Μια 13-εβδομαδιαία μελέτη υποχρόνιας τοξικότητας της 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλης σε αρουραίους F344

Περίληψη: Η 2-(l-Μενθοξυ)αιθανόλη έχει χρησιμοποιηθεί συχνά ως αρωματικός παράγοντας. Ωστόσο, τα δεδομένα σχετικά με την τοξικότητα της 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλης παραμένουν περιορισμένα. Πραγματοποιήσαμε μια 13-εβδομάδαυποχρόνια τοξικότηταμελέτη της {{0}}(l-μενθοξυ)αιθανόλης σε αρσενικούς και θηλυκούς αρουραίους F344, με δόσεις 0, 15, 60 ή 250 mg/kg σωματικού βάρους (BW)/ημέρα χορηγούμενες από το στόμα με καθετήρα με χρήση καλαμποκέλαιο ως όχημα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές τοξικολογικές αλλαγές στη γενική κατάσταση, το σωματικό βάρος ή την πρόσληψη τροφής σε καμία ομάδα. Η αιματολογική εκτίμηση έδειξεμειωμένη αιμοσφαιρίνη,αιματοκρίτης, μέσος σωματιδιακός όγκος και μέση σωματιδιακή αιμοσφαιρίνη και αυξημένος αριθμός αιμοπεταλίων στην ομάδα των 250 mg/kg των ανδρών.Βιοχημεία ορούαποκάλυψεαυξημένη ολική χοληστερόληστην ομάδα των 250 mg/kg αρσενικών και θηλυκών αρουραίων, μειωμένα τριγλυκερίδια στην ομάδα των θηλυκών 250 mg/kg και αυξημένη ολική πρωτεΐνη στην ομάδα αρσενικών 250 mg/kg, υποδεικνύοντας επιδράσεις στηνμεταβολισμός λιπιδίωνκαιπρωτεϊνική σύνθεση. Για τα βάρη οργάνων, το απόλυτο και το σχετικό βάρος του ήπατος και των επινεφριδίων αυξήθηκαν στην ομάδα των 250 mg/kg και των δύο φύλων και στην ομάδα των ανδρών 250 mg/kg, αντίστοιχα. Η ιστοπαθολογική ανάλυση έδειξεχρόνια νεφροπάθειαστις άρρενες ομάδες 15 mg/kg ή υψηλότερες, με αυξημένο απόλυτο και σχετικό βάρος νεφρών, καθώς και αυξημένη κρεατινίνη ορού, στις ομάδες ανδρών 60 και 250 mg/kg. Ωστόσο, ηωσινόφιλοι κόκκοι που περιέχουν 2u-σφαιρίνη εντοπίστηκαν σε εγγύς σωληνάρια, υποδηλώνοντας νεφροπάθεια 2u-σφαιρίνης ειδική για αρσενικούς αρουραίους και χωρίς τοξικολογική σημασία. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο μη παρατηρούμενης ανεπιθύμητης ενέργειας της 2-(l-μεθοξυ)αιθανόλης ήταν 60 mg/kg ΣΒ/ημέρα και για τα δύο φύλα. (DOI: 10.1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

Λέξεις-κλειδιά: 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλη, 2-l-μενθοξυαιθανόλη, πρόσθετο τροφίμων, αρωματικός παράγοντας, αρουραίος Fischer, μενθόλη

Συμπλήρωμα Cistanche Συμπλήρωμα υποστήριξης νεφρικής λειτουργίας PhGs75% Ech 30% Act 12%

