εν συντομία, η κίνηση των ποντικών σε έναν διάδρομο με γυάλινο πυθμένα καταγράφεται βίντεο από μια κεντρική θέση. Τα αποτυπώματα των ποδιών επισημαίνονται στο βίντεο λόγω του φωτισμού σε όλη τη γυάλινη πλατφόρμα περπατήματος. Κάθε βήμα του ποντικιού μέσα σε ένα βίντεο εντοπίζεται στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το Catwalk XT (Noldus) με ημι-αυτόματο τρόπο. Ένα τρέξιμο για κάθε ποντίκι αποτελείται από 3 δοκιμές συνεπούς περιπλάνησης σε όλη την παρακολουθούμενη πλατφόρμα. Γίνονται αποδεκτές μόνο συνεπείς δοκιμές και τα ποντίκια ενδέχεται να χρειαστούν έως και 10 προσπάθειες για να ολοκληρώσουν 3 δοκιμές που συμμορφώνονται προς οποιαδήποτε κατεύθυνση κατά μήκος του διαδρόμου. Οι συμμορφούμενες δοκιμές ορίστηκαν ως εκείνες με κίνηση κατά μήκος της πλατφόρμας κάτω από 5 δευτερόλεπτα και με διακύμανση ταχύτητας όχι μεγαλύτερη από 60 τοις εκατό. Μόλις τοποθετηθούν στην πλατφόρμα, τα ποντίκια έτρεχαν γενικά μπρος-πίσω χωρίς να χρειάζεται να ζητηθεί από τον πειραματιστή.

Κάθετος πόλος

Τα ποντίκια τοποθετούνται στην κορυφή ενός μπουλονιού ύψους 80 cm με τη μύτη τους προς τα κάτω και τα πίσω πόδια τους όσο το δυνατόν πιο κοντά στην κορυφή. Τα ποντίκια απελευθερώνονται αμέσως και ο χρόνος ξεκίνησε αμέσως μετά την τοποθέτηση.

Ο χρόνος σταματά όταν το πρώτο μπροστινό πέλμα αγγίξει την επιφάνεια κάτω από τον στύλο. Η φυσική προτίμηση ενός ποντικιού είναι να κατέβει αμέσως στον πόλο και του δίνονται έως και 60s για να διασχίσουν τον πόλο, διαφορετικά, βοηθούνται να βγουν από τον πόλο. Σε μια μη ολοκληρωμένη δοκιμή δίνεται αυτόματα χρόνος 30 δευτερολέπτων, καθώς το 95 τοις εκατό των ποντικών που δεν κατέβηκαν εντός 30 δευτερολέπτων εξακολουθούσαν να βρίσκονται στον πόλο στη δεκαετία του '60. Οι δοκιμές συμπεριφοράς SHIRPA διεξήχθησαν από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, στο Λος Άντζελες, στο P30

και P400. Όλες οι παράμετροι βαθμολογούνται για να παρέχουν μια ποσοτική αξιολόγηση. που επιτρέπει τη σύγκριση των αποτελεσμάτων τόσο σε βάθος χρόνου όσο και μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων. Κάθε ποντίκι δοκιμάστηκε διαδοχικά σε όλες τις συμπεριφορές εντός ~20-λεπτού χρονικού διαστήματος πριν προχωρήσουμε στο επόμενο ποντίκι. Ο πειραματιστής τυφλώθηκε ως προς τον ζωικό γονότυπο. Η οθόνη εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Rogers et al. 1997).

Παρατήρηση συμπεριφοράς

Η κύρια οθόνη παρέχει ένα προφίλ παρατήρησης συμπεριφοράς και η αξιολόγηση κάθε ζώου ξεκινά με την παρατήρηση της αδιατάρακτης συμπεριφοράς σε ένα βάζο προβολής (διάμετρος 10 cm) για 5 λεπτά. Εκτός από τις βαθμολογημένες συμπεριφορές της θέσης του σώματος, της αυθόρμητης δραστηριότητας, του ρυθμού αναπνοής και του τρόμου, ο παρατηρητής καταγράφει τυχόν περιπτώσεις περίεργης ή στερεότυπης συμπεριφοράς και σπασμών, ψυχαναγκαστικού γλείψιμο, αυτοκαταστροφικού δαγκώματος και ανάδρομης ώθησης (βάδισμα προς τα πίσω) και ενδείξεις χωρικής αποπροσανατολισμός.

