Ένα γρήγορο και απλό πρωτόκολλο καθαρισμού και διόγκωσης για τρισδιάστατη επί τόπου απεικόνιση του νεφρού σε όλη την κλίμακα

edmund.chen@wecistanche.com

Τα τελευταία χρόνια, πολλά πρωτόκολλα φωτομικροσκοπίας έχουν δημοσιευτεί για την οπτικοποίηση δομών νανοκλίμακας στονεφρό.Αυτά τα πρωτόκολλα παρουσιάζουν στους ερευνητές νέα εργαλεία για την αξιολόγηση τόσο της ανατομίας της διαδικασίας του ποδιού όσο και της εξάλειψης, καθώς και της κατανομής πρωτεϊνών στις διεργασίες του ποδιού, στο διάφραγμα της σχισμής και στη σπειραματική βασική μεμβράνη. Ωστόσο, αυτά τα πρωτόκολλα είτε περιλαμβάνουν την εφαρμογή διαφορετικών πολύπλοκων μικροσκοπίων υπερ-ανάλυσης είτε μακροσκελή πρωτόκολλα προετοιμασίας δειγμάτων. Εδώ, παρουσιάζουμε μια γρήγορη και απλή διαδικασία πέντε ωρών για τρισδιάστατη απεικόνισηνεφρόμορφολογία σε όλες τις κλίμακες μήκους. Το πρωτόκολλο συνδυάζει έννοιες οπτικού καθαρισμού και επέκτασης ιστού για να δημιουργήσει μια ήπια διόγκωση, επαρκή για την επίλυση δομών νανοκλίμακας χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό ομοεστιακό μικροσκόπιο. Δείχνουμε ότι το πρωτόκολλο μπορεί να εφαρμοστεί για να απεικονίσει μια μεγάλη ποικιλία παθολογικών χαρακτηριστικών τόσο σε ποντίκι όσο και σε άνθρωπονεφρά. Έτσι, το γρήγορο και απλό πρωτόκολλό μας μπορεί να είναι ευεργετικό για τη συμβατική μικροσκοπική αξιολόγησηνεφρόακεραιότητα ιστού τόσο στην έρευνα όσο και πιθανώς στις μελλοντικές κλινικές ρουτίνες.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Πολυάριθμα οπτικά πρωτόκολλα για την απεικόνιση δομών νανοκλίμακας στονεφρόέχουν παρουσιαστεί τα τελευταία χρόνια.I- Η δύναμη αυτών των νέων τεχνικών ως εργαλείων για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ανατομίας και της παθολογίας του φραγμού διήθησης αποδεικνύεται σε πρόσφατες δημοσιεύσεις από την ομάδα μας και άλλες. προηγμένη μικροσκοπία απεριόριστης διάθλασης ή περιλαμβάνει την εισαγωγή σύνθετης χημείας πολυμερών στο δείγμα για την εξάλειψη και/ή φυσική επέκταση του. Πολλά από τα πρωτόκολλα είναι επίσης χρονοβόρα και απαιτούν σημαντική ποσότητα πρακτικής εργασίας. Αυτό το επιπλέον επίπεδο πολυπλοκότητας μπορεί να είναι αυτό που εμποδίζει αυτές τις νέες μεθόδους να χρησιμοποιούνται συνήθως τόσο από ερευνητές όσο και από κλινικούς παθολόγους. Επιπλέον, πολλά από τα πρωτόκολλα δεν έχουν πρόσβαση σε βαθιά 3-διαστατική (3D) απεικόνιση διεργασιών ποδιών (FPs) πέρα ​​από 5-15 um σε βάθος.-1,7,8 Ως εκ τούτου, στοχεύαμε να αναπτύξτε ένα δραστικά απλοποιημένο και γρήγορο πλήρως οπτικό πρωτόκολλο που καθαρίζει και διογκώνεται χωρικάνεφρόδείγματα ιστού επαρκώς ώστε να επιτρέπουν επί τόπου τρισδιάστατη ανάλυση υψηλής ανάλυσηςνεφρώνανατομίας και παθολογίας χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό μικροσκόπιο περιορισμένης περίθλασης διαθέσιμο σε όλα σχεδόν τα ιδρύματα βιοεπιστημών και παθολογίας.Προηγούμενες απλοποιήσεις πρωτοκόλλου έδειξαν ότι η εισαγωγή πολυμερών ακρυλαμιδίου σε δείγματα σταθεροποιημένα με παραφορμαλδεΰδη μπορεί να παραλειφθεί τελείως, ενώ εξακολουθεί να διατηρείται η ακεραιότητα του ιστού στην κάθαρση του δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS). Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι τα δείγματα ιστών μπορούν να επεκταθούν κατά περισσότερο από έναν συντελεστή 2 χρησιμοποιώντας ένα απλό πρωτόκολλο χωρίς πολυμερή που βασίζεται στην εμβάπτιση σε διαφορετικά υδατικά διαλύματα.2 Έτσι, αφαιρέσαμε την έγχυση ακρυλαμιδίου από τα πιο κουραστικά και πολύπλοκα δημοσιευμένα πρωτόκολλά μας² και αλλάξαμε δείγματος μέσου ενσωμάτωσης για να επιτρέψει μια ήπια (1.{5}}πλάσια γραμμική) διόγκωση τουνεφρόδείγματα ιστού. Βελτιστοποιώντας επίσης τις παραμέτρους απεικόνισης, επιτύχαμε μια αρκετά υψηλή αποτελεσματική ανάλυση για τρισδιάστατη απεικόνιση των FP των ποδοκυττάρων και της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (GBM) χρησιμοποιώντας συμβατική ομοεστιακή μικροσκοπία.