Εισαγωγή

Η {{0}}(l-Menthoxy)αιθανόλη (CAS No. 38618-23-4) είναι ένα διαυγές και άχρωμο υγρό με χαρακτηριστική οσμή και χρησιμοποιείται ευρέως ως αρωματικός παράγοντας. Η Μικτή Επιτροπή Εμπειρογνωμόνων του FAO/ΠΟΥ για τα πρόσθετα τροφίμων (JECFA) αξιολόγησε την 2-(l-menthoxy)αιθανόλη ως αρωματικό παράγοντα, η οποία κατηγοριοποιείται ως ουσίες που σχετίζονται δομικά με τη μενθόλη1. Με βάση τη δομική κατηγορία των αρωματικών παραγόντων, η 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλη εκχωρήθηκε στην κατηγορία I. Στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρώπη, τα επίπεδα πρόσληψης της 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλης από τον άνθρωπο υπολογίστηκαν ότι είναι 12 ug/άτομο/ημέρα και 0,01 ug/άτομο/ημέρα, αντίστοιχα, και τα δύο κάτω από το όριο Τάξης Ι των 1.800 ug/άτομο/ημέρα. Με βάση αυτές τις εκτιμήσεις, θεωρείται ότι η 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλη μπορεί να μην παρουσιάζει ανησυχίες για την ασφάλεια κατά τη συνήθη χρήση ως αρωματικός παράγοντας.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg σωματικού βάρους [BW])1. Παρά τη χρήση της 2-(l-men thoxy)αιθανόλης ως αρωματικού παράγοντα, είναι διαθέσιμα περιορισμένα δεδομένα σχετικά με την τοξικότητα επαναλαμβανόμενων δόσεων αυτής της ένωσης. Το εργαστήριό μας έχει διερευνήσει την τοξικότητα πολλών προσθέτων τροφίμων, συμπεριλαμβανομένων αντιπροσωπευτικών αρωματικών παραγόντων από κάθε κατηγορία, σε μοντέλα τρωκτικών2–7. Για να διευκρινίσουμε το τοξικολογικό προφίλ και να καθορίσουμε ένα επίπεδο μη παρατηρούμενων δυσμενών επιπτώσεων (NOAEL), πραγματοποιήσαμε μια 13-εβδομαδιαία μελέτη υποχρόνιας τοξικότητας της 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλης, η οποία χορηγήθηκε από το στόμα σε F344 αρουραίοι με καθετήρα.

Υλικά και μέθοδοι

Δοκιμαστική χημική ουσία

2-(l-Μενθοξυ)αιθανόλη (Αρ. παρτίδας 5I0002, καθαρότητα 99,9%) που παράγεται από την Takasago Int. Corp. (Τόκιο, Ιαπωνία) παρασχέθηκε από το Division of Standards and Evaluation, Department of Food Safety, Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας, Ιαπωνία, με την υποστήριξη της Japan Flavor & Fragrance Materials Association (Τόκιο, Ιαπωνία). Αν και η υπό δοκιμή ουσία παρασχέθηκε ως μείγμα οπτικών ισομερών (Αρ. CAS 38618-23-4), επιβεβαιώθηκε ως το l-εναντιομερές (Αρ. CAS 75443-64-0) ​​από τον κατασκευαστή. Από του στόματος καθετήρας με αραβοσιτέλαιο (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Ιαπωνία) ως φορέας επιλέχθηκε ως οδός χορήγησης λόγω της υδατικής αδιαλυτότητας και της πτητικότητας της 2-(1-μενθοξυ) αιθανόλης. Διαλύματα 2-(l-μενθοξυ)αιθανόλης παρασκευάζονταν καθημερινά, αμέσως πριν από τη χορήγηση. Μετά από αποθήκευση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, οι υπολειμματικές αναλογίες 2-(l-μενθοξυ) αιθανόλης σε διάλυμα 4, 40 και 400 mg/mL επιβεβαιώθηκαν ως 96,8%, 99,8% και 96,5%, αντίστοιχα, με αέρια χρωματογραφία (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Τόκιο, Ιαπωνία).

πειραματόζωα

Συνολικά, 40 αρσενικοί και 40 θηλυκοί αρουραίοι χωρίς συγκεκριμένα παθογόνα (F344/DuCrlCrlj, 5-εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Ιαπωνία) και χρησιμοποιήθηκαν μετά τον εγκλιματισμό για μία εβδομάδα. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, τα ζώα στεγάστηκαν σε κλουβιά από πολυανθρακικό με μαλακό στρώμα, διατηρήθηκαν σε δωμάτιο με σύστημα φραγμού για τον έλεγχο του κύκλου φωτός/σκότους (12 ώρες), αερισμού (ρυθμός ανταλλαγής αέρα 18 φορές/ώρα), θερμοκρασία ( 24 ± 1 βαθμός), και σχετική υγρασία (55 ± 5%). Τα κλουβιά και τα κλινοσκεπάσματα αντικαταστάθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Κάθε ζώο είχε ελεύθερη πρόσβαση σε νερό βρύσης και βασική δίαιτα (CRF-1· Oriental Yeast, Τόκιο, Ιαπωνία). Στην αρχή του πειράματος, τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες των 10 αρσενικών και θηλυκών αρουραίων η καθεμία, με βάση το σωματικό βάρος που μετρήθηκε αμέσως πριν από την έναρξη της θεραπείας με τη δοκιμαστική χημική ουσία.

