[6]-Gingerol Διευκολύνει την έκκριση CXCL8 και την παραγωγή ROS σε πρωτογενή ανθρώπινα ουδετερόφιλα στοχεύοντας το κανάλι TRPV1 Μέρος 1

1. Εισαγωγή

Ο εντοπισμός συστατικών τροφίμων με ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες μαζί με τους αντίστοιχους μοριακούς στόχους τους έχει προσελκύσει αυξημένο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια. Λόγω της υψηλής ποικιλομορφίας προσδέματος, η υπεροικογένεια δυναμικού υποδοχέα των διαύλων ιόντων (κανάλια TRP) αντιπροσωπεύει μια πολύ ενδιαφέρουσα κατηγορία δυνητικών δομών στόχου.

Ένας μοριακός στόχος είναι ένα συγκεκριμένο μόριο στο οποίο δρα ένα φάρμακο στο σώμα. Η ανοσία αναφέρεται στη δύναμη της ικανότητας του σώματος να αντιστέκεται στις ασθένειες.

Υπάρχει στενή σχέση μεταξύ μοριακών στόχων και ανοσίας. Τα αποτελέσματα των φαρμάκων συχνά επηρεάζουν την ανοσία του οργανισμού. Για παράδειγμα, ορισμένα φάρμακα μπορεί να θεραπεύσουν ορισμένες χρόνιες ασθένειες παρεμβαίνοντας στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος ενός οργανισμού. Επιπλέον, η θεραπεία του όγκου χρησιμοποιεί συχνά στοχευμένη θεραπεία, δηλαδή στοχεύει ορισμένους μοριακούς στόχους για να επιτεθεί στα καρκινικά κύτταρα, βελτιώνοντας έτσι την ικανότητα της ανοσίας να καταπολεμά τα καρκινικά κύτταρα.

Επιπλέον, η δύναμη της ανοσίας θα επηρεάσει επίσης την επίδραση των φαρμάκων. Τα άτομα με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να εμφανίσουν παρενέργειες ή λιγότερο αποτελεσματικά φάρμακα όταν χρησιμοποιούνται, επειδή το ανοσοποιητικό σύστημα δεν απορροφά καλά τα φάρμακα, με αποτέλεσμα λιγότερο αποτελεσματική θεραπεία. Επομένως, η διατήρηση ενός υγιούς ανοσοποιητικού συστήματος είναι πολύ σημαντική για τη φαρμακευτική θεραπεία.

Συμπερασματικά, υπάρχει στενή σύνδεση μεταξύ των μοριακών στόχων και της ανοσίας και η πλήρης κατανόηση αυτής της σχέσης έχει μεγάλη σημασία για την ορθολογική χρήση των φαρμάκων. Θα πρέπει να βελτιώνουμε ενεργά το ανοσοποιητικό μας σύστημα, να χρησιμοποιούμε σωστά φάρμακα σύμφωνα με τις συμβουλές του γιατρού και να βελτιώνουμε την ανοσία μέσω στοχευμένης θεραπείας για την καλύτερη προστασία της υγείας μας. Από αυτή την άποψη, πρέπει να βελτιώσουμε το ανοσοποιητικό μας. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ανοσία επειδή το Cistanche έχει επίσης αντι-ιικές και αντικαρκινικές επιδράσεις, οι οποίες μπορούν να ενισχύσουν την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να καταπολεμά και να βελτιώσει την ανοσία του σώματος.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστανάκι

Η υπεροικογένεια των καναλιών TRP των θηλαστικών περιλαμβάνει έξι συγγενείς οικογένειες πρωτεϊνών, συγκεκριμένα την αγκυρίνη (TRPA), την κανονική (TRPC), τη μελαστατίνη (TRPM), τη βλεννολιπίνη (TRPML), την πολυκυστίνη (TRPP) και την οικογένεια των βανιλλοειδών (TRPV). τα οποία τυπικά μοιράζονται έξι διαμεμβρανικά τμήματα που συναρμολογούνται ως τετραμερή για να σχηματίσουν πόρους διαπερατούς από κατιόντα με ποικίλη επιλεκτικότητα κατιόντων.[1] Το κανάλι TRPV1 μπορεί να είναι, μακράν, το πιο εντατικά ερευνημένο μέλος της υπεροικογένειας TRP. Το TRPV1 αρχικά αναγνωρίστηκε ως ο υποδοχέας της καψαϊκίνης, του πικάντικου συστατικού των πιπεριών τσίλι.[2] Αργότερα, επίσης τα πικάντικα συστατικά από το τζίντζερ, οι τζίντζερλες, αποδείχθηκε ότι ενεργοποιούν το TRPV1.[3]