Λέξεις-κλειδιά:εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση. Νεφροπάθεια IgA; Ποδοκύτταρο; νεφρική βιοψία? νεφρική παθολογία? νεφρό

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Οπτική κάθαρση και ήπια διόγκωση του ιστού των νεφρώνΤο απλό πρωτόκολλο αφαίρεσης/διόγκωσης απεικονίζεται σχηματικά στο Σχήμα la. Σημειώστε ότι το βήμα απολιπίδωσης SDS δεν προστέθηκε κυρίως για οπτική διαφάνεια, αλλά για να εξασφαλιστεί επαρκής διόγκωση των δειγμάτων.7 Επιπλέον, όταν παραλείπεται η απολιπίδωση, η ποιότητα χρώσης είναι κακή (Συμπληρωματικό Σχήμα SlA). Δείχνουμε ότι η ταχεία απολιπίδωση στους 70 βαθμούς για 1 ώρα παρήγαγε καλά αποτελέσματα χωρίς η υποβάθμιση του δείγματος να συμβεί σε υψηλότερες θερμοκρασίες (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B). Όπως αναφέρεται από τους Murakami et al., η ουρία και τα μόρια που μοιάζουν με ουρία μπορούν να διογκώσουν αποτελεσματικά τα δείγματα ιστών, με αποτέλεσμα αυξημένη αποτελεσματική χωρική ανάλυση. Προσθέσαμε έτσι 4 M ουρία σε ένα μείγμα με 80 τοις εκατό (wt/wt) φρουκτόζη (ονομάστηκε FRUIT), το οποίο είχε ως αποτέλεσμα έναν γραμμικό παράγοντα διόγκωσης -1.3 (Εικόνα lb).