Συμπεριφορά Αρένα

Στη συνέχεια, το ποντίκι μεταφέρεται στην αρένα (30 cm x 50 cm) για έλεγχο διέγερσης μεταφοράς και παρατήρηση φυσιολογικής συμπεριφοράς. Η αρένα είναι σημειωμένη σε ένα πλέγμα τετραγώνων 10 x 10 cm² για τη μέτρηση της κινητικής δραστηριότητας εντός περιόδου 30 s. Ενώ το ποντίκι είναι ενεργό στην αρένα, καταγράφονται μέτρα απόκρισης ξαφνιάσματος, βάδισης, ανύψωσης της λεκάνης και ανύψωσης της ουράς.

Ανάσκεψη σε ύπτια θέση

Το ζώο συγκρατείται σε ύπτια θέση για καταγραφή αυτόνομων συμπεριφορών. Κατά τη διάρκεια αυτής της αξιολόγησης, αξιολογήθηκαν η δύναμη λαβής, ο τόνος του σώματος, το αντανακλαστικό πτερυγίου, το αντανακλαστικό του κερατοειδούς, το τσίμπημα των δακτύλων, ο ελιγμός σύρματος και ο καρδιακός ρυθμός.

Ισορροπία και Προσανατολισμός

Τέλος, πραγματοποιήθηκαν αρκετές μετρήσεις της λειτουργίας του αιθουσαίου συστήματος. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές αντανακλαστικού ανόρθωσης, αντανακλαστικού ανόρθωσης επαφής και αρνητικού γεωτάξου. Σε όλη αυτή τη διαδικασία καταγράφηκαν φωνές, ούρηση και γενικός φόβος, ευερεθιστότητα ή επιθετικότητα.