Ο βιολογικός ρόλος του TRPV1 σε μη νευρωνικούς κυτταρικούς τύπους βρίσκεται ακόμη υπό εκτενή έρευνα, ωστόσο τα διαθέσιμα αποτελέσματα υποδηλώνουν λειτουργίες πολύ πέρα ​​από την αισθητηριακή και θερμική αντίληψη. Για παράδειγμα, μια παρέμβαση 12-εβδομάδας με ημερήσια δόση 0,15 mg του αγωνιστή TRPV1 nonivamide, ενός δομικού αναλόγου καψαϊκίνης, απέτρεψε την αύξηση της μάζας λίπους που προκλήθηκε από τη διατροφή και την αύξηση της σεροτονίνης στο πλάσμα επίπεδα σε υγιή υπέρβαρα άτομα.[4]

Στα λιποκύτταρα 3Τ{{1}L1, η ενεργοποίηση του TRPV1 από το μη ιβαμίδιο μείωσε τη συσσώρευση λιπιδίων κατά τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση, καταστέλλοντας την έκφραση PPAR𝛾.[5] Στα μακροφάγα, η καψαϊκίνη και το νονιβαμίδιο εξασθένησαν μια επαγόμενη από το LPS απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως IL6, CXCL8 και TNF-άλφα, με τρόπο που εξαρτάται από το TRPV.[6] Ωστόσο, οι συγκεκριμένες λειτουργίες του TRPV1 στα λευκοκύτταρα του ανθρώπινου αίματος παραμένουν ασαφείς. Στα ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ, η καψαϊκίνη 10 και 50 μΜ προκάλεσε αύξηση στις ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca2 συν, υποδεικνύοντας ένα λειτουργικό κανάλι TRPV1.[7]

Ωστόσο, οι εξασθενημένες λειτουργίες τελεστών κυττάρων ΝΚ, όπως η κυτταροτοξική αποκοκκίωση και η έκκριση κυτοκίνης, που προκλήθηκαν από προεπεξεργασία των κυττάρων με καψαϊκίνη για 1 ώρα σε ένα εύρος συγκέντρωσης 10-100 μM, ήταν σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητες από το TRPV1.[7] ] Στα Τ κύτταρα, το TRPV1 τεκμηριώθηκε ότι εμπλέκεται στις διαδικασίες σηματοδότησης των υποδοχέων Τ κυττάρων, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης Τ κυττάρων, καθώς και στην παραγωγή κυτοκίνης.[8] Προηγούμενη εργασία από την ομάδα μας έδειξε επίσης λειτουργική έκφραση του TRPV1 σε ανθρώπινα πρωτογενή Τ κύτταρα.[9] Επιπλέον, αναλύσεις δόσης-απόκρισης σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,03 έως 300 μmol L−1 αποκάλυψαν ότι η [6]-gingerol αναστέλλει την έκκριση κυτοκίνης από πρωτογενή ανθρώπινα λευκοκύτταρα με τιμή IC50 82,2 μmol L−1.

Ωστόσο, η ποσοτικοποίηση της [6]-gingerol σε δείγματα πλάσματος υγιών ατόμων αποκάλυψε μέση μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα μόνο 42.0 ± 16,3 nmol L−1 μετά τη λήψη 1 L τσαγιού τζίντζερ. Δεδομένου ότι αυτές οι συγκεντρώσεις [6]- τζίντζερόλης δεν είχαν σημαντική επίδραση στην έκκριση κυτοκίνης σε προηγούμενες μελέτες,[9] δεν είναι σαφές εάν μια σχετική διατροφική συγκέντρωση 50 nmol L−1 επιτεύχθηκε στο πλάσμα του αίματος μετά από κατανάλωση 1 L τζίντζερ τσάι, είναι επαρκής για τη ρύθμιση των κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων σε άλλα ανθρώπινα πρωτογενή λευκοκύτταρα.

Για τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, η γνώση σχετικά με τον λειτουργικό ρόλο του TRPV1 είναι περιορισμένη. Ενώ οι Köse και Nazıroglu˘ [10] έδειξαν ροές Ca2 συν στα ουδετερόφιλα ως απόκριση σε 10 μM καψαϊκίνη που έπρεπε να μειωθούν από τον ανταγωνιστή TRPV1 καψαζεπίνη, άλλα αποτελέσματα δεν έδειξαν ότι η καψαϊκίνη επάγει εισροή Ca2 συν όταν δοκιμάστηκε σε εύρος συγκεντρώσεων 1 –100 μΜ, παρά την ανιχνεύσιμη έκφραση RNA TRPV1.[11]