Για να συντομεύσουμε το χρόνο επισήμανσης, χρησιμοποιήσαμε πρωτεύοντα αντισώματα συζευγμένα με βαφή. Αρχικά, όταν χρησιμοποιήθηκαν συζευγμένα με βαφή αντισώματα νεφρίνης σε ένα τυπικό ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικά με Tween 20), η απόδοση σήματος και σήμανσης δεν ήταν αρκετά υψηλή ώστε να περιγράψει μεμονωμένα FP. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας ένα εναλλακτικό ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης, το HEPES-TSC, η ποιότητα χρώσης αυξήθηκε σε ικανοποιητικό βαθμό (Συμπληρωματικό Σχήμα S1C). Σε σύγκριση με παλαιότερα δημοσιευμένα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν συμβατική μικροσκοπία, το γρήγορο και απλό 5-πρωτόκολλο ωρών τα ξεπέρασε σε αρκετές βασικές παραμέτρους (Εικόνα lc-f). Το πρωτόκολλο που παρουσιάστηκε από τους Pullman et al. είναι ελαφρώς ταχύτερο συνολικά, αλλά έχει τα μειονεκτήματα της απαίτησης δομημένου μικροσκοπίου φωτισμού υπερ-ανάλυσης και χρήσης λεπτών κρυοτομών, αποκλείοντας την πρόσβαση σε μεγάλα βάθη απεικόνισης. Αξίζει να σημειωθεί ότι το πρωτόκολλό μας είναι λιγότερο περίπλοκο από την τυπική ενσωμάτωση παραφίνης ή κρυοτομή όταν λαμβάνονται υπόψη όλες οι αξιολογούμενες παράμετροι.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Βελτιστοποίηση και επικύρωση του πρωτοκόλλου μας για την επίλυση διαδικασιών ποδιώνΕπειδή το πρωτόκολλό μας δίνει μόνο μέτριο συντελεστή διόγκωσης 1,3, οι παράμετροι ομοεστιακής απεικόνισης έπρεπε να βελτιστοποιηθούν για να επιτευχθεί επαρκής ισχύς ανάλυσης για την απεικόνιση των FP. ΠοντίκινεφρόΤα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο και χρωματίστηκαν για νεφρίνη χρησιμοποιώντας διαφορετικά φθοροφόρα. Η ανάλυση ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου εξαρτάται τόσο από το μέγεθος της καρφίτσας όσο και από το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης/εκπομπής.15 Έτσι, χρησιμοποιήσαμε μια μικρότερη διάμετρο οπής καρφίτσας 0.3 Αέριες μονάδες (AU) μαζί με μια πράσινη εκπομπή βαφή, Alexa Fluor 488, και με αυτόν τον τρόπο πέτυχε επαρκή ανάλυση για την επίλυση FP σε ποντίκι άγριου τύπου (WT)νεφρά(Εικόνα 2α). Έτσι, όποτε πρόκειται να οπτικοποιηθούν τα FP ποντικιού, χρησιμοποιούνται φθοροφόρα με μέγιστο μήκος κύματος διέγερσης 488 nm. Κάτω από αυτές τις βελτιστοποιημένες συνθήκες απεικόνισης, μπορέσαμε να απεικονίσουμε ολόκληρα σπειράματα ποντικιού σε 3D σε αποτελεσματική ανάλυση -115 nm, αρκετά καλή για να επιλύσουμε μεμονωμένα FP (Εικόνα 2b-e). Επιπλέον, δείχνουμε ότι ένα βάθος διείσδυσης αντισωμάτων τουλάχιστον 70 μm επιτυγχάνεται με γρήγορη επισήμανση (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A-C). Η χρήση αντικειμενικού φακού γλυκερίνης με κολάρο διόρθωσης, παρέχει πρόσβαση σε μεγαλύτερα βάθη Z από οποιοδήποτε από τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν προηγουμένως, με εξαίρεσηπρωτόκολλο εκκαθάρισης/διεγερμένης εξάντλησης εκπομπών. Επειδή η αξονική ανάλυση ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου είναι περίπου 3 φορές χειρότερη από την πλευρική ανάλυση, τα τριχοειδή θα πρέπει να είναι προσανατολισμένα στο επίπεδο xy για βέλτιστη ανάλυση των FP. Δείχνουμε ότι με το πρωτόκολλό μας, μπορούμε να βρούμε πολλές (έως 25) περιοχές για απεικόνιση σε κάθε σπείραμα (Συμπληρωματικό Σχήμα S2D), επιτρέποντάς μας να συλλέξουμε μεγάλες ποσότητες δεδομένων για να ανιχνεύσουμε επίσης ανεπαίσθητες παραλλαγές στις δομές φραγμού διήθησης. Αυτό καταδεικνύει τη σημασία της πρόσβασης στη διάσταση του βάθους κατά την εκτέλεση ποσοτικών αναλύσεων υψηλής απόδοσης της σπειραματικής υγείας. Είναι σημαντικό ότι επικυρώσαμε επίσης το πρωτόκολλο για την επίλυση των FP σε υλικό ανθρώπινου ασθενούς (Εικόνα 2f και g), το οποίο είναι λιγότερο δύσκολο σε σύγκριση με τα ποντίκια, λόγω των μεγαλύτερων διαστάσεων των ανθρώπινων FP. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας συγκολλητίνη (WGA) λεκτίνης φύτρων σίτου με συγγένεια προς τον γλυκοκάλυκα των FPs, μπορέσαμε επίσης να επιλύσουμε τα FPs με τρόπο διατομής τόσο σε δείγματα ποντικού όσο και σε ανθρώπους (Εικόνα 2h και i). Επιπλέον, κοστολογήσαμε για νεφρίνη, με τον αναμενόμενο εντοπισμό στη μεμβράνη της σχισμής, δείχνοντας ότι μπορούμε να λάβουμε δεδομένα για τον εντοπισμό της πρωτεΐνης εκτός από τις μορφολογικές πληροφορίες.