Εξοπλισμός που χρησιμοποιείται

1.Καθαρή αρένα Plexiglas (εσωτερικές διαστάσεις κατά προσέγγιση 55x33 x18 cm). Στο πάτωμα της αρένας υπάρχει ένα φύλλο πλεξιγκλάς με 15 τετράγωνα (11 cm). Ένα άκαμπτο οριζόντιο σύρμα (διάμετρος 3 mm) είναι στερεωμένο στην πίσω δεξιά γωνία έτσι ώστε τα ζώα να μην μπορούν να αγγίξουν τις πλευρές κατά τη διάρκεια του ελιγμού του σύρματος. Ένα πλέγμα (40x 20 cm) με πλέγμα 12 mm (κατά προσέγγιση) είναι στερεωμένο σε όλο το πλάτος του κουτιού για τη μέτρηση της συμπεριφοράς της ανάρτησης της ουράς και της αντοχής στο κράτημα. 2. Ένας διαφανής κύλινδρος από πλεξιγκλάς (15 x ll cm) χρησιμοποιήθηκε ως βάζο προβολής. 3. Ένα δικτυωτό δάπεδο (40x20 εκ.) με πλέγματα 12 mm στα οποία στέκονται τα βάζα προβολής.4. Τέσσερα κυλινδρικά στηρίγματα από ανοξείδωτο χάλυβα (μήκος 3 cm x διάμετρος 2,5 cm) για ανύψωση πλέγματος από τον πάγκο. 5. Μία τετράγωνη πλάκα (13 cm) από ανοξείδωτο χάλυβα για τη μεταφορά των ζώων στην αρένα. 6. Κόψτε μήκη 3/0 Mersilk που κρατήθηκε στη λαβίδα για αντανακλαστικές δοκιμές κερατοειδούς και πτερυγίου 7. Μια πλαστική ράβδος πείρου ακονίστηκε σε σημείο μολυβιού για να δοκιμάσετε τη σιελόρροια και το δάγκωμα.8. Ένα ζευγάρι λαβίδες εξοπλισμού ανατομής, κυρτές με λεπτές αιχμές (λαβίδα 125 mm, Philip Harris Scientific, Cat. No. D46-174), για το τσίμπημα του δακτύλου. 9.Ένα χρονόμετρο.10. Ένα πλαίσιο κλικ IHR χρησιμοποιείται για τον έλεγχο των αποκρίσεων ξαφνιάσματος. Το Click Box παράγει έναν σύντομο τόνο 20 kHz στα 90dB SPL όταν κρατιέται 30 cm πάνω από το ποντίκι. Επικοινωνήστε με τον καθηγητή KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Ένας χάρακας.12.Ένας διαφανής σωλήνας από πλεξιγκλάς 30 cm με εσωτερική διάμετρο 2,5 cm για το αντανακλαστικό ανόρθωσης επαφής.4.5 Ηλεκτροφυσιολογία Παρασκευή οξείας παρεγκεφαλιδικής φέτας Χαριτωμένες παραοβελιακές φέτες πάχους 300 μm παρασκευάστηκαν από την παρεγκεφαλίδα πειραματικού και ποντικού ελέγχου ακολουθώντας δημοσιευμένες μεθόδους (Hansen et al., 2013). Εν συντομία, η παρεγκεφαλίδα απομακρύνθηκε γρήγορα και βυθίστηκε σε ένα παγωμένο εξωκυτταρικό διάλυμα με τη σύνθεση (mM): 119 NaCl, 26 NaHC0g, 11 γλυκόζη, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla και 1 NaHzPOa, pH7,4 όταν αέριο με 5 τοις εκατό CO-/95 τοις εκατό O2. Η παρεγκεφαλίδα τεμαχίστηκε παραοβελιαία χρησιμοποιώντας δονητή (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Γερμανία) και αρχικά επωάστηκαν στους 35 βαθμούς για-30 λεπτά και στη συνέχεια εξισορροπήθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι τη χρήση. Εξωκυτταρική Ηλεκτροφυσιολογία Εξωκυτταρικές και ενδοκυτταρικές καταγραφές ελήφθησαν από νευρώνες Purkinje (PNs) σε φέτες που διαχέονται συνεχώς με ένα εξωκυτταρικό διάλυμα με φυσαλίδες άνθρακα και διατηρούνται είτε στους 37 βαθμούς C (εξωκυτταρική) είτε στους 32 βαθμούς (ενδοκυτταρικοί)± 1 βαθμό (βλ. παραπάνω). Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν με οπτικά DIC και αντικειμενικό φακό εμβάπτισης στο νερό 40× (NA 0,75) χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Zeiss Examiner. Γυάλινες πιπέτες αντίστασης ~3 MQ (Μοντέλο P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) γεμίστηκαν με εξωκυτταρικό διάλυμα και τοποθετήθηκαν κοντά σε λοφίσκους άξονα PN προκειμένου να μετρηθούν μεταβατικά ρεύματα χωρητικού ρεύματος που σχετίζονται με το δυναμικό δράσης σε λειτουργία σύσφιξης τάσης με το δυναμικό πιπέτας να διατηρείται στα 0 mV. Για καταγραφές με έμπλαστρο ολόκληρων κυττάρων, οι πιπέτες γεμίστηκαν με ένα ενδοκυτταρικό διάλυμα (mM): 140 μήνες (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 φωσφοκρεατίνη (τρις άλας), 1 Mg, 1 Mg, EGTA4, -ATP, 0,4 Na-GTP. Προστέθηκε 100 μM Picrotoxin (Sigma) για να μπλοκάρει τις ανασταλτικές συναπτικές εισροές GABAegeric. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με χρήση