Τα ουδετερόφιλα είναι τα πιο άφθονα λευκοκύτταρα στο ανθρώπινο αίμα, αντιπροσωπεύοντας το 60-70 τοις εκατό όλων των κυκλοφορούντων λευκών αιμοσφαιρίων. Είναι τα πρώτα ανοσοκύτταρα που στρατολογούνται στα σημεία μόλυνσης. Ως εκ τούτου αναφέρονται συχνά ως η πρώτη γραμμή άμυνας.[12] Η στρατολόγηση ουδετερόφιλων πυροδοτείται, μεταξύ άλλων, από το βακτηριακό ή προερχόμενο από μιτοχόνδρια πεπτίδιο Ν-Φορμυλομεθειονίνη-λευκυλ-φαινυλαλανίνη (fMLF) ή χημειοκίνες όπως το CXCL8 (IL-8).[13]

Οι αμυντικοί μηχανισμοί των ουδετερόφιλων περιλαμβάνουν τη φαγοκυττάρωση, [14] απελευθέρωση αντιμικροβιακού ενζύμου μέσω αποκοκκίωσης, [15] δημιουργία αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), [16] και το σχηματισμό εξωκυτταρικών παγίδων ουδετερόφιλων.[17] Εκτός από αυτούς τους άμεσους αμυντικούς μηχανισμούς, τα ουδετερόφιλα συμβάλλουν περαιτέρω σε επακόλουθες ανοσολογικές αποκρίσεις μέσω της απελευθέρωσης διαφόρων κυτοκινών και χημειοκινών.[18] Επίσης, τα ουδετερόφιλα μπορούν να υποστούν μια διαδικασία εκκίνησης που τους επιτρέπει να ανταποκρίνονται πιο έντονα στην επακόλουθη πλήρη ενεργοποίηση.[16b]

Τα τελευταία χρόνια, έχουν αυξηθεί τα στοιχεία ότι συστατικά από τρόφιμα ή/και φαρμακευτικά φυτά μπορούν να τροποποιήσουν μία ή περισσότερες από τις αναφερόμενες αμυντικές αντιδράσεις των ανθρώπινων ουδετερόφιλων. Αυτές οι τροποποιήσεις περιλαμβάνουν αυξημένη φαγοκυτταρωτική δραστηριότητα[19] και δημιουργία ROS,[20] αυξημένη χημειοταξία προς το fMLF[21] και σχηματισμό εξωκυτταρικών παγίδων ουδετερόφιλων.[20] Ωστόσο, οι δραστικές ενώσεις δεν ταυτοποιήθηκαν. Συστατικά από το Ferula akitschkensis (𝛽-πινένιο, σαβινένιο, 𝛾-τερπινένιο, γερανυλοακετόνη και ισοβορνυλοξικό) απευαισθητοποίησαν τα ουδετερόφιλα στα προκαλούμενα από fMLF- και CXCL{8- εισροή Ca2 συν και ανέστειλαν την ακρεονειτίνη από το fMLF προκαλώντας τη γερανοαξίωση, Τα επαγόμενα αποτελέσματα διαμεσολαβήθηκαν μέσω του TRPV1.[22]

Με βάση τα διαθέσιμα δεδομένα, υποθέσαμε ότι η επαγόμενη από συνδέτη ενεργοποίηση του TRPV1 από [6]-τζινγκερόλη μπορεί να επηρεάσει τις γενικές λειτουργίες ουδετερόφιλων, είτε άμεσα είτε μέσω της ενίσχυσης των αποκρίσεών τους σε ερεθίσματα ενεργοποίησης. Στο πλαίσιο αυτής της υπόθεσης, στοχεύσαμε ιδιαίτερα στο να διευκρινίσουμε εάν μια επαληθευμένη διατροφικά σχετική συγκέντρωση είναι επαρκής για τη ρύθμιση των κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων στα ανθρώπινα πρωτογενή ουδετερόφιλα ως μέρος του πληθυσμού των λευκοκυττάρων. '

Επιπλέον, επιδιώξαμε να συγκρίνουμε τα επίπεδα έκφρασης RNA όλων των μελών της υπεροικογένειας TRP θηλαστικών σε πέντε από τους πιο σημαντικούς τύπους κυττάρων στο ανθρώπινο αίμα για να αποκτήσουμε μια ποιοτικά και ποσοτικά ολοκληρωμένη επισκόπηση της έκφρασης του διαύλου TRP σε ανθρώπινα λευκοκύτταρα.