Παθολογία φραγμού διήθησης σε δείγματα ποντικώνΌπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η απεικόνιση «-,5,6,9,10» στο πρόσωπο FP του διαφράγματος της σχισμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί εύκολα για την οπτικοποίηση και την ποσοτικοποίηση της εξάλειψης της FP. Επικυρώνουμε ότι αυτή η προσέγγιση μπορεί επίσης να εφαρμοστεί με το νέο μας πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας ένα πρόσφατα δημοσιευμένο μοντέλο ποντικιού για εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση (FSGS) (Εικόνα 3). Με χρώση για νεφρίνη, το σχέδιο του διαφράγματος της σχισμής θα μπορούσε να απεικονιστεί σε 3 διαστάσεις σε ολόκληρα σπειράματα WT και μεταλλαγμένων ποντικών (Εικόνα 3α και β). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως,5, το μήκος του διαφράγματος σχισμής ανά περιοχή μπορεί να ποσοτικοποιηθεί ημιαυτόματα και αυτή η ανάλυση παρέχει ένα αποτέλεσμα που είναι συνεπές με αυτό που έχει δημοσιευτεί προηγουμένως για αυτήν τη γραμμή ποντικιού» (Εικόνα 3γ). Επιπλέον, απεικονίστηκαν σπειραματικά τριχοειδή αγγεία σε διατομές που δείχνουν τόσο εξάλειψη των FPs όσο και αλλοιώσεις στο GBM (Εικόνα 3d-f). Δείτε τις Συμπληρωματικές Μέθοδοι και το Σχήμα S3 για λεπτομέρειες σχετικά με τις μετρήσεις GBM.

Παθολογία φραγμού διήθησης σε ανθρώπινα δείγματαΓια περαιτέρω επικύρωση του πρωτοκόλλου μας για πιθανή κλινική χρήση, το εφαρμόσαμε σε ανθρώπινο ιστό από ασθενείς που διαγνώστηκαν με διαφορετικούς τύπουςΝεφρική Νόσος. Δύο ασθενείς με συγγενές νεφρωσικό σύνδρομο, είτε με ομόζυγη μετάλλαξη στο γονίδιο NPHS1 (που κωδικοποιεί τη νεφρίνη), είτε με trans-σχετιζόμενες μεταλλάξεις στα γονίδια TRPC6 και NPHS2 (που κωδικοποιούν το κανάλι TRPC6 και την ποδοκίνη). Αναλύσαμε επίσης 2 ασθενείς με διάγνωση FSGS και νόσο ελάχιστης αλλαγής. Θα μπορούσαμε να απεικονίσουμε και να ποσοτικοποιήσουμε τα τυπικά χαρακτηριστικά τουΝεφρική Νόσος, όπως το FP effacement, καθώς και οι τροποποιήσεις GBM (Εικόνα 4). Οι εικόνες μπορούν να ληφθούν τόσο με το πρόσωπο (Εικόνα 4a-e) όσο και από το πλάι (Εικόνα 4g-k). Επιπλέον, παρατηρήσαμε την αναμενόμενη απουσία νεφρίνης στα διαφράγματα σχισμής του ασθενούς με μετάλλαξη NPHS1 (Εικόνα 4β και η). Όπως για τα δείγματα ποντικών

(Εικόνα 3), τα δεδομένα απεικόνισης θα μπορούσαν να αξιολογηθούν ποσοτικά (Εικόνα 4f και l και Συμπληρωματικό Σχήμα S4A και B).

Αξίζει να σημειωθεί, απροσδόκητα ήπια πάχυνση GBM παρατηρήθηκε στους διαγνωσθέντες ασθενείς σε σύγκριση με τους ελέγχους. Ο νεφρεκτομή ελέγχουνεφρόστο Σχήμα 4 λήφθηκε από έναν μεγαλύτερο ασθενή, ενώ όλα τα άλλα δείγματα ήταν από βρέφη ή παιδιά. Επειδή το πάχος του GBM αυξάνεται με την ηλικία (Συμπληρωματικό Σχήμα S5A-E), πιθανότατα θα παρατηρηθεί πιο σημαντική πάχυνση σε σύγκριση με τους ασθενείς ελέγχου που ταιριάζουν με την ηλικία. Επικυρώσαμε επίσης ότι δεν εισήχθη κανένα τεχνητό οίδημα που εξαρτάται από την ηλικία από το πρωτόκολλό μας (Συμπληρωματικό Σχήμα S5F-H) και επίσης ότι μια διαφορετική στρατηγική μέτρησης GBM απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα (Συμπληρωματικό Σχήμα S5I και D).