ένας ενισχυτής MultiClamp 700B στα 20 ή 100 kHz σε λειτουργία σύσφιξης τάσης ή ρεύματος, Digidata 1440 με pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) και φιλτραρισμένο στα 2 έως 4 kHz. Η αντίσταση σειράς ήταν συνήθως μεταξύ 10 και 15 MQ. Η αντίσταση της σειράς αντισταθμίστηκε στο 80 τοις εκατό μόνο για βραχυπρόθεσμα πειράματα πλαστικότητας. Για τις εξωκυτταρικές καταγραφές, καταγράφηκαν συνολικά 20 έως 45 PN για κάθε ζώο σε όλους τους γονότυπους, τα φύλα και τις ηλικιακές ομάδες. Οι καταγραφές διανεμήθηκαν τόσο στον έσω-πλάγιο όσο και στον ροστροουραίο άξονα της παρεγκεφαλίδας. Εξετάστηκαν μόνο κύτταρα με "υγιή" εμφάνιση (χαμηλή αντίθεση των κυτταρικών ορίων) και κανονικό, αδιάλειπτο ρυθμό πυροδότησης. Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, μερικά κύτταρα βρέθηκαν να είχαν κενά στην πυροδότηση άνω των 2 δευτερολέπτων και αυτά τα κύτταρα εξαλείφθηκαν από την ανάλυση, καθώς αυτός ο τύπος πυροδότησης σχετίζεται με το ότι είναι "ανθυγιεινός". Ο διπλός μεταλλαγμένος ιστός δεν διέφερε ποιοτικά σε εμφάνιση κάτω από μικροσκόπιο DIC πριν από τις καταγραφές, ούτε ο αριθμός των "ανθυγιεινών" κυττάρων ήταν μεγαλύτερος από αυτόν άλλων γονότυπων (7 τοις εκατό έναντι 4 έως 11 τοις εκατό όλων των κυττάρων σε όλους τους γονότυπους ελέγχου στο P400). Η χωρική σύγκριση της νευρικής δραστηριότητας λήφθηκε με καταγραφή από σειριακές τομές στο κροκίδωμα, τις πλευρικές (2"d ή 3'), τις ενδιάμεσες (6" ή 7η) και τις μεσαίες (11" ή 12t) φέτες. Οι φέτες με μικρότερο αριθμό χρησιμοποιήθηκαν σε οι νεότερες ηλικιακές ομάδες (P45 και 110) για να αντιστοιχούν χονδρικά στη σχετική θέση των εγγραφών μεταξύ των ηλικιακών ομάδων. 0-3 εγγραφές έγιναν από κάθε λοβό μέσα σε κάθε φέτα ανάλογα με την ποιότητα και την υγεία του ιστού. Κάθε εγγραφή διήρκεσε για {{29} Χρησιμοποιήθηκαν 3 έως 5 ποντίκια για κάθε ηλικιακή ομάδα και ο πειραματιστής τυφλώθηκε ως προς τον γονότυπο, την ηλικία και το φύλο.

Ελήφθησαν ενδοκυτταρικές καταγραφές από PNs είτε στο λοβό IIl είτε στο VIl της έσω παρεγκεφαλίδας (δηλαδή, vermis). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικές διαφορές στις ιδιότητες μεταξύ των λοβών.