Σχεδιασμός μελέτης

Σε μια προκαταρκτική {0}}ημερήσια μελέτη αξιολόγησης της 2-(l-μενθοξυ) αιθανόλης που χορηγήθηκε σε δόσεις 0, 200, 400 και 800 mg/kg ΣΒ/ημέρα, απόλυτη και τα σχετικά βάρη ήπατος αυξήθηκαν σημαντικά σε όλες τις ομάδες και των δύο φύλων που έλαβαν θεραπεία (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, επιλέξαμε δόσεις 2-(l-μενθοξυ) αιθανόλης 0, 15, 60 και 250 mg/kg ΣΒ/ημέρα για χορήγηση τόσο σε αρσενικούς όσο και σε θηλυκούς αρουραίους στην παρούσα 13- μελέτη τοξικότητας εβδομάδας

Οι γενικές συνθήκες και η θνησιμότητα αξιολογούνταν καθημερινά. Τα σωματικά βάρη, καθώς και οι ποσότητες της παρεχόμενης και της υπολειπόμενης δίαιτας, μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου. Όλοι οι αρουραίοι έμειναν νηστικοί όλη τη νύχτα μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας και συλλέχθηκαν δείγματα αίματος για αιματολογία και βιοχημεία ορού από την κοιλιακή αορτή υπό βαθιά αναισθησία με εισπνοή χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο. Ο σχεδιασμός της μελέτης ήταν σύμφωνος με τις Κατευθυντήριες γραμμές για τον προσδιορισμό των πρόσθετων τροφίμων και την αναθεώρηση των προτύπων για τη χρήση των πρόσθετων τροφίμων της Ιαπωνίας (1996) και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Εθνικού Ινστιτούτου Επιστημών Υγείας της Ιαπωνίας.

Αιματολογία και βιοχημεία ορού

Οι ακόλουθες αιματολογικές παράμετροι αναλύθηκαν με τη χρήση αυτόματων αιματολογικών αναλυτών ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, ΗΠΑ): αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων (WBC), αριθμός ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC), συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (HGB), αιματοκρίτης (HCT), μέσος σωματιδιακός όγκος (MCV), μέση σωματιδιακή αιμοσφαιρίνη (MCH), μέση σωματιδιακή συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (MCHC), αριθμός αιμοπεταλίων (PLT) και διαφορικά κύτταρα λευκοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένων ουδετερόφιλων (Neut), λεμφοκυττάρων (Λέμφος), μονοκυττάρων (Μονο), ηωσινόφιλων (Eosino), και βασεόφιλα (Baso). Η βιοχημική ανάλυση ορού πραγματοποιήθηκε από την Oriental Yeast για τις ακόλουθες παραμέτρους: ολική πρωτεΐνη (TP), λευκωματίνη (Alb), αναλογία λευκωματίνης/σφαιρίνης (A/G), ολική χολερυθρίνη (Bil), γλυκόζη, ολική χοληστερόλη (T-Chol), τριγλυκερίδια (TG), άζωτο ουρίας (BUN), κρεατινίνη (Cre), ασβέστιο (Ca), ανόργανος φώσφορος (IP), νάτριο (Na), κάλιο (K), χλώριο (Cl), ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST), αλανίνη αμινοτρανσφεράση (ALT), αλκαλική φωσφατάση (ALP) και -γλουταμυλοτρανπεπτιδάση (-GTP).