Παθολογία μεγάλης κλίμακας σε δείγματα ποντικών και ανθρώπωνΕπειδή όχι μόνο η κλίμακα φραγμού διήθησης, αλλά και οι ιστολογικές αλλαγές σενεφρώνμορφολογία, που παρουσιάζουν υψηλό ενδιαφέρον τόσο για τους ερευνητές όσο και για τους κλινικούς γιατρούς, διερευνήσαμε τη δυνατότητα χρήσης του πρωτοκόλλου μας για την αξιολόγηση της μορφολογίας μεγάλης κλίμακας μέσω ιστολογικής ανάλυσης με βάση τον φθορισμό. Δείχνουμε ότι χρησιμοποιώντας στόχους μικρότερης μεγέθυνσης, θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε παθολογίες μεγάλης κλίμακας και διαφορές στην έκφραση πρωτεΐνης τόσο σε ανθρώπινα δείγματα (Συμπληρωματικό Σχήμα S6) όσο και σε δείγματα ποντικού (Συμπληρωματικό Σχήμα S7).

Οπτικοποίηση παθολογικών αλλοιώσεων σε ασθενείς με διάγνωση FSGS και IgA νεφροπάθειαΓια να επεξηγήσουμε περαιτέρω την πιθανή χρήση του πρωτοκόλλου σε δείγματα ασθενών, διερευνήσαμε εάν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε παθολογικά χαρακτηριστικά του FSGS του κυτταρικού τύπου. Μπορέσαμε να οπτικοποιήσουμε τα περισσότερα παθολογικά χαρακτηριστικά που αναφέρονται στη δήλωση του παθολόγο, συμπεριλαμβανομένης της εστιακής ολικής/τμηματικής στένωσης, της σωληναριακής ατροφίας και της ενδοθηλιακής υπερκυτταρικότητας στα σπειραματικά τριχοειδή αγγεία σε σύγκριση με τις τρέχουσες μεθόδους χρυσού προτύπου (Εικόνα 5a-j). Μια ποιοτική και ποσοτική σύγκριση δίπλα-δίπλα με ηλεκτρονική μικροσκοπία (EM) έδειξε παρόμοια αποτελέσματα χρησιμοποιώντας και τις δύο μεθόδους (Εικόνα 5k και l και Συμπληρωματικό Σχήμα S4, βλέπε Συμπληρωματικές Μέθοδοι για μια συζήτηση των μετρήσεων πλάτους FP).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Εφαρμόσαμε επίσης το πρωτόκολλο σε ένα δείγμα βιοψίας από έναν ασθενή που είχε διαγνωστεί με IgA νεφροπάθεια (IgAN) (Εικόνα 6) και μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε την απεικόνιση πολλών διαγνωστικών χαρακτηριστικών. Δεν ήταν εμφανείς σοβαρές παθολογίες στο φράγμα διήθησης (Εικόνα 6α και β) και μια συγκριτική ανάλυση δεν οδήγησε σε εμφανείς διαφορές μεταξύ του ΕΜ και του πρωτοκόλλου μας (Εικόνα 6γ και δ). Στη συνέχεια, η ιστολογία του δανεικού νεφρού αξιολογήθηκε τόσο με την τυπική ιστολογία (Εικόνα 6e) όσο και με την "ιστολογία φθορισμού" (Εικόνα 6στ). Θα μπορούσαμε να απεικονίσουμε τις αλλοιώσεις (ή την έλλειψη αλλοιώσεων) που αναφέρονται στη δήλωση του παθολογολόγου, όπως η διάμεση διήθηση κυττάρων (Εικόνα 6g και h), τα φυσιολογικά σπειραματικά τριχοειδή αγγεία (Εικόνα 6i) και η μεσαγγειακή επέκταση/υπερκυτταρικότητα (Εικόνα 6j). Η ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα IgA αποκάλυψε ξεκάθαρα εναποθέσεις τόσο σε μεγάλη κλίμακα (Εικόνα 6k και l) όσο και λεπτομερώς (Εικόνα 6m) με ένα πρότυπο ισοδύναμο με αυτό που φαίνεται στον τυπικό ανοσοφθορισμό (Εικόνα 6n και o). Τέλος, η απεικόνιση FP έδειξε μερική ήπια εξάλειψη (Εικόνα 6p και q). Τα παθολογικά χαρακτηριστικά που θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε με το πρωτόκολλό μας συνοψίζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Εδώ παρουσιάζουμε ένα πρωτόκολλο για οπτικοποίηση υψηλής απόδοσηςνεφρώνδομές σε όλες τις κλίμακες μήκους που είναι ταχύτερες και απλούστερες από τα προηγούμενα δημοσιευμένα πρωτόκολλα για ανάλυση FP και απεικόνιση φραγμού σπειραματικής διήθησης στονεφρό, Δείχνουμε ότι η ανάλυση που επιτυγχάνουμε είναι αρκετά υψηλή ώστε να εξάγουμε συμπεράσματα σχετικά με παθολογίες στο φράγμα διήθησης χρησιμοποιώντας απλή ομοεστιακή μικροσκοπία, ένα τυπικό εργαλείο που είναι ήδη διαθέσιμο στις περισσότερες ερευνητικές εγκαταστάσεις και παθολογικά εργαστήρια. Η τρισδιάστατη ικανότητα του πρωτοκόλλου είναι σημαντική κατά την εκτέλεση απεικόνισης FP, επειδή είναι προσβάσιμος ένας μεγάλος όγκος απεικόνισης, επιτρέποντας την αναγνώριση και τον έλεγχο κατάλληλων περιοχών του δείγματος για ποσοτική ανάλυση.