Αναλύει

Τα διαστήματα αυθόρμητης δράσης μεταξύ ερεθισμάτων ανιχνεύθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τυπικές και προσαρμοσμένες ρουτίνες στο ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) και Excel (Microsoft). Συγκεκριμένα, εντοπίστηκαν κατώφλι δυναμικών ενεργειών και τα στατιστικά στοιχεία αιχμής (δηλαδή, συχνότητα και μήκος διαστήματος) καθορίστηκαν dusingadaptedlgorProroutines(TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Ο συντελεστής διακύμανσης του μέσου διαστήματος μεταξύ των ακίδων (CV) και του διάμεσου διαστήματος μεταξύ των ακίδων (CV2=2 ISIn συν 1-ISInl/(ISIn συν 1 συν ISIn)) υπολογίστηκαν στο Excel χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες μακροεντολές. Οι τυπικές ιδιότητες της μεμβράνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας lgorPro. Το RM προσδιορίστηκε με τον υπολογισμό του μέσου όρου των αποκρίσεων ίχνους τάσης 3 σε έναν παλμό βήματος -5 mV από ένα δυναμικό συγκράτησης -80 mV και μετρώντας την προκύπτουσα απόκλιση ρεύματος μεταξύ 900 και 1000 ms μετά την έναρξη. Η χρονική σταθερά της μεμβράνης μετρήθηκε με την προσαρμογή μιας μοναδικής εκθετικής στην αρχική φάση αποσύνθεσης από 90 τοις εκατό έως 10 τοις εκατό της κορυφής. Το CM υπολογίστηκε διαιρώντας τη σταθερά χρόνου της μεμβράνης με το RM. Τα γεγονότα sEPSC καταγράφηκαν σε μια περίοδο 1-λεπτών και ανιχνεύθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Neuroexpress (v21.1.13). Παράλληλοι και αναρριχούμενοι άξονες ινών διεγέρθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια θήτα γυαλιού (WPI) και έναν απομονωτή ερεθίσματος ελεγχόμενου με TTL (ISO-Flex, AMPI). Τα προκλητά πλάτη EPSC και οι σταθερές χρόνου αποσύνθεσης (1 επέκταση για παράλληλες και 2 εκ. για αναρριχητικές ίνες) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες ρουτίνες στο lgorPro. Τα δυναμικά δράσης εξετάστηκαν ως μέρος ενός συνόλου ενέσεων ρεύματος 1 δευτερολέπτου μεταξύ -500 και 2250 pA (βήματα 250 pA) με ρεύμα συγκράτησης ρυθμισμένο ώστε να διατηρείται ένα δυναμικό ~70 mV. Οι κυματομορφές του δυναμικού δράσης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένο

ρουτίνες στο lgorPro. Ως κατώφλι δυναμικού δράσης ορίστηκε η πρώτη τάση μεμβράνης στην οποία το πρώτο παράγωγο ξεπέρασε τα 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Εξέταση Παρεγκεφαλιδικής Ατροφίας