2. Αποτελέσματα

2.1. Αφθονία και σχετικά επίπεδα μεταγραφής καναλιών TRP σε ανθρώπινα λευκοκύτταρα

Για να αξιολογηθεί η έκφραση RNA καναλιού TRP σε λευκοκύτταρα αίματος, απομονώθηκαν πέντε από τους πιο σημαντικούς τύπους λευκοκυττάρων από το αίμα υγιών δοτών και η έκφραση RNA των διαύλων TRP αναλύθηκε μέσω ποσοτικής RT-PCR (Εικόνα 1).

Συγκεκριμένες μεταγραφές του TRPV καθώς και της οικογένειας TRPM ανιχνεύθηκαν με υψηλές συχνότητες 75–100 τοις εκατό σε όλους τους τύπους κυττάρων που αναλύθηκαν. Η μέση συνολική συχνότητα λαμβάνοντας υπόψη όλους τους τύπους κυττάρων ήταν 96 τοις εκατό για την οικογένεια TRPV και 98 τοις εκατό για την οικογένεια TRPM. Τα ειδικά για το TRPC μεταγραφές ήταν πολύ λιγότερο άφθονα, κυμαινόμενα από 0 τοις εκατό σε μονοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα, Τ κύτταρα και Β κύτταρα έως 100 τοις εκατό σε κύτταρα ΝΚ και Τ κύτταρα με συνολική μέση συχνότητα μόνο 53 τοις εκατό (Εικόνα 1Α). Το ειδικό μεταγράφημα TRPC5-ανιχνεύθηκε μόνο σε ουδετερόφιλα, με συχνότητα 70 τοις εκατό .

Επίσης, το ειδικό αντίγραφο TRPA1- γενικά αποκάλυψε μια μάλλον χαμηλή αφθονία στους τύπους κυττάρων που αναλύθηκαν με συχνότητα 100 τοις εκατό στα ουδετερόφιλα, 25 τοις εκατό στα μονοκύτταρα, 80 τοις εκατό στα κύτταρα ΝΚ, 100 τοις εκατό στα Τ κύτταρα και 60 ποσοστό στα Β κύτταρα. Ομοίως, το ειδικό αντίγραφο TRPML3-έδειξε χαμηλή συχνότητα σε ουδετερόφιλα (50 τοις εκατό ), μονοκύτταρα (25 τοις εκατό ), ΝΚ κύτταρα (40 τοις εκατό ) και Β κύτταρα (20 τοις εκατό ), αλλά μια συχνότητα 100 τοις εκατό σε Τ κύτταρα. Το ειδικό μεταγράφημα TRPV{12}}ανιχνεύθηκε σε όλους τους τύπους κυττάρων, δείχνοντας συχνότητα 100 τοις εκατό σε μονοκύτταρα, κύτταρα ΝΚ και Τ κύτταρα και συχνότητα 90 τοις εκατό στα ουδετερόφιλα και 80 τοις εκατό στα Β κύτταρα.

Όσον αφορά τη σχετική έκφραση RNA, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες συχνότητες, τα κανάλια TRP αποκάλυψαν ένα πιο ειδικό μοτίβο έκφρασης για τον τύπο κυττάρου, όπως φαίνεται από τη σύγκριση των αντίστοιχων τιμών Δct στους διαφορετικούς τύπους κυττάρων που αναλύθηκαν (Εικόνα 1Β). Για παράδειγμα, το TRPP3 ανιχνεύθηκε με συχνότητα 100 τοις εκατό σε όλους τους κυτταρικούς τύπους, αλλά αποκάλυψε το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης στα μονοκύτταρα.

Αντίθετα, το κανάλι TRPV2 ανιχνεύθηκε σε όλους τους τύπους κυττάρων που ερευνήθηκαν, με συγκριτικά υψηλό επίπεδο έκφρασης RNA καθώς και υψηλή συχνότητα. Ομοίως, τα επίπεδα μεταγραφής του TRPV1 ήταν παρόμοια σε όλους τους τύπους κυττάρων που εξετάστηκαν (Εικόνα 1Β).

2.2. Επιφανειακή έκφραση TRPV1 σε ουδετερόφιλα

Η τρέχουσα γνώση σχετικά με τη λειτουργία του TRPV1 στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα είναι ακόμη ασαφής. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τους ρόλους του TRPV1 στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, στη συνέχεια ερευνήσαμε εάν το κανάλι TRPV1 εκφράζεται στην επιφάνεια των πρωτογενών ανθρώπινων ουδετερόφιλων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής ζωντανών κυττάρων (Εικόνα 2).