Ένα σημαντικό εύρημα της μελέτης μας είναι ότι το πρωτόκολλό μας δεν λειτουργεί μόνο συμπληρωματικά και ευεργετικά σε σύγκριση με τα τυπικά πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος για την τυπική ανάλυσηνεφρόιστός. Θα μπορούσε επίσης να συγχωνεύσει αυτές τις ροές εργασίας σε ένα πρωτόκολλο, με προφανή εξοικονόμηση όσον αφορά τις ώρες εργασίας και τα υλικά/αντιδραστήρια/εξοπλισμό που απαιτούνται. Ωστόσο, καθώς η ανάλυση βασίζεται σε αντισώματα σε μεγάλο βαθμό, το κόστος της επισήμανσης των αντιδραστηρίων είναι εύλογα υψηλό (περίπου 20 e ανά δείγμα), κάτι που ισχύει και για τα άλλα πρωτόκολλα που βασίζονται σε φθορισμό που παρουσιάζονται σε αυτό το άρθρο (συμπεριλαμβανομένου του κανονικού ανοσοφθορισμού).

Στην ταχύτερη έκδοση του πρωτοκόλλου, χρησιμοποιούμε πρωτεύοντα αντισώματα συζευγμένα με χρωστική ουσία που αποδίδουν επαρκή ποιότητα χρώσης για τον διαχωρισμό των FP. Ωστόσο, το σήμα που προκύπτει είναι πάντα χαμηλότερο σε σύγκριση με αυτό από μια 2-βήμα κύρια/δευτερεύουσα προσέγγιση. Επιπλέον, τα πρωτεύοντα συζευγμένα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στη μελέτη δεν είναι εμπορικά διαθέσιμα και πρέπει να συζευχθούν εσωτερικά. Επομένως, για ορισμένες εφαρμογές, ένα 2-βήμα πρωτογενούς/δευτεροβάθμιου πρωτοκόλλου χρώσης μπορεί να είναι ακόμα προτιμότερο, προσθέτοντας 2 ώρες στο πρωτόκολλο. Πρόσφατες μελέτες έχουν εφαρμόσει τη μικροσκοπία Airyscanνεφρώνιστός, ο οποίος χρησιμοποιεί μεταβλητές ρυθμίσεις οπών καρφίτσας σε έναν ανιχνευτή μικρής συστοιχίας κάμερας σε συνδυασμό με επεξεργασία εικόνας αποσυνέλιξης και επανατοποθέτησης σήματος.