Μέγεθος παρεγκεφαλίδας Αμέσως μετά την αφαίρεση του εγκεφάλου από το κρανίο, λήφθηκε μια ραχιαία, ολόκληρη εικόνα. Οι εικόνες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χρήση των Φίτζι (NIH). Τα μεγέθη του πρόσθιου εγκεφάλου και της παρεγκεφαλίδας αξιολογήθηκαν περιγράφοντας το 2-διαστατικό τους χώρο και στη συνέχεια υπολογίζοντας την περιοχή. Κανονικοποιήσαμε για πιθανές διαφορές στο συνολικό μέγεθος του εγκεφάλου διαιρώντας τα αποτελέσματα της παρεγκεφαλίδας με το μέγεθος του πρόσθιου εγκεφάλου για να παραχθεί μια σχετική αναλογία παρεγκεφαλίδας προς πρόσθιο εγκέφαλο. Οι πειραματιστές ήταν τυφλοί ως προς τον γονότυπο του ζώου. Ανοσοϊστοχημεία Στα αντίστοιχα τελικά σημεία της μελέτης (P45, 120,210,4{{7{{1{04}}}}0), αρσενικά και θηλυκά ποντίκια όλων των γονότυπων που αντιπροσωπεύτηκε σε αυτή τη μελέτη αναισθητοποιήθηκε με ισοφλουράνιο και υποβλήθηκε σε διακαρδιακή έγχυση με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά, ακολουθούμενο από παραφορμαλδεΰδη ρυθμισμένου διαλύματος 4 τοις εκατό (w/v) και στη συνέχεια ανατέμθηκε για να εξαχθεί ο εγκέφαλος. Εικόνες ολόκληρου του εγκεφάλου λήφθηκαν αμέσως μετά την αφαίρεση του εγκεφάλου από το κρανίο και οι εγκέφαλοι στη συνέχεια βυθίστηκαν σε 4 τοις εκατό PFA για 24 ώρες και στη συνέχεια κρυοπροστατεύτηκαν σε αλατούχο διάλυμα Tris-ρυθμιστικού διαλύματος (TBS) με 0,05 τοις εκατό αζίδιο και 30 τοις εκατό σακχαρόζη για 72 ώρες και αποθηκεύεται στους 4 βαθμούς μέχρι περαιτέρω χρήση. Η παρεγκεφαλίδα διαχωρίστηκε από τον πρόσθιο εγκέφαλο και τεμαχίστηκε παραοβελιαία χρησιμοποιώντας έναν ολισθαίνοντα μικροτόμο (Microm HM 430, Thermo Scientific) σε τομή σε πάχος 40 μm. Τομές παρεγκεφαλίδας συλλέχθηκαν σε μια σειρά από έξι και αποθηκεύτηκαν σε TBS-AF (TBS με 30 τοις εκατό σακχαρόζη, 0,05 τοις εκατό αζίδιο του νατρίου και 30 τοις εκατό αιθυλενογλυκόλη) στους 4 βαθμούς ή -20 βαθμούς μέχρι περαιτέρω χρήση. Για οπτικοποίηση ανοσοφθορισμού νευρώνων Purkinje, τομές παρεγκεφαλίδας και των δύο Atm*. Aptx*t και Atm?35×R35×; Το Aptx^(n=5 ανά γονότυπο) πλύθηκε για 5 λεπτά σε TBS τρεις φορές και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε σε 15 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά ακολουθούμενη από επώαση ελεύθερης επίπλευσης σε κουνέλι ή ποντίκι anti-calbindin D -28k (1:1000)για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε τροχιακό αναδευτήρα. Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν για 5 λεπτά με TBS τρεις φορές, και ακολούθησε επώαση ελεύθερης επίπλευσης σε κατσίκα αντι-κουνελιού ή ποντικού Alexa Fluor 488 (1:1000) για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου σε τροχιακό αναδευτήρα. Μετά από δευτερεύουσα επώαση αντισώματος, οι τομές πλύθηκαν για 5 λεπτά σε TBS τρεις φορές, στη συνέχεια τοποθετήθηκαν και γλιστρήθηκαν με Fluoromount-G με DAPI. Για ορισμένες τομές, αντισώματα αντι-διασπασμένης κασπάσης-3(1:200) και αντι-CD68(1:400) διερευνήθηκαν επιπλέον παράλληλα με το Calbindin χρησιμοποιώντας ένα δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor 647 (1:500). Οι διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας Stereo Investigator (MBF Bioscience, έκδοση 2020) σε μικροσκόπιο Zeiss εξοπλισμένο με ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό 2,5, 10, 20, 40 ή 63x και εικόνες καταγράφηκε με μια κάμερα Hamamatsu CMOS (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Για να ποσοτικοποιήσουμε τον αριθμό των αντιδρώντων