Τα απομονωμένα ουδετερόφιλα χρωματίστηκαν για CD15 ως επιφανειακός δείκτης για ουδετερόφιλα (Εικόνα 2Α, Β) και ταυτόχρονα είτε χρωματίστηκαν με ένα αντίσωμα που αναπτύχθηκε ενάντια σε έναν επίτοπο στον πρώτο εξωκυτταρικό βρόχο της πρωτεΐνης TRPV1 (Σχήμα 2Β) είτε με τον αντίστοιχο ισότυπο μάρτυρα. Το τελευταίο χρησιμεύει ως υποκατάστατο για τη μέτρηση της μη ειδικής δέσμευσης (Εικόνα 2Α). Εντός του πληθυσμού CD15 plus, αναλύθηκε η ένταση φθορισμού για FITC. Η χρώση των ουδετερόφιλων με το αντίσωμα TRPV1 οδήγησε σε ένα διακριτό σήμα φθορισμού σε σύγκριση με τον έλεγχο ισοτύπου, επιβεβαιώνοντας έτσι την επιφανειακή έκφραση του TRPV1 σε πρωτογενή ανθρώπινα ουδετερόφιλα (Εικόνα 2C). Η ανάλυση ουδετερόφιλων από τέσσερις μεμονωμένους δότες αποκάλυψε μια συγκρίσιμη επιφανειακή έκφραση του TRPV1 (Εικόνα 2D).

2.3. [6] Αύξηση που προκαλείται από τη τζιντζερόλη στο ενδοκυτταρικό Ca2 plus

Εφόσον η επαγόμενη από συνδέτη ενεργοποίηση του TRPV1 θα έχει ως αποτέλεσμα εισροή Ca2 συν, [23] οι ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca2 συν ουδετερόφιλων προσδιορίστηκαν μέσω της ευαίσθητης σε Ca2 συν χρωστικής Fura-2. Με βάση τα προηγούμενα ευρήματά μας[9], επιλέχθηκε συγκέντρωση 50 nM του γνωστού συνδέτη TRPV1 [6]-τζινγκερόλης και χρόνος επώασης 2 ωρών. Οι αναλύσεις έδειξαν ότι η επώαση ουδετερόφιλων με 50 nM [6]-gingerol είχε ως αποτέλεσμα αυξημένες ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca2 συν που ήταν κατά μέσο όρο 18,4 τοις εκατό ± 1,0 τοις εκατό της μέγιστης τιμής, όπως προσδιορίστηκε με την εφαρμογή 1 μΜ ιονοφόρου ιονομυκίνης. Η αύξηση που προκλήθηκε από το DMSO ήταν 4,7 τοις εκατό ± 1,2 τοις εκατό (Εικόνα 3).

2.4. Επίδραση της [6]-Gingerol στην έκφραση TRPV1

Στη συνέχεια, στοχεύσαμε στην ανάλυση του αντίκτυπου της διέγερσης του TRPV1 από την [6]-τζινγκερόλη στην έκφραση του TRPV1 σε επίπεδο μεταγραφής μέσω q-RTPCR καθώς και σε επίπεδο επιφανειακής πρωτεΐνης μέσω χρώσης ζωντανών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα επωάστηκαν με 50 nM [6]-τζιντζερόλης για 2 ώρες και τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης ποσοτικοποιήθηκαν.

Αυτή η επώαση 2 ωρών δεν επηρέασε ούτε τα επίπεδα μεταγραφής TRPV1 ούτε τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικόνα 4) και επίσης δεν άλλαξε, εκτός από τα IL6, IL17A, IL24, C5 και GDF5, που διερευνήθηκε η έκφραση RNA των κοινών γονιδίων κυτοκίνης και χημειοκίνης (Εικόνα S1, Πίνακας S2, Υποστηρικτικές Πληροφορίες).

2.5. Επίδραση της [6]-Gingerol στην Έκφραση των δεικτών της επιφάνειας των ουδετερόφιλων

Σε αυτό το σύνολο πειραμάτων, ρωτήσαμε εάν η [6]-τζινγκερόλη έχει αντίκτυπο στην έκφραση κοινών επιφανειακών δεικτών για ουδετερόφιλα. Βρήκαμε ότι η έκφραση των δεικτών CD11b και CD66b αυξήθηκε μετά την περίοδο επώασης 2 ωρών με [6]-τζιντζερόλη σε σύγκριση με τον έλεγχο διαλύτη, ενώ το CD62L δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 5). Επιπλέον, η επιφανειακή έκφραση του υποδοχέα fMLF FPR1 ήταν σημαντικά αυξημένη μετά την επεξεργασία των κυττάρων με 50 ηΜ [6]-τζινγκερόλη σε σύγκριση με τον έλεγχο διαλύτη.

For more information:1950477648nn@gmail.com