Μια κλειστή οπή καρφίτσας παρέχει επαρκή ανάλυση χωρίς την ανάγκη για μαθηματική μετεπεξεργασία εικόνων. Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε συγκριτικά δεδομένα για το πρωτόκολλό μας και τις τυπικές μεθόδους για την αξιολόγηση της παθολογίας σε δείγματα ασθενών. Ωστόσο, η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε μικρό αριθμό ασθενών και περαιτέρω μελέτες είναι ζωτικής σημασίας για να διερευνηθεί εάν το πρωτόκολλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της πληθώρας των παθολογικών παραμέτρων που υπάρχουν σε άλλους τύπουςνεφρικές παθήσειςεπισης. Για να επιτευχθεί αυτό, πρέπει να ξεκινήσει μια εστιασμένη συλλογική προσπάθεια που θα περιλαμβάνει τόσο παθολόγους, ειδικούς στην προετοιμασία δειγμάτων και ειδικούς στην απεικόνιση. Αυτή η διεξοδική επικύρωση δεν εμπίπτει στο πεδίο εφαρμογής αυτής της μελέτης απόδειξης αρχής, στην οποία στόχος ήταν η ανάπτυξη ενός γρήγορου, οπτικού πρωτοκόλλου για την απεικόνιση υψηλής ανάλυσης τουνεφρό.Θα πρέπει επίσης να τονιστεί ότι η ανάλυση του πρωτοκόλλου μας απέχει πολύ από αυτή του EM και δεν μπορεί να επιλύσει ινώδεις εναποθέσεις, για παράδειγμα, και έτσι για ορισμένες περιπτώσεις, η ΕΜ θα εξακολουθεί να απαιτείται για ακριβή διάγνωση.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ακατέργαστες μετρήσεις μήκους χωρίς διόρθωση για τεχνουργήματα τομής που προκύπτουν από μη ορθογώνια οπτική ή φυσική τομή της μετρούμενης δομής (GBM ή FP). Υπάρχουν 2 κύριοι λόγοι για την αναπαράσταση των δεδομένων σε αυτή τη φόρμα. Πρώτον, η διόρθωση για την κοπή τεχνουργημάτων διατηρώντας ταυτόχρονα πληροφορίες σχετικά με αλλαγές σε νανοκλίμακα (όπως ένα ακανόνιστο "ανώμαλο" GBM) δεν είναι απλή. Δεύτερον, στα διαφανή δείγματά μας, επιλέγαμε πάντα ένα επίπεδο απεικόνισης

στην οποία η δομή που μελετάται είναι ευθυγραμμισμένη όσο το δυνατόν πιο ορθογώνια με το επίπεδο απεικόνισης. Έτσι, η τομή δεν είναι τυχαία, περιπλέκοντας περαιτέρω την ανάλυση τεχνουργημάτων τομής. Κατά συνέπεια, οι μέσες τιμές που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη είναι πιθανώς ελαφρώς υπερεκτιμημένες και τα τεχνουργήματα τομής συμβάλλουν στην εξάπλωση των δεδομένων σε γραφήματα διασποράς. Για μελλοντικές μετρήσεις δομών με διόρθωση τομής χωρίς απώλεια πραγματικής διακύμανσης δεδομένων, θα μπορούσαν ενδεχομένως να εφαρμοστούν τροποποιημένες εκδόσεις των υπαρχουσών μεθόδων διόρθωσης τεχνουργημάτων τομής, όπως η μέθοδος ορθογωνικής τομής.!920

Η ικανότητα εξαγωγής παθολογικών παραμέτρων από καθαρισμένονεφρόιστός που χρησιμοποιεί τόσο μη επισημασμένα (αυτοφθορισμό) όσο και δείγματα με σήμανση φθορισμού έχει αποδειχθεί πρόσφατα.-Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η "εικονική ιστολογία" μπορεί να εκτελεστεί χρησιμοποιώντας βαθιά εκμάθηση al-for αντικείμενα σε εικόνες αυτοφθορισμού και τμηματοποίηση βάσει νευρωνικών δικτύων και Η ταξινόμηση των παθολογιών των νεφρών έχει επίσης αποδειχθεί. Η συγχώνευση νέων μεθόδων προετοιμασίας δειγμάτων (όπως αναφέρονται εδώ) με νέα εργαλεία ανάλυσης εικόνας δημιουργεί πολλές ενδιαφέρουσες ψηφιακές δυνατότητες στο μέλλον και πιθανότατα θα δούμε αλλαγές στον τρόπο που φανταζόμαστε και αναλύουμε τα δείγματα νεφρών τόσο στην έρευνα όσο και στην κλινική.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ιστός νεφρού ποντικού και ανθρώπουΌλα τα πειράματα σε ποντίκια εγκρίθηκαν από το γερμανικό κρατικό γραφείο της Βόρειας Ρηνανίας-Βεστφαλίας, Τμήμα Φύσης, Περιβάλλοντος και Προστασίας των Καταναλωτών και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις ευρωπαϊκές, εθνικές και θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές. Χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια 100 τοις εκατό C57BL/6N υποβάθρου. Μετά την επαγωγή της αναισθησίας με κεταμίνη και ξυλαζίνη, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με καρδιακή έγχυση με ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank και σταθεροποιήθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω.