στην καλμπινδίνη κυττάρων σε κάθε λοβό στις προκύπτουσες εικόνες, χρησιμοποιήσαμε το Stereo Investigator για να σχεδιάσουμε τυχαία 2 γραμμές μήκους μεταξύ 300 και 500 μm. κάθε λοβό και μέτρησε χειροκίνητα τον συνολικό αριθμό των PN κατά μήκος εντός του πάχους 40 um της τομής ιστού υπό μεγέθυνση 40x. Στη συνέχεια έγινε πυκνότητα 2D (# PNs/(γραμμικό μήκος* πάχος 40 um)) των δύο δειγμάτων ανά λοβό ο μέσος όρος για περαιτέρω σύγκριση μεταξύ λοβίων και ζώων. Τα πλάτη του θετικού ΡΝ δενδρίτη καλμπινδίνης μετρήθηκαν σε μια προκαθορισμένη θέση στον λοβό VI από κάθε ζώο σε τομές ιστού πάχους 25 ή 40 μm υπό μεγέθυνση 20x. Τα δενδριτικά πλάτη του πρωτεύοντος και του δευτερεύοντος κλάδου μετρήθηκαν στη μέση γραμμή μεταξύ των σωμάτων των κυττάρων ΡΝ και της άκρης της μοριακής στιβάδας. Μετρήθηκαν μεταξύ 7 και 13 δενδρίτες ανά τομή, ένα τμήμα ανά ζώο. Για σωματικές μετρήσεις PN, χρησιμοποιήθηκε Stereo Investigator για την τυχαία επιλογή PN που κατανέμονται σε ολόκληρο το μεσαίο τμήμα υπό μεγέθυνση 20x. Το μέσο πλάτος PN ανά ζώο προσδιορίστηκε με βάση τα αποτελέσματα σε 3 σειριακές τομές (16 έως 37 PN ανά τομή). Τα πλάτη PN μετρήθηκαν κάθετα στο στρώμα PN ή στον εξερχόμενο δενδρίτη, εάν είναι λοξός, κατά περισσότερο από μερικές μοίρες. Τα πλάτη του μοριακού στρώματος και του κυττάρου στρώματος (που απεικονίζονται με κηλίδες Calbindin και DAPI, αντίστοιχα) αξιολογήθηκαν στο Stereo Investigator υπολογίζοντας κατά μέσο όρο δύο μετρήσεις πλάτους σε προκαθορισμένες θέσεις για κάθε λοβό, περίπου στα μισά του δρόμου μαζί με τη μεγάλη έκταση κάθε λοβού κάτω από μεγέθυνση 2,5x. CD68 Η θετικότητα στις τομές της παρεγκεφαλίδας ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της συνολικής εκατοστιαίας επιφάνειας του CD68 συν θετική χρώση σε ολόκληρη την έσω παρεγκεφαλιδική τομή. 10x ραμμένες εικόνες προσδιορίστηκαν στον αρνητικό έλεγχο και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ, ένα τμήμα ανά ζώο. Για να ποσοτικοποιήσουμε το ποσοστό των θετικών στο Calbindin PNs που ήταν θετικά για διασπασμένη Κασπάση-3 μετρήσαμε τα PN σε ολόκληρη την παρεγκεφαλίδα χρησιμοποιώντας το Stereo Investigator. Εξετάστηκαν τρεις ραμμένες εικόνες μεγέθυνσης 20x ανά ζώο και ελήφθη ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων. Το όριο για τη θετικότητα της κασπάσης-3 καθορίστηκε από τομές ελέγχου που χρωματίστηκαν μόνο με τα δευτερεύοντα αντισώματα. Για μη φθορίζουσα ιστολογική ανάλυση, 25-τομές ιστού πάχους, ελεύθερα επιπλέουσες σε θετικά φορτισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες και στέγνωσαν στον αέρα όλη τη νύχτα. Ο ιστός πλύθηκε σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) δύο φορές για 5 λεπτά, στη συνέχεια χρωματίστηκε διαδοχικά με 0,1 τοις εκατό αιματοξυλίνη σε 95 τοις εκατό αιθανόλη για ~ 25 δευτερόλεπτα και 0,5 τοις εκατό ηωσίνη σε 95 τοις εκατό αιθανόλη για περίπου 3 δευτερόλεπτα και πλύθηκε σε διπλά απεσταγμένο νερό μετά κάθε λεκέ. Ο ιστός στη συνέχεια αφυδατώθηκε για 1 λεπτό σε πλύσεις 95 τοις εκατό αιθανόλης, 100 τοις εκατό αιθανόλης και 100 τοις εκατό ξυλενίου και στη συνέχεια καλύφθηκε με Permount. Οι διαφάνειες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας έγχρωμη κάμερα (Q Imaging, MBF Biosciences) στο ίδιο μικροσκόπιο Zeiss και λογισμικό λήψης MBF. Οι πειραματιστές τυφλώθηκαν ως προς τον γονότυπο του ποντικού στον οποίο εξετάστηκαν οι τομές και η σειρά της εξέτασης παρεμβλήθηκε για όλες τις ιστολογικές μετρήσεις.