Βάρη οργάνων και ιστοπαθολογική εκτίμηση

Πραγματοποιήθηκε πλήρης νεκροψία για όλα τα ζώα και ζυγίστηκαν ο εγκέφαλος, ο θύμος, οι πνεύμονες, η καρδιά, ο σπλήνας, το ήπαρ, τα επινεφρίδια, τα νεφρά, οι όρχεις και οι ωοθήκες. Αυτά τα όργανα, καθώς και ιστοί από τον νωτιαίο μυελό, το τρίδυμο νεύρο, την υπόφυση, τη ρινική κοιλότητα, τους σιελογόνους αδένες, τη γλώσσα, τον οισοφάγο, την τραχεία, την αορτή, τον θυρεοειδή αδένα, τον παραθυρεοειδή αδένα, το πάγκρεας, το στομάχι, το λεπτό και παχύ έντερο, το υπογνάθιο και το μεσεντέριο Οι λεμφαδένες, ο κόλπος, η μήτρα, η ουροδόχος κύστη, ο προστάτης αδένας, τα σπερματοζωάρια, η επιδιδυμίδα, το μηριαίο οστό και το στέρνο με μυελό των οστών, σπόνδυλοι, σκελετικοί μύες, ισχιακό νεύρο, δέρμα και μαστικός αδένας, σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη 10% με ουδέτερη ρύθμιση. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστοπαθολογική εξέταση. Οι όρχεις και τα μάτια με τους Harderian αδένες στερεώθηκαν στο σταθεροποιητικό Bouin και στο διάλυμα Davidson, αντίστοιχα. Οι ιστοί των οστών, συμπεριλαμβανομένης της ρινικής κοιλότητας, των σπονδύλων, του στέρνου και του μηριαίου οστού, απασβεστώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μίγμα 10% μυρμηκικού οξέος και 10% ρυθμισμένης φορμαλίνης για έως και 2 εβδομάδες. Πραγματοποιήθηκε ιστοπαθολογική αξιολόγηση για όλους τους ιστούς που ελήφθησαν από ζώα στην ομάδα ελέγχου και η ομάδα χορηγούσε την υψηλότερη δόση εκτός εάν παρατηρήθηκαν αλλοιώσεις που σχετίζονται με τη θεραπεία.

Ανοσοϊστοχημεία για 2u-σφαιρίνη

Σε αρσενικούς αρουραίους, η συσσώρευση 2u-σφαιρίνης στο νεφρό εξετάστηκε με ανοσοϊστοχημική ανάλυση τμημάτων ενσωματωμένων σε παραφίνη. Για την ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές που ελήφθησαν από 5 αρουραίους σε κάθε ομάδα επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ (DAKO, Glostrup, Δανία) για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Όλες οι τομές βυθίστηκαν σε διάλυμα 3% Η2Ο2/μεθανόλης για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για απενεργοποίηση της ενδογενούς δραστηριότητας υπεροξειδάσης. Μετά τον αποκλεισμό μη ειδικών αντιδράσεων με 10% φυσιολογικό ορό κουνελιού, οι τομές επωάστηκαν με ένα πρωτεύον αντίσωμα για 2u-σφαιρίνη (αραιωμένο 1:400, αντίσωμα 2u-σφαιρίνης κατά αρουραίου, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς 8. Οπτικοποίηση της δέσμευσης αντισώματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ABC Vecta Stain Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) και 3,3'-διαμινοβενζιδίνη. Όλες οι τομές αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη.

Στατιστική ανάλυση

Οι διακυμάνσεις στις τιμές δεδομένων για το σωματικό βάρος κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου, καθώς και για την αιματολογία, τη βιοχημεία ορού και τα βάρη οργάνων, αξιολογήθηκαν ως προς την ομοιογένεια χρησιμοποιώντας το τεστ Bartlett. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και η δοκιμή Kruskal-Wallis, αντίστοιχα, για ομοιογενή και ετερογενή δεδομένα. Για τον προσδιορισμό των στατιστικά σημαντικών διαφορών, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett για τη σύγκριση των ομάδων ελέγχου και θεραπείας. Οι συγκρίσεις των ιστοπαθολογικών περιπτώσεων και βαθμών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ακριβούς πιθανότητας Fisher και τη δοκιμή U Mann-Whitney, αντίστοιχα. τιμές P του<0.05 were considered statistically significant.