Λήφθηκε υλικό ασθενών από 2 παιδιά που πάσχουν από ανθεκτικά στα στεροειδή νεφρωσικά σύνδρομα λόγω σημειακών μεταλλάξεων στο NPHSI ή σύνθετων-ετερόζυγων σημειακών μεταλλάξεων σε TRPC6 και NPHS2, καθώς και 3 ασθενείς με διάγνωση εστιακής τμηματικής σπειραματοσκλήρωσης, νόσο ελάχιστης αλλαγής και νεφροπάθεια IgA , αντίστοιχα. Ανθρώπινος ιστός ελέγχου συλλέχτηκε από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε νεφρεκτομή λόγωνεφρώνόγκους. Δείγματα ιστών που ανατέμνονται από τον μη ογκώδη πόλο τουνεφρόέδειξε φυσιολογική ιστολογική εικόνα σε ιστολογική εξέταση ρουτίνας. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Κολωνίας και την περιφερειακή Επιτροπή Δεοντολογίας της Στοκχόλμης και διεξήχθησαν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Κατά περίπτωση, ο ασθενής ή ο κηδεμόνας του ασθενούς παρείχε ενημερωμένη συγκατάθεση.

Μοντέλο ποντικιού για FSGSΠοντίκια με 2 σύνθετες-ετερόζυγες σημειακές μεταλλάξεις, Pod8asicyAzv δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως." Τα ποντίκια θανατώθηκαν σε ηλικία 20 εβδομάδων όπως αναφέρθηκε παραπάνω.ΣτερέωσηΆνθρωπος και ποντίκινεφράσταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη σε 1× ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1-3 ώρες. Ο άνθρωπος που έχει υποστεί νεφρεκτομήνεφρόσταθεροποιήθηκε σε διάλυμα Dubosaq-Brasil για 3 ώρες.ΤομήΤα δείγματα ενσωματώθηκαν σε αγαρόζη 3 τοις εκατό και τεμαχίστηκαν σε πάχος 300 μm χρησιμοποιώντας δονητή.ΑπολιπίδωσηΤα δείγματα επωάστηκαν σε ένα διάλυμα καθαρισμού (200 mM βορικό οξύ και 4 τοις εκατό SDS, ρΗ 8,5) στους 70 βαθμούς C για 1 ώρα με ανακίνηση στις 500 μ.μ.ΤιτλοφόρησηΤο πρωτόκολλο σήμανσης και μια λίστα αντισωμάτων/ανιχνευτών παρέχονται στο Συμπληρωματικό Υλικό.ΒάσηΤα δείγματα επωάστηκαν σε 80 τοις εκατό φρουκτόζη (1 ml dH, 0 προστέθηκε σε 4 g φρουκτόζης) που περιείχε 4 M ουρία στους 37 βαθμούς με ανακίνηση στις 500 rpm για 15 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα δίσκο MatTek (MatTek , Ashland, MA) με καλυπτρίδα στην κορυφή (για να αποφευχθεί η εξάτμιση) πριν από την απεικόνιση,ΑπεικόνισηΟι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό σύστημα Leica SP8 (οι στόχοι αναφέρονται στα θρυλικά σχήματα) (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Η απεικόνιση με τον αντικειμενικό φακό 100× συνεπάγεται πάντα μια ρύθμιση οπής καρφίτσας 03 AU (όπως υπολογίζεται για 594-nm φως) εάν δεν αναφέρεται διαφορετικά. Η τυπική ιστολογική απεικόνιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Leica DM3000 (Εικόνα 5) ή ένα σύστημα Olympus BX45 (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία) (Εικόνα 6). Ο τυπικός ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Nikon Microphot-FXA (Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία) και το ΕΜ πραγματοποιήθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης Zeiss 912 (Εικόνα 5) ή Hitachi 7700 (Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία) (Εικόνα 6).Επεξεργασία και ανάλυση εικόναςΕκτός αν δηλώνεται διαφορετικά, οι εικόνες εξομαλύνθηκαν αντικαθιστώντας κάθε τιμή pixel με το μέσο όρο της γειτονιάς 3×3 χρησιμοποιώντας Fiji/ImageJ (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Bethesda, MD). Οι μορφομετρικές αναλύσεις περιγράφονται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι και φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S4.