4.7 Μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων του αίματος και του θύμου αδένα πραγματοποιήθηκε με χρώση με ειδικά αντισώματα κατά ποντικού∶CD4, CD8, CD3, CD44 και CD25. Εν συντομία, δείγματα ολικού αίματος (50 μ) χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα επισημασμένα με φθορισμό, στη συνέχεια τα ερυθρά αιμοσφαίρια λύθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα λύσης BD ενώ τα ζωντανά λευκά αιμοσφαίρια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας μια χρώση βιωσιμότητας. Το θυμάρι διαχωρίστηκε μηχανικά. 1 έως 2 εκατομμύρια κύτταρα θύμου χρωματίστηκαν παρομοίως χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα για CD4, CD8, CD44 και CD25. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση των ανοσοχρωματισμένων λευκών αιμοσφαιρίων ή δειγμάτων θύμου αδένα χρησιμοποιώντας FACS ARIA l και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (Sanghez et al. 2017).

4.8 Western BIots

Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα (κύτταρα/ιστοί) ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με δοκιμασία ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA) (150 mM NaCl, 1 τοις εκατό Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 τοις εκατό δεοξυχολικό,0,1 τοις εκατό SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) με αναστολείς πρωτεάσης (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml λευπεπτίνη, 5 ug/ml πεπστατίνη, 5 ug/ml χυμοτρυψίνη, 10 ug/ml απρωτινίνης). Τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπερήχους και στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στις 13,{17}} rpm για 15 λεπτά στους 4°C. Η δοκιμασία πρωτεΐνης BCA χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των συγκεντρώσεων πρωτεΐνης. Δείγματα που περιείχαν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης 50 έως 100 ug ανά λωρίδα διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας προκατασκευασμένα πηκτώματα TGX 4 έως 12 τοις εκατό βαθμίδωσης BioRad και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν με σύστημα TransBlot Semi-Dry BioRad χρησιμοποιώντας συσκευασία μεταφοράς Nitrocellulose. Τα μεταφερθέντα στυπώματα χρωματίστηκαν με χρώση Ponceau S για ίση φόρτωση πρωτεΐνης και στη συνέχεια πλύθηκαν και μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό μη λιπαρό ξηρό γάλα σε TBST για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν με ανακίνηση όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Ανιχνεύθηκαν κηλίδες για τα ακόλουθα αντισώματα: ATM (D2E2) Σηματοδότηση κυττάρου mAb κουνελιού, σε αραίωση 1:1000, -Σηματοδότηση κυττάρου mAb ακτίνης (D6A8), σηματοδότηση κυττάρου mAb κουνελιού, GAPDH (D16H11) σηματοδότηση κυττάρου mAb κουνελιού που ακολουθείται από την κατάλληλη υπεροξειδωμένη ιπποκάση HRP)δευτερογενές Anti-rabbit, Anti-mouse για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πολλαπλές πλύσεις με TBST, η έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε από το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας Radiance Plus χρησιμοποιώντας τα συστήματα απεικόνισης Azure c400 και BioRad ChemiDoc. Η πυκνομετρική ανάλυση του ΑΤΜ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα με 2 τεχνικά και 2-3 βιολογικά αντίγραφα όπως υποδεικνύεται.

4.9 Στατιστική Αξιολόγηση

Ο αριθμός των ζώων που επιλέχθηκαν για κάθε ομάδα βασίστηκε σε εκ των προτέρων αναλύσεις ισχύος χρησιμοποιώντας το GPower v3.1 με βάση μέγεθος 0.5, ισχύ 0.8 και μεγέθη επίδρασης που εκτιμήθηκαν από προκαταρκτικά δεδομένα ή προηγούμενες μελέτες. Χρησιμοποιήσαμε τόσο παραμετρική (1-και 2-τρόπο ANOVA) για κανονικά κατανεμημένες και μη παραμετρικές στατιστικές μεθόδους (Kruskal Wallace) για δεδομένα διαστήματος για να ελέγξουμε διαφορές μεταξύ των ομάδων ακολουθούμενα από δοκιμές πολλαπλών συγκρίσεων ανά ζεύγη, όπως υποδεικνύεται στο το κείμενο. Outliers για δεδομένα ανοσίας στα Σχ. Το 6 και το 7 εξαιρέθηκαν μέσω της μεθόδου ROUT (Q=2 τοις εκατό ). Οι συγκεκριμένες αναλύσεις που χρησιμοποιούνται για κάθε σύνολο δεδομένων σημειώνονται σε κάθε υπόμνημα του σχήματος. Για όλα τα ψηφία: ns μη σημαντικά,*p Μικρότερο ή ίσο